專題-序列分析和引物設(shè)計(jì)

1、序列分析及引物設(shè)計(jì)專題序列分析及引物設(shè)計(jì)專題 郭志富郭志富2012年年11月月21日日測(cè)序序列測(cè)序序列如何確定是否為目的序列？如何去除載體序列？如何轉(zhuǎn)換成有義鏈？如何找到序列起始和終止位置？一、序列分析部分一、序列分析部分第一步：第一步：BLASTBLAST輸入測(cè)序序列輸入測(cè)序序列選擇物種選擇比對(duì)類型去除去除序列中此數(shù)字之前的序列，序列中此數(shù)字之前的序列，一般前一般前50-80bp要么是載體序列，要么是載體序列，要么是測(cè)序不準(zhǔn)確的端部要么是測(cè)序不準(zhǔn)確的端部一般序列較短時(shí)，開始比出來一般序列較短時(shí)，開始比出來的有可能是載體序列，此時(shí)需的有可能是載體序列，此時(shí)需在測(cè)序序列中去掉比對(duì)數(shù)字之在測(cè)序序列

2、中去掉比對(duì)數(shù)字之后的序列，也就是去除和載體后的序列，也就是去除和載體序列一致的序列。把目的序列序列一致的序列。把目的序列重新輸入進(jìn)行比對(duì)。重新輸入進(jìn)行比對(duì)。去除序列中此數(shù)字之后的序列，一般為載體序列根據(jù)目標(biāo)序列的方向判定檢測(cè)序列是否為有義鏈：根據(jù)目標(biāo)序列的方向判定檢測(cè)序列是否為有義鏈：如果檢測(cè)序列（Query）順序與目標(biāo)序列（Sbjct）順序相反（上邊的序列從左到右是遞增，下邊的目標(biāo)序列是遞減），則檢測(cè)序列需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)。如順序相同則可能為有義鏈，再根據(jù)氨基酸翻譯情況具體確定。第二步：序列整理與分析第二步：序列整理與分析-DNAman軟件的應(yīng)用軟件的應(yīng)用點(diǎn)擊粘貼待分析序列輸入”O(jiān)RIGIN”選擇

3、序列后點(diǎn)擊載入序列的不同顯示類型（互補(bǔ)、反向、反向互補(bǔ)等）去除此部分后保存，即得到反轉(zhuǎn)后的有義鏈翻譯為氨基酸序列有義鏈翻譯后，三個(gè)可能的讀碼框中有義鏈翻譯后，三個(gè)可能的讀碼框中其中有一個(gè)為連續(xù)的氨基酸序列，即其中有一個(gè)為連續(xù)的氨基酸序列，即不總出現(xiàn)終止密碼子（不總出現(xiàn)終止密碼子（*）。這條氨基）。這條氨基酸序列可保存后進(jìn)行序列分析。酸序列可保存后進(jìn)行序列分析。如是全長(zhǎng)編碼區(qū)，需要找到起始密碼如是全長(zhǎng)編碼區(qū)，需要找到起始密碼子子ATG(M)，和終止密碼子，和終止密碼子TAGTGATAA（*）此圖對(duì)于設(shè)計(jì)體外表達(dá)引物或此圖對(duì)于設(shè)計(jì)體外表達(dá)引物或轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建引物十分重要。轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建引物十分重要

4、。原則為：設(shè)計(jì)引物添加酶切位原則為：設(shè)計(jì)引物添加酶切位點(diǎn)必須是目的基因中沒有的酶點(diǎn)必須是目的基因中沒有的酶切位點(diǎn)。切位點(diǎn)。多序列比對(duì)多序列比對(duì)應(yīng)用：簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)差異位點(diǎn)分析（SNP或氨基酸差異等）進(jìn)化樹的構(gòu)建保守區(qū)保守區(qū)DNAMAN1形式形式DNAMAN2形式形式GCG形式形式GDE形式形式選擇某區(qū)段 57Ux 57Ax1 57Ax2 52Bx7 57Cx 60Dx5 57Kx 57RxConsensusMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASGQLQCERELQE.RELKACQQVMDQQLRDISPKMTKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCERELQE.

5、HSLKACRQVVDQQLRDVSPEMTKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCERELQE.HSLKACRQVVDQQLRDVSPEMAKRLVLFAAVVVALVALTAAEGEASGQLQCEHELEA.CQQVVDQQLRDVSPGMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASGQLQCERELQE.RELKACQQVMDQQLRDISPKMAKRLVLFVAVVVALVALTVAEGEASEQLQCERELQELQERELKACQQVMDQQLRDISPEMAKRLVLFAAVVVALVALTIAEGEASGQLQCERELQE.RSLKACRQVMDQQ

6、LRDVSPEMAKRLVLFAAVVVALVALTVAEGEASGQLHCERELQE.RELEACRQIVDQQLRDTSPGmMMMMMMMMAAAAAAkKKKKKKKKrRRRRRRRRlLLLLLLLLvVVVVVVVVlLLLLLLLLfFFFFFFFFAAAAAaAAAAAAAAvVVVVVVVVvVVVVVVVVvVVVVVVVVaAAAAAAAAlLLLLLLLLvVVVVVVVVaAAAAAAAAlLLLLLLLLtTTTTTTTTVVVIVaAAAAAAAAeEEEEEEEEgGGGGGGGGeEEEEEEEEaAAAAAAAAsSSSSSSSSGGGGGEGGqQQQ

7、QQQQQlLLLLLLLLQQQQQQQHcCCCCCCCCeEEEEEEEERRRHRRRReEEEEEEEElLLLLLLLLQQQEQQQQEEEEEEERHHRRRREEEELLLLLLLKKKKKKAAAAAAAcCCCCCCCCQQQQqQQQQQQQQVVVVVVVIMVVVMMMVdDDDDDDDDqQQQQQQQQqQQQQQQQQlLLLLLLLLrRRRRRRRRdDDDDDDDDIVVVIIVsSSSSSSSSpPPPPPPPPEEGEEG 117Ux 117Ax1 117Ax2 112Bx7 117Cx 120Dx5 117Kx 117RxConsensusCHPV

8、VVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSIFWGIPALLKRYYPSVTSPQCQPVGGGPVARQYEQQVVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSILWGIPALLRRYYLSVTSPQCQPVGGGPVARQYEQQVVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSILWGIPALLRRYYLSVTSPQCRPITVSPGTRQYEQQPVVPSKAGSFYPSETTPSQQLQQMIFWGIPALLRRYYPSVTSSQCHPVVVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQSIFWGIPALLKRYYPSVTSPQCHPV

9、VVSPVAGQYEQQIVVPPKGGSFYPGETTPPQQLQQRIFWGIPALLKRYYPSVTCPQCHPVVISPIARQYEQQIVVPPKGGSLYPGETTPPQQLQQSIFWGIPTLLRRYYPSVTSSQCRPVAVSPGTGQHEQQTVVPLKGGSFYPDETSPPQQLEQRILWGIPTLLKRYYPSVTSPHcCCCCCCCCHQQRHHHRpPPPPPPPPVVVIVVVVVVVVVVVVIVSGGSSSSSpPPPPPPPPVVVVVIAAAAAAGGGGqQQQQQQQQYYYYYYYeEEEEEEEEqQQQQQQQQqQQQQQQQQIVVI

10、IIvVVVVVVVVvVVVVVVVVpPPPPPPPPPPPPPPkKKKKKKKKGGGAGGGGgGGGGGGGGsSSSSSSSSFFFFFFLFyYYYYYYYYpPPPPPPPPGGGSGGGDeEEEEEEEEtTTTTTTTTTTTTTTTpPPPPPPPPPPPPPPPqQQQQQQQQqQQQQQQQQlLLLLLLLLQQQQQQQEqQQQQQQQQSSSSSiIIIIIIIIFLLFFFFLwWWWWWWWWgGGGGGGGGiIIIIIIIIpPPPPPPPPAAAAAAlLLLLLLLLlLLLLLLLLKRRRKKRKrRRRRRRRRyYYYYYYYYyYY

11、YYYYYYPPPPPPsSSSSSSSSvVVVVVVVVtTTTTTTTTSSSSSSSPPPPPPQQQQQQQH 162Ux 171Ax1 165Ax2 145Bx7 162Cx 159Dx5 141Kx 159RxConsensusQVSYYPGQASPQWSGQGQQPGQGQQSVQGQQGYYSTSPQQ.PGQWQ.QVSYYPGQASSQRPGQGQQPGQGQ.QEYYLTSPQQSGQWQQPGQGQAGYYPTSPQQVSYYPGQASSQRPGQGQQ.EYYLTSPQQSGQWQQPGQGQSGYYPTSPQQGSYYPGQASPQQSGQGQQPGQ.EQQ.P

12、GQGQQD.QQVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQQSVQEQQGYYSTSPQQ.PGQWQ.QVSYYPGQASPQRPGQGQQPGQGQ.QGYYPTSPQQ.PGQWQ.QASYYPGQASPQRPGQGQQ.PGQGQ.QGSYYLGQTSLRQPGQAQQPGQGQQPG.QAQQPGQGQQ.PGQRQ.qQQQQQQQQVVVVVsSSSSSSSSyYYYYYYYYyYYYYYYYYPPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQAAAAAAAsSSSSSSSSPPPPPQQQQQQQWRRRRRPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQGGGGGGGA

13、qQQQQQQQQqQQQQQQQQPPPPPPGGGGGGQQQQQQGGGGGQQQQQQQQQQYYYYYYYYYYTTTTTSSSSSPPPPPQQQQQQQQQQQQQQpPPPPPPPPgGGGGGGGGqQQQQQQQQGGGGqQQQQQQQQ 183Ux 192Ax1 186Ax2 166Bx7 183Cx 180Dx5 159Kx 180RxConsensusQPEQGQPEYYPTSLQQPGQLQQSGQEQPGYYPTSPWQPEQLQQSGQKQPGYYPTSPWQPEQLQQPGQRQQGYYPTSPQQPGQGQQPEQGQPGYYPTSLQQPGQLQQPEQ

14、GQQGYYPTSPQQPGQLQQPGPEQQGYYPISPQQPE.QPEKGQQGYYPTTPQQPGQVQqQQQQQQQQPPPPPPEGGGEEGEQQQQQQGEGGEGqQQQQQQQQPPPPEGGGGGGGyYYYYYYYYyYYYYYYYYpPPPPPPPPTTTTTTTSSSSSSSPPPPPPQQQQQQqQQQQQQQQpPPPPPPPPGEEGGGEGQQQQQQQLLLLLVQQQQQQQ 引物設(shè)計(jì)專題引物設(shè)計(jì)專題分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 郭志富郭志富 2011年年11月月8日日簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)：基于保守區(qū)

15、設(shè)計(jì)，用于保守區(qū)片段（或中間：基于保守區(qū)設(shè)計(jì)，用于保守區(qū)片段（或中間片段）獲得片段）獲得定量引物設(shè)計(jì)定量引物設(shè)計(jì)：用于半定量和實(shí)時(shí)熒光定量：用于半定量和實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)標(biāo)記引物設(shè)計(jì)：基于特異區(qū)設(shè)計(jì)，用于標(biāo)記特異基因或特異：基于特異區(qū)設(shè)計(jì)，用于標(biāo)記特異基因或特異物種材料。物種材料。表達(dá)引物設(shè)計(jì)表達(dá)引物設(shè)計(jì)：用于原核體外表達(dá)、真核表達(dá)（轉(zhuǎn)基因）：用于原核體外表達(dá)、真核表達(dá)（轉(zhuǎn)基因）SNP引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)：用于單核苷酸突變鑒定：用于單核苷酸突變鑒定RACE及染色體步移引物設(shè)計(jì)及染色體步移引物設(shè)計(jì)：基于已知序列，用于獲取未：基于已知序列，用于獲取未知序列區(qū)段知序列區(qū)段甲基化引物設(shè)計(jì)甲基化

16、引物設(shè)計(jì)：用于檢測(cè)基因甲基化情況：用于檢測(cè)基因甲基化情況。 。引物設(shè)計(jì)分類引物設(shè)計(jì)分類. .的常規(guī)應(yīng)用的常規(guī)應(yīng)用結(jié)合結(jié)合激活軟件？獲取激活碼“Ctrl+V”輸入序列輸入序列也可以把上下游引物分別設(shè)在序列的某一特定位置界定產(chǎn)物長(zhǎng)度界定引物長(zhǎng)度在55-65之間調(diào)整簡(jiǎn)并性引物的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物的設(shè)計(jì)1.基于保守性的簡(jiǎn)并位置基于保守性的簡(jiǎn)并位置選擇（選擇（3端盡量不設(shè)置簡(jiǎn)端盡量不設(shè)置簡(jiǎn)并并）2.用用Primer 5.0檢測(cè)大致的檢測(cè)大致的評(píng)分（評(píng)分（主要看主要看Tm值和發(fā)夾值和發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體情況結(jié)構(gòu)和引物二聚體情況）復(fù)制復(fù)制同源克隆同源克隆-基于不同物種（基于不同物種（范范圍較廣圍較廣）相應(yīng)序列保

17、守區(qū)的引）相應(yīng)序列保守區(qū)的引物設(shè)計(jì)物設(shè)計(jì)-通過已知序列信息釣通過已知序列信息釣取未知的同源基因取未知的同源基因“Ctrl+V”輸入引物序列輸入引物序列上游引物上游引物下游引物下游引物簡(jiǎn)并引物的確定（簡(jiǎn)并引物的確定（上游上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3如確定該位置為如確定該位置為下游引物下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5表達(dá)引物的設(shè)計(jì)表達(dá)引物的設(shè)計(jì)ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATG

18、CAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC起始起始信號(hào)肽編碼區(qū)N端編碼區(qū)終止ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA上游引物的設(shè)計(jì)上游引物的設(shè)計(jì)添加ATG起始密碼子5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3添加酶切位點(diǎn)1. 編碼區(qū)內(nèi)不含該位點(diǎn)2. 5端添加保護(hù)堿基2-3個(gè)（網(wǎng)上有規(guī)律表）3. 不能造成下游的移碼去除信號(hào)肽去除信號(hào)肽編碼區(qū)部分編碼區(qū)部分1.1.位置必須選擇位置必須選擇含終

19、止密碼子含終止密碼子子位置或子位置或終止終止密碼子之后密碼子之后不遠(yuǎn)的一部分序列，不遠(yuǎn)的一部分序列，2.2.記得要是有義鏈的反向互補(bǔ)鏈，記得要是有義鏈的反向互補(bǔ)鏈，3.3.同樣加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基同樣加酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基下游下游引物引物的設(shè)的設(shè)計(jì)計(jì)定量引物的設(shè)計(jì)定量引物的設(shè)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度：擴(kuò)增長(zhǎng)度：100-300 bp范圍即可范圍即可以以mRNA為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等的出現(xiàn)盡量避免引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等的出現(xiàn)引物設(shè)計(jì)避免引物設(shè)計(jì)避免DNA污染可能帶來的干擾，最好跨外顯子接頭區(qū)污染可能帶來的干擾，最好跨外顯子接頭區(qū)Tm值在值在58-62度度 內(nèi)參引物設(shè)計(jì)：選取持家

20、基因，如內(nèi)參引物設(shè)計(jì)：選取持家基因，如18SRNA、actin等等 長(zhǎng)度與特異基因有所差異長(zhǎng)度與特異基因有所差異設(shè)計(jì)范圍在編碼區(qū)內(nèi)界定產(chǎn)物長(zhǎng)度在100-300bp應(yīng)用應(yīng)用Primer 5.0軟件常規(guī)應(yīng)用功能即可軟件常規(guī)應(yīng)用功能即可標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)（特異性）（特異性）選擇非保守區(qū)段，特異性的位置設(shè)計(jì)在選擇非保守區(qū)段，特異性的位置設(shè)計(jì)在3末端末端 ；（；（SSR等特征序列的兩側(cè)）等特征序列的兩側(cè)）特異區(qū)段 1014-95%-99%與 15一 樣 9423-92%-99% 9722-85%-96%?GATTGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGCGAGCTTGATCACC

21、TTTGCTACTTGGATCTGTCGGATAATTCATTGGTTGGCGAGGTACCCAAGAGTTT.TCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGATCACCTTTGCTACTTGGATCTCTCGGATAATTCATTGGTTGGTGAGGTACCCGAGAGTTT.TGGTCGGCACCATCCCATCGTGGATTGGTGAGCTTGAACACCTTCGTTACTTGGATCTCTCAGATAATTCATTAATTGGCGAGGTACCCAAAAGTTTA TTGGGGTTTCCCGGGGGGCCCAAACCCCCCAAATTTCCCCCCCCCAAATT

22、TCCCGGGTTTGGGGGGAAATTTTTTGGGGGGTTGGGAAAGGGCCCTTTTTTGGGAAATTCCCAAACCCCCCTTTTTTTTGGGCCTTTAAACCCTTTTTTGGGGGGAAATTTCCCTTTCCTTTCCCGGGAAATTTAAAAAATTTTTTCCCAAATTTTTTGGGGTTTTTTGGGGGGCCGGGAAAGGGGGGTTTAAACCCCCCCCCAAAAAGGAAAGGGTTTTTTTTT 1984-95%-99%與 15一 樣 19123-92%-99% 19422-85%-96%?GATACGGCTCAAGGGTCTCGTCATCG

23、TTGGT.CGTTCACTAGGTATGGTTTTTACGAACATGCCATTGTATGTGAAGCGTAATAGAAGAACACTCGACGATACAGCTCAAGGGGCTCGTCATAGCTGGT.CGTTCACTGGGTACGGCTTCTACTAATATGCCATTGTATGTCAAGAGCAACAGAAGAACACTCGATGATACGGTTCAAGGACATCACCATCGCTGGT.CGCTCACTGGGTAAGGCTTTCACTAACATGCCATTATATGTGAAGAGTAACAGAAGAACACTCCAAGGGAAATTTAAACCCGGGGGCCTTTCCCAAAA

24、AAGGGGGGGGCCCTTTCCCGGCCCCAAATTTCCGGGCCTTTGGGGGGTTTCCCGGGTTTTTCCCAAACCCTTTGGGGGGGGTTTAAATGGGGGGTTTTTTTTAAACCCTTAAAAAACCAAATTTGGGCCCCCCAAATTTTTTGGTTTAAATTTGGGTTTGGAAAAAAGGGCGGGTTAAAAAACCAAAGGGAAAAAAGGGAAAAAACCCAAACCCTTTCCCGGAAA 2024-95%-99%與 15一 樣 19523-92%-99% 19822-85%-96%?G.AACG.AACC.AACCAAAAAACCC

25、RACE及染色體步移引物設(shè)計(jì)及染色體步移引物設(shè)計(jì)：基于已知序列，用于獲取未知序列區(qū)段：基于已知序列，用于獲取未知序列區(qū)段RACE引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)如果基因是多拷貝或?yàn)槎嗷蚣易?，須在所得不同片段特異區(qū)設(shè)計(jì)如果基因是多拷貝或?yàn)槎嗷蚣易?，須在所得不同片段特異區(qū)設(shè)計(jì)與接頭引物與接頭引物Tm值相差不宜過大值相差不宜過大產(chǎn)生嵌套引物，位置合理產(chǎn)生嵌套引物，位置合理SNP引物的設(shè)計(jì)引物的設(shè)計(jì)何謂何謂SNP？SNP位點(diǎn)設(shè)置在位點(diǎn)設(shè)置在3最后一個(gè)堿基最后一個(gè)堿基倒數(shù)第三個(gè)堿基人為引入突變倒數(shù)第三個(gè)堿基人為引入突變-保證引物特異性保證引物特異性 414-95%-99%與 15一 樣 3423-92%-99% 3722-85%-96%? 435IRI-AY968588 803IRI-AY968589 34516-80