生物工程專業(yè)論文

1、編號(hào)：2012002 河南大學(xué)2012屆本科畢業(yè)論文 蠟樣芽孢桿菌突變體關(guān)于分泌淀粉酶的研究論文作者姓名： 作 者 學(xué) 號(hào)： 所 在 學(xué) 院： 生命科學(xué)學(xué)院 所 學(xué) 專 業(yè)： 生物工程 導(dǎo)師姓名職稱： 論文完成時(shí)間： 2012年5月11日 2012年5月11日蠟樣芽孢桿菌突變體關(guān)于分泌淀粉酶的研究 摘 要：實(shí)驗(yàn)通過(guò)盧戈氏碘液染色法和觀察透明圈的方法，以蠟樣芽孢桿菌0-9菌株為對(duì)照，對(duì)0-9菌株通過(guò)轉(zhuǎn)座形成的突變體產(chǎn)生胞外淀粉酶能力的差異進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在固體淀粉培養(yǎng)基、30、24h培養(yǎng)的條件下，突變體36、38號(hào)菌產(chǎn)生淀粉酶的能力遠(yuǎn)大于對(duì)照組，突變體56、94號(hào)菌產(chǎn)生淀粉酶的能力遠(yuǎn)小于

2、對(duì)照組。這些突變體可進(jìn)一步為探索菌體胞外淀粉酶的分泌能力和菌體在小麥中的定植能力之間的關(guān)系做好準(zhǔn)備，對(duì)小麥病蟲害的防治也具有一定的意義。 關(guān)鍵詞：盧戈氏碘液染色法 轉(zhuǎn)座 蠟樣芽胞桿菌0-91 前言1.1生物防治生物防治的概念 生物防治包括以蟲治蟲和以菌治蟲。其主要措施是保護(hù)和利用自然界害蟲的天敵、繁殖優(yōu)勢(shì)天敵、發(fā)展性激素防治蟲害等。是人類依靠科技進(jìn)步同病蟲草害做斗爭(zhēng)的重要措施之一。以菌治蟲是80年代新興的生物防治技術(shù)。它是利用昆蟲的病原微生物殺死害蟲。這類微生物包括細(xì)菌、真菌、病毒、原生物等，對(duì)人畜均無(wú)影響，使用的時(shí)候比較安全，無(wú)殘留毒性，害蟲對(duì)細(xì)菌也無(wú)法產(chǎn)生抗藥性，因此，微生物農(nóng)藥的殺蟲效果

3、在所有防治技術(shù)中名列前茅。 生物防治的意義長(zhǎng)期以來(lái)，主要通過(guò)化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治植物病害，雖然這種方法能夠較快地防治疾病，但是也引起了植物病原抗藥性、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)破壞。植物內(nèi)生細(xì)菌幾乎存在于所有健康植物體內(nèi)，與植物和諧共處，不僅能夠避免使用化學(xué)農(nóng)藥給人類健康和環(huán)境帶來(lái)的隱患，還能避免使用殺菌劑在殺死病原菌的同時(shí)殺死在環(huán)境中起重要作用的非靶微生物和使用其他生物菌肥破壞植物根際土壤的微生態(tài)平衡，因此有效生防菌的篩選在植物病害防治上有很大的應(yīng)用潛力。當(dāng)前制約生防菌利用的關(guān)鍵因素是抑菌活性不夠強(qiáng)，生防菌在自然環(huán)境中定殖能力差，形不成優(yōu)勢(shì)生態(tài)菌群來(lái)阻止病原菌的侵染。1.2 臘狀芽

4、孢在生物防治中的作用蠟樣芽孢桿菌0-9是由本實(shí)驗(yàn)室分離保存的小麥內(nèi)生細(xì)菌，該細(xì)菌對(duì)小麥紋枯病有很強(qiáng)的生物防治作用。 增強(qiáng)宿主競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的作用競(jìng)爭(zhēng)作用是內(nèi)生芽孢桿菌在寄主體內(nèi)發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一，主要通過(guò)內(nèi)生菌與病原菌相互競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)來(lái)奪取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制植物病害的發(fā)生。競(jìng)爭(zhēng)作用與施用劑量、時(shí)間、定殖能力及種群建立狀況密切相關(guān)。研究表明，芽孢桿菌進(jìn)入植物體內(nèi)的途徑和方式與病原菌基本相似1，進(jìn)入寄主體內(nèi)以后，芽孢桿菌會(huì)優(yōu)先占據(jù)病原菌的入侵點(diǎn)，與病原菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，可有效降低該病原菌及其毒素的積累。 增強(qiáng)宿主接抗性的作用拮抗作用是指內(nèi)生菌通過(guò)同化作用產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)或直接殺死病原菌。芽孢桿菌能夠

5、分泌多種抗真菌和細(xì)菌作用的拮抗物質(zhì)，它們對(duì)病原菌具有直接的抑制作用。劉建國(guó)等2研究發(fā)現(xiàn)B. cereus S1 能產(chǎn)生新型抗真菌環(huán)狀多肽APS，抑菌實(shí)驗(yàn)表明，此多肽有廣泛的抗菌譜且抑菌持久，對(duì)病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用。關(guān)于抑菌機(jī)制各國(guó)學(xué)者有不同的看法，有待深入研究。 促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)的作用感染很多內(nèi)生菌進(jìn)入植物體內(nèi)后，寄主植物都會(huì)表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生芽孢桿菌能產(chǎn)生或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生生長(zhǎng)素 (IAA)、赤霉素 (GA3)、玉米素 (ZR4) 等，這些生長(zhǎng)激素能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。唐文華等 (1992) 曾對(duì)7 株蠟樣芽孢桿菌增產(chǎn)菌的發(fā)酵液進(jìn)行了植物生長(zhǎng)激素類物質(zhì)的

6、高壓液相色譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吲哚乙酸、玉米素和赤霉素在所有菌株中普遍存在，吲哚乙酸的含量較高且穩(wěn)定，說(shuō)明增產(chǎn)菌所產(chǎn)生的植物激素是其促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要原因之一3。此外，一些菌株能合成嗜鐵素、有機(jī)酸等物質(zhì)，促進(jìn)寄主植物對(duì)氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。王東明等4篩選的蠟樣芽孢桿菌6371 能轉(zhuǎn)化有機(jī)氮磷，分泌有機(jī)酸，降解土壤中難溶性無(wú)機(jī)鹽，分泌抗菌物質(zhì)，抑制病源菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物抗逆境脅迫的能力。 幫助宿主誘導(dǎo)植物抗性的作用芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生一些物理結(jié)構(gòu)上的抗性（例如形成生物膜等形式），從而限制病原菌進(jìn)一步侵入。Benhamou等5用內(nèi)生菌B. pumilus SE34 預(yù)接種基因轉(zhuǎn)化豌豆，然

7、后接種病菌。在病菌企圖侵入部位大量沉積木質(zhì)和酚類物質(zhì)，使這些部位的細(xì)胞胞壁得到加厚，有效阻止了病菌的侵入。此外，芽孢桿菌還能誘導(dǎo)寄主植物生理生化發(fā)生變化，積累相關(guān)蛋白，合成一些代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生水解酶和氧化酶等(如幾丁質(zhì)酶、-1,3 葡聚糖酶、過(guò)氧化物酶)，從而抑制病原菌生長(zhǎng)。蠟樣芽孢桿菌便能分泌超氧化物歧化酶 (SOD)，使植物產(chǎn)生對(duì)病原菌的抗病性。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者就內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)植物的上述四種作用方式形成共識(shí)，然而相關(guān)的作用機(jī)制研究仍處于探索階段。關(guān)于內(nèi)生菌對(duì)病原菌的抑制作用、增強(qiáng)宿主植物抗逆性作用機(jī)制的研究報(bào)導(dǎo)較少，多為推論性或者是間接性的6；對(duì)于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)定植規(guī)律的研究尚處于探索階段，

8、隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光標(biāo)記技術(shù)、電鏡免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)技術(shù)和基因標(biāo)記等技術(shù)被應(yīng)用于內(nèi)生菌的定殖規(guī)律研究7-10，但由于宿主植物生活環(huán)境多樣性以及內(nèi)生菌與宿主植物關(guān)系的復(fù)雜性，加之植物內(nèi)生菌起源演化的問(wèn)題尚無(wú)定論，目前對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入植物的途徑、在植株體內(nèi)的定殖傳導(dǎo)方式、內(nèi)生細(xì)菌與寄主植物的互作用、生物學(xué)功能作用機(jī)制等不是很清楚11。只有對(duì)生防菌的抗菌機(jī)制、誘導(dǎo)抗性促生機(jī)理等深入研究，進(jìn)一步完善基礎(chǔ)理論，才能更好地開發(fā)和利用生防菌資源。1.3 產(chǎn)胞外淀粉酶的菌株對(duì)生防的作用 胞外淀粉酶的檢測(cè)方法 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱。淀粉酶能將可溶性淀粉、直鏈淀粉或者糖原分解為麥芽

9、糖、糊精、葡萄糖等物質(zhì)。淀粉與盧戈氏碘液產(chǎn)生反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，而被淀粉酶水解過(guò)生成的物質(zhì)不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)。由此可以在培養(yǎng)基中加入淀粉，然后用碘液染色，變藍(lán)的地方說(shuō)明有淀粉存在，沒(méi)有變藍(lán)的會(huì)出現(xiàn)一個(gè)透明的圈，這個(gè)范圍內(nèi)的淀粉被淀粉酶水解。故可以利用透明圈的大小來(lái)判斷菌體產(chǎn)生淀粉酶的能力差異。 產(chǎn)胞外淀粉酶的臘狀芽孢桿菌在小麥體內(nèi)的定植 小麥貯存物質(zhì)主要以淀粉的形式存在于胚乳中，在小麥發(fā)芽時(shí)，胚乳中的淀粉會(huì)被動(dòng)用，用于為萌發(fā)提供必要的營(yíng)養(yǎng)、能量等。在萌發(fā)期間小麥會(huì)產(chǎn)生大量的淀粉酶將其儲(chǔ)存的淀粉水解，以供萌發(fā)使用。臘狀芽孢桿菌為小麥根部的有益菌群，能夠有效抵御外界生物的侵害。但是這種芽孢桿菌由于營(yíng)養(yǎng)

10、和空間的限制不能很好的定植于小麥根部，故起到的防護(hù)作用不是很大?，F(xiàn)在如果能夠篩選出一種菌能夠產(chǎn)生的胞外淀粉酶較多，能很好的利用小麥體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)，較為牢固的定植于小麥體內(nèi)，那能夠較為有效的抑制小麥的病蟲害，為小麥的增產(chǎn)有很大的作用。 1.4 0-9菌株 蠟樣芽孢桿菌，革蘭陽(yáng)性桿菌，大小為0.9-1.2m×1.8-4.0m，兩端鈍園，一般從短鏈到長(zhǎng)鏈，培養(yǎng)6h后即可形成芽胞，芽胞位于菌體中央，橢圓形，不膨出。周生鞭毛。能運(yùn)動(dòng)。無(wú)莢膜。生長(zhǎng)時(shí)需氧或兼性厭氧，在普通瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)旺盛，形成較大、灰白色、表面粗糙似融蠟狀菌落，因此而得名；在復(fù)雜培養(yǎng)基中能呈厭氧生長(zhǎng)，葡萄糖和硝酸鹽可促進(jìn)厭氧生長(zhǎng)

11、；生長(zhǎng)溫度范圍為5-30，10以下停止繁殖。其繁殖體不耐熱，100經(jīng)20min可被殺死。最適生長(zhǎng)溫度為28-35，生長(zhǎng)酸堿度范圍為，生長(zhǎng)最低水分活度為0.95。發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。 蠟樣芽孢桿菌0-9菌株是1株從健康小麥植株中分離獲得的有益芽孢桿菌，為小麥內(nèi)生細(xì)菌，屬革蘭氏陽(yáng)性蠟樣芽胞桿菌，運(yùn)動(dòng)性強(qiáng)，具有產(chǎn)生葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等真菌細(xì)胞壁降解酶和鐵載體的能力。該細(xì)菌對(duì)小麥紋枯病病原菌有抑制作用，抑菌率50%70%，實(shí)驗(yàn)室條件下防治效果高達(dá)82.86 %。 利用生防菌株0-9抗利福平（Rifampicin，Rif）標(biāo)記法，得到300株抗Rif菌株。隨機(jī)選取其中9株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、革

12、蘭氏染色、芽孢染色、產(chǎn)酶能力、運(yùn)動(dòng)性、拮抗作用及耐鹽性測(cè)試等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)這些抗藥標(biāo)記菌株為0-9的衍生菌株，并保持對(duì)小麥紋枯病的防治效果。1.5 研究背景及意義芽孢桿菌對(duì)馬鈴薯瘡痂病、蘋果紅癌病、赤霉病等許多土傳病害以及地上部病害具有生防的效果。用于生防的芽孢桿菌種類有枯草芽孢桿菌(B.subtilies) 、多粘芽孢桿菌( B. polymyxa) 、蠟狀芽孢桿菌( B.acillus cereus) 、蕈狀菌變種( B.cereus varm ycoides)等。隨著枯草芽孢桿菌作為革蘭氏陽(yáng)性代表菌株基因組被測(cè)序以來(lái)，同枯草芽孢桿菌有關(guān)的研究，特別是有關(guān)生化分析、分子生物學(xué)等方面基礎(chǔ)理論研究

13、持續(xù)展開。當(dāng)今人們的環(huán)保意識(shí)在不斷的增強(qiáng)，生物農(nóng)藥正在引起越來(lái)越多的關(guān)注。芽孢桿菌殺菌劑克服了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥污染環(huán)境、危害人畜、易產(chǎn)生抗性等缺點(diǎn)，具有選擇性強(qiáng)、安全、原料簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在微生物殺菌劑市場(chǎng)中初露頭角。很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株已經(jīng)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。在生防應(yīng)用中，讓菌體能很好定植是一個(gè)很重要的問(wèn)題。但是菌體由于營(yíng)養(yǎng)的限制總是不能再植物體內(nèi)形成優(yōu)勢(shì)菌株，不能對(duì)植物形成有效的保護(hù)傘。那么我們的迫切要求改良菌種的遺傳物質(zhì)，使其能夠很好的利用植物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)生存。碳源是限制菌種生存的主要原因，如能夠?qū)?-9菌株遺傳物質(zhì)改良為能夠很好利用小麥淀粉的菌，那么會(huì)對(duì)小麥生物防治病蟲害有良好的效果。2

14、材料與方法2.1 供試材料2.2.1 供試菌株菌種0-9。由河南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室從健康小麥體內(nèi)分離得到，0-9為蠟樣芽孢桿菌。菌株保存于-70 超低溫冰箱。2.1.2 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0g，酵母提取物 5g，NaCl10.0 g，蒸餾水1000mL，PH7.0。一部分加入2%（w/w）瓊脂用來(lái)制備固體LB培養(yǎng)基，另一部分制備液體LB培養(yǎng)基。滅菌條件：121 、0.11Mpa滅菌20min。淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉 5.0g,加熱至淀粉溶解，蛋白胨 10.0g,牛肉膏 3.0g,定容至1000 mL，PH7.0，加入2%（w/w）瓊脂制備固體淀粉培養(yǎng)基。滅菌條件：121 、0.11Mpa

15、滅菌20min。2.1.3 所用試劑 （1） 盧戈氏碘液 碘化鉀 0.4g 碘片0.2g 蒸餾水 60mL（2） 紅霉素 （3） 卡那霉素2.1.3實(shí)驗(yàn)器材小試管 EP管 水浴箱 平皿 槍頭 搖床 滴管 牙簽 涂布棒 接種環(huán) 2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 菌株活化 配制LB液體培養(yǎng)基，滅菌三角瓶，200 mL LB液體培養(yǎng)基中接入取-70冰箱中保存的0-9 20L，放入搖床，30 200rpm下培養(yǎng)24h。2.2.2菌株轉(zhuǎn)座 配制LB固體培養(yǎng)基，倒平板。用無(wú)菌水稀釋菌懸液至10-5、10-6濃度。吸取2 mL 10-6濃度的菌懸液涂布到平板上，一定要涂布均勻。將培養(yǎng)箱升溫至46，將倒好的平板放入

16、培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)座10小時(shí)。 2.2.3菌種轉(zhuǎn)接 配制LB固體培養(yǎng)基，100 mL培養(yǎng)基中加入卡那霉素50L，另外100 mL培養(yǎng)基中加入紅霉素20L，分別搖勻，倒平板，分別標(biāo)明Erm1-5、Kan1-5。用滅菌好的牙簽挑取單菌落，先在紅霉素的平板上接種，然后在卡那霉素的平板上的相應(yīng)位置接種。將接種好的平板放入30的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。將培養(yǎng)好的菌放入超凈臺(tái)，挑取在加紅霉素板上長(zhǎng)而在加卡那霉素板上沒(méi)有長(zhǎng)的菌落，接種到新的板上。同樣是先點(diǎn)種紅霉素板，再點(diǎn)種卡那霉素板，放入30的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。 2.2.4菌種保存 配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到大試管中，每個(gè)試管5mL。用滅好菌的槍頭挑取在加卡那霉素

17、板上長(zhǎng)而在加紅霉素的板上不長(zhǎng)的菌株，接種到試管中，放入搖床，30 200rpm下培養(yǎng)24h。EP管中加700L 50%的甘油，再吸取700L菌懸液加到管中，搖勻。編號(hào)，保存至-70冰箱。2.2.5菌種活化配制LB液體培養(yǎng)基，滅過(guò)小試管，每個(gè)瓶中加入2 mL LB液體培養(yǎng)基，接入20L保藏的菌株，放入搖床，30 200rpm下培養(yǎng)24h。2.2.6菌懸液的濃度的調(diào)節(jié)配制LB液體培養(yǎng)基，滅過(guò)三角瓶，每個(gè)瓶中加入100 mL LB液體培養(yǎng)基，接入1mL已活化的菌懸液，放入搖床，30 200rpm下培養(yǎng)24h。 首先測(cè)量每個(gè)菌的OD值，用滅過(guò)菌的LB培養(yǎng)基稀釋調(diào)節(jié)至各個(gè)菌的OD值至相同。配制淀粉固體培

18、養(yǎng)基，倒平板。2.2.7菌株的初篩配制淀粉固體培養(yǎng)基，倒平板。用槍頭吸取2L已調(diào)好相同濃度的菌懸液點(diǎn)種到平板上，一個(gè)平板點(diǎn)種7個(gè)菌，每個(gè)菌重復(fù)三次，將點(diǎn)種好的平板放入30的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的平板中滴加盧戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 2.2.8菌株的復(fù)篩為保證目標(biāo)菌株的培養(yǎng)條件相同，將疑似菌株點(diǎn)種到同一個(gè)平板上，將點(diǎn)種好的平板放入30的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的平板中滴加盧戈氏碘液，染色。并量取不同菌落的透明圈的大小。 3結(jié)果現(xiàn)象與分析3.1菌落染色結(jié)果轉(zhuǎn)座得到100個(gè)突變體，編號(hào)從1至100。0-9、 1-100號(hào)菌株培養(yǎng)24h后，對(duì)其進(jìn)行碘液染色。結(jié)果顯示，0-

19、9和36、38、56、94號(hào)菌的透明圈出現(xiàn)較大差異（表1圖：1 ）。菌株0-9在培養(yǎng)24h后形成的透明圈直徑大小為14.5mm，菌株36、38、56、94形成的透明圈直徑大小分別為20.7mm、19.2mm、9.0mm、9.6mm。表1 0-9菌株與目標(biāo)菌株透明圈直徑菌號(hào)透明圈直徑大小（mm）現(xiàn)象重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3平均值0-913.315.614.614.5透明圈直徑大小適中3621.120.920.320.7透明圈直徑比對(duì)照菌大的多3818.617.320.719.2透明圈直徑比對(duì)照菌大的多568.211.47.39.0透明圈直徑比對(duì)照菌小的多949.28.710.99.6透明圈直徑比對(duì)照菌

20、小的多透明圈直徑（mm）圖1 36、38、56、94與0-9菌株透明圈直徑3.2結(jié)果分析 胞外淀粉酶產(chǎn)生臘狀芽孢桿菌0-9是從一株健康小麥植株中分離獲得的有益芽孢桿菌，為小麥內(nèi)生細(xì)菌，產(chǎn)生的胞外淀粉酶能夠?qū)⑿←滙w內(nèi)的淀粉分解為菌體能更好利用的物質(zhì)（如：麥芽糖）。調(diào)控0-9菌分泌胞外淀粉酶的基因位于菌體的結(jié)構(gòu)基因中。從實(shí)驗(yàn)的36、38號(hào)菌來(lái)看，它們的透明圈直徑都遠(yuǎn)大于對(duì)照組0-9號(hào)菌株的透明圈直徑。調(diào)控分泌胞外淀粉酶的基因遭到破壞之后可能導(dǎo)致產(chǎn)生的淀粉酶的量更大，但從56、94號(hào)菌來(lái)看，它們透明圈的直徑又小與對(duì)照組0-9的透明圈直徑。這說(shuō)明基因被插入的位置不同也可能導(dǎo)致胞外淀粉酶的合成能力或者是

21、分泌能力下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)生的淀粉酶的量較對(duì)照組小。因此，在細(xì)菌分泌胞外淀粉酶的量和多個(gè)因素有關(guān)。最主要的是芽孢桿菌內(nèi)部的基因調(diào)控。淀粉酶基因本身的表達(dá)能力受到多個(gè)基因的調(diào)控，基因內(nèi)部的調(diào)控基因、啟動(dòng)子受到破壞或者是被外源基因插入后都會(huì)導(dǎo)致淀粉酶產(chǎn)生的多少受到影響。芽孢桿菌膜系統(tǒng)的分泌能力和淀粉酶的運(yùn)輸能力都與最終檢測(cè)到的透明圈直徑的大小有關(guān)。3.2.2 原因分析36、38、56、94號(hào)菌株由0-9轉(zhuǎn)座而來(lái)，36、38號(hào)菌產(chǎn)生的胞外淀粉酶的量遠(yuǎn)大于對(duì)照組的產(chǎn)生量，56、94號(hào)菌產(chǎn)生的胞外淀粉酶的量遠(yuǎn)小于對(duì)照組的產(chǎn)生量可能的原因如下：（1）36、38號(hào)菌由于轉(zhuǎn)座的基因強(qiáng)化了淀粉酶基因的啟動(dòng)子，使淀

22、粉酶的轉(zhuǎn)錄與翻譯量增加。轉(zhuǎn)座的基因插入到控制芽孢桿菌膜系統(tǒng)合成的基因中，導(dǎo)致芽孢桿菌合成的膜為不完整或者是通透性比較大的膜，從而導(dǎo)致分泌的淀粉酶量較多。轉(zhuǎn)座的基因插入到編碼運(yùn)輸?shù)矸勖傅侥ね廨d體的基因中，導(dǎo)致載體的量增加或者運(yùn)輸能力增強(qiáng)，從而使胞外淀粉酶的量增加。（2）56、94號(hào)菌由于轉(zhuǎn)座的基因若化了淀粉酶基因的啟動(dòng)子，使淀粉酶的轉(zhuǎn)錄與翻譯量減小。轉(zhuǎn)座的基因插入到控制芽孢桿菌膜系統(tǒng)合成的基因中，導(dǎo)致芽孢桿菌合成的膜通透性更小，從而導(dǎo)致分泌的淀粉酶量較少。轉(zhuǎn)座的基因插入到編碼運(yùn)輸?shù)矸勖傅侥ね廨d體的基因中，導(dǎo)致載體的量減小或者運(yùn)輸能力減弱，從而使胞外淀粉酶的量降低。 （3）操作方面：由于各個(gè)菌株數(shù)

23、目較多，不是同一批活化并測(cè)量，由于個(gè)人或者天氣的原因，導(dǎo)致菌生長(zhǎng)不是在恒定的條件下進(jìn)行，從而導(dǎo)致菌的胞外淀粉酶的產(chǎn)生能力有差異。 3.2.3重復(fù)不一致的原因分析 每個(gè)菌株的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均有所差異，分析原因，可能有：（1）由于菌懸液的差異會(huì)導(dǎo)致不一致。因?yàn)闃岊^的原因會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)種時(shí)量不一定完全相同，OD值雖然相同，但是菌懸液的濃度還是會(huì)有一定的差異，從而導(dǎo)致接種的菌量有差異。（2）平板培養(yǎng)時(shí)使用的平板不同，透氣性能可能有所不同，影響到菌體生長(zhǎng)。（3）平板中的培養(yǎng)基的厚度不同，導(dǎo)致重復(fù)的結(jié)果有差異。（4）由于個(gè)人原因量取透明圈的大小時(shí)有差異。4討論4.1菌種活化與三角瓶培養(yǎng)的作用 菌株在冷凍保藏

24、條件下處于休眠狀態(tài)，接種前需進(jìn)行活化培養(yǎng)，使其恢復(fù)最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，生理狀態(tài)水平達(dá)到穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)要求每個(gè)菌株在點(diǎn)種到平板培養(yǎng)之前，各個(gè)的菌體數(shù)量、生理狀態(tài)水平一致，因此在試管培養(yǎng)活化菌株后，需要在試管中培養(yǎng)一定的時(shí)間。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，需通過(guò)測(cè)OD值等方法使菌液濃度盡量達(dá)到一致。4.2透明圈大小和外界各方面因素的關(guān)系（1）接種量：接種量大小對(duì)菌株生長(zhǎng)及淀粉酶分泌有一定影響, 接種量大會(huì)導(dǎo)致菌體的生長(zhǎng)旺盛，生長(zhǎng)產(chǎn)生的菌落較大，從而影響到淀粉酶透明圈的大小。（2）培養(yǎng)基濃度：培養(yǎng)基的濃度較小時(shí)，會(huì)導(dǎo)致淀粉酶在菌落周圍擴(kuò)散較快，從而產(chǎn)生的透明圈較大，否則將會(huì)透明圈直徑較小。（3）培養(yǎng)基組成對(duì)胞外淀

25、粉酶分泌的影響：在培養(yǎng)基成分中, PH值、溫度、離子強(qiáng)度等因素影響菌體膜的流動(dòng)性及通透性，從而影響淀粉酶的分泌量。培養(yǎng)基中Mg+培養(yǎng)的濃度會(huì)影響到運(yùn)輸?shù)矸勖傅姆置诘乃俣龋M(jìn)而影響透明圈的大小。4.3 實(shí)驗(yàn)缺陷及改進(jìn) （1）只從碘液染色發(fā)來(lái)度量菌體產(chǎn)生胞外淀粉酶的能力的方法有缺陷，因?yàn)橥该魅Φ拇笮∨c很多因素有關(guān)，復(fù)篩應(yīng)該用3,5-二硝基水楊酸顯色法12的方法來(lái)再次驗(yàn)證。 （2）最后淀粉酶的量的多少不能簡(jiǎn)單的通過(guò)透明圈的直徑大小本相對(duì)證明菌產(chǎn)生淀粉酶的能力大小，而應(yīng)該通過(guò)將其產(chǎn)生的淀粉酶提取，測(cè)其酶活力，這樣會(huì)更有說(shuō)服力。 （3）本實(shí)驗(yàn)只研究了不同菌體突變體產(chǎn)生淀粉酶的能力差異，還應(yīng)該考慮到同一菌

26、株不同的培養(yǎng)條件（如：通氣量、溫度、PH、離子強(qiáng)度等）對(duì)其產(chǎn)生淀粉酶量的影響。4.4 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（1） 轉(zhuǎn)座時(shí)需要預(yù)先將培養(yǎng)箱升溫至46，否則將會(huì)影響到轉(zhuǎn)座的效果。（2） 菌株保存時(shí)一定要搖勻，否則影響保存效果。（3） 轉(zhuǎn)座涂布時(shí)一定到涂布均勻，培養(yǎng)基厚度應(yīng)該較薄，否則將會(huì)出現(xiàn)的單菌落較少。（4） 倒固體LB培養(yǎng)基時(shí)要避免平板上出現(xiàn)氣泡，否則將會(huì)影響到點(diǎn)種的觀察。（5） 點(diǎn)種菌時(shí)要注意位置一定要對(duì)應(yīng)好。（6） 一定要先點(diǎn)種紅霉素平板再點(diǎn)種卡那霉素平板，否則將會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性菌株。4.5 實(shí)驗(yàn)展望將分離到的四種菌分別侵染到小麥體內(nèi)，對(duì)小麥的敵抗病蟲害能力進(jìn)行測(cè)定，胞外淀粉酶的分泌能力與生防的作用還

27、有待確定，因此應(yīng)開展生防實(shí)驗(yàn)13，探求植物量與所需淀粉酶的關(guān)系，病蟲害的類型與淀粉酶分泌多少的相關(guān)關(guān)系。參考文獻(xiàn)1 張炳欣, 張平, 陳曉斌, 等. 影響引入微生物根部定殖的因素 J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2001, 11 (6): 951953.2 劉建國(guó), 裴炎, 叢威, 等. 蠟狀芽孢桿菌S1 發(fā)酵條件的研究 J.工業(yè)微生物, 2001, 31 (1): 47.3 焦文沁. 蠟樣芽孢桿菌A-47 增效因子的篩選及增效機(jī)制初探 D.北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.4 王東明. 蠟樣芽孢桿菌6371 的多效性及發(fā)酵條件的研究 D. 南京: 南京師范大學(xué), 2004.5 Benhamou N, K

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