目的基因的表達(dá)黑板

1、第一節(jié) 外源基因的表達(dá)體系原核生物轉(zhuǎn)錄過程 RNA聚合酶亞基發(fā)現(xiàn)啟動子序列與-35區(qū)結(jié)合 進(jìn)一步與-10區(qū)結(jié)合 解鏈（17bp)使模板暴露 因子識別并起始啟動位點(diǎn) pppA/pppG 因子解離，NusA與RNA聚合酶結(jié)合（放松） RNA聚合酶向前滑動，繼續(xù)解12bp鏈 終止（依賴因子、不依賴 因子）一、基因表達(dá)的機(jī)制 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄：可調(diào)控的啟動子 mRNA的延伸與穩(wěn)定性 外源基因mRNA的有效翻譯（起始密碼子、SD序列、 SD序列與起始密碼子之間的距離為39個堿基） 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定 目的基因沉默(位置效應(yīng)的基因沉默、轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默） 二、外源基因表達(dá)系統(tǒng)

2、 概念： 目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物。 原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)和藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)） 真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)原核基因表達(dá)系統(tǒng) 生長快，可通過發(fā)酵獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物 基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作與分析 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)粒或噬菌體，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體 生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象 內(nèi)源蛋白酶會降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性大腸桿菌基因表達(dá)載體 復(fù)制子 啟動子和終止子 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 密碼子（簡并密碼子的選擇）

3、選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因）三、制約目的基因表達(dá)的因素1、外源基因是否插入在正確的閱讀框架2、目的基因的有效轉(zhuǎn)錄（如啟動子的作用）3、mRNA的有效翻譯（如SD序列等作用）4、轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^程 四、閱讀框架 在DNA鏈上,由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始,到終止密碼子為止的一個連續(xù)編碼序列,叫做一個開放閱讀框架（open reading frame, ORF） 五、啟動子與轉(zhuǎn)錄的影響 1、在原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程中，決定外源基因表達(dá)的關(guān)鍵因素是外源基因必須在載體DNA的啟動子控制之下，而且啟動子又能被宿主細(xì)胞中的RNA聚合酶有效識別。 選擇填空 2、啟動子DNA序列中兩個高度保守區(qū)域是

4、必須的（-10區(qū)與-35區(qū)），沒有這兩個高度保守區(qū)域，就沒有啟動作用。但是啟動子DNA序列中保守性較差部分和兩個保守區(qū)之間的核苷酸數(shù)量也影響啟動子的功能 。 LacUv5 trp啟動子 trp-lacUv5啟動子 （1）原核生物：大約在RNA合成起點(diǎn)之前的10bp和35bp處，由兩個由6個核苷酸組成的共有序列 -10區(qū) ：TATAAT（the pribnow box） -35區(qū) ：TTGACA （2） 真核生物 -30區(qū)：TATA盒：TATAAAA -80區(qū)：CAAT盒：GGTCAATCT 六、翻譯過程對表達(dá)的影響 1、SD序列與rRNA的16s亞基3末端序列之間的互補(bǔ)程度，是影響翻譯效率的主

5、要因素。 2、起始密碼AUG與SD序列之間的距離以及SD序列的核苷酸組成也影響翻譯能力。 3、起始密碼之后的一個核苷酸對mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響。 4、基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響 第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞 中的表達(dá) 一、基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 1、克隆原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá) 2、克隆真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá) 3、克隆原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 4、克隆真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng)：低等真核細(xì)胞（酵母）系統(tǒng)哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng) 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的困難 1、細(xì)菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。 2、從真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA

6、缺乏SD序列，不能結(jié)合到核糖體蛋白上。 3、真核基因一般含有內(nèi)含子，而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，mRNA中的內(nèi)含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，不能表達(dá)真核蛋白質(zhì)。 4、表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶破壞 2 起始密碼子的正確選讀 噬菌體蛋白A： 5mRNA GUGAGUAUAAGAGGACAUAUGCCU 3 rRNA 5 ACCUCCUA 3 Q噬菌體復(fù)制酶： 5 mRNA UUACUAAGGAUGAAAUGCAUGUCU3 rRNA 5 ACCUCCUA 3二、原核系統(tǒng)高效表達(dá)外源真核基因 的措施 1、將真核基因克隆到一個強(qiáng)大的原核啟動子和SD 序列的

7、下游 2、從真核細(xì)胞中分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 3、將真核基因插在幾個原核密碼之后，通過翻譯，通過翻譯得到原核多肽和真核基因產(chǎn)物連在一起的融合蛋白。 牛的凝血因子Xa能識別特異的4肽順序：Ile（異亮）-Glu（谷）-Gly（甘）-Ary（精） 原核多肽-Ile-Glu-Gly-Arg-真核蛋白。用Xa水解，分離出真核蛋白 4、減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平 將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分開成為兩個階段，以便減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 三、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測與分離純化1、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測1.1 外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測 Northern印跡雜交、RT PCR1.2 報(bào)告基因的

8、酶法檢測 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT) 葡萄糖苷酸酶基因等(GUS)1.3 表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測2、基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化 細(xì)胞破碎 離心 沉淀法、超濾濃縮法分離特異表達(dá)蛋白 進(jìn)一步分離柱層析 聚丙烯凝膠電泳mRNA差異顯示技術(shù)及其應(yīng)用一、mRNA差別顯示技術(shù)概述 高等生物大約有3 3萬5 5萬個基因 在任一細(xì)胞表達(dá)的基因約占總數(shù)的15%15% 哪些基因在何生長發(fā)育階段以及在何種生理狀態(tài)下表達(dá)，決定了整個生命過程。 比較同一類細(xì)胞在不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)的差異，是克隆特異表達(dá)基因的方法。一、mRNA差別顯示技術(shù)概述 1992年 Liang 、Pardee mRNA差異顯示技術(shù) （dif

9、ferential display reverse transcripion PCR，DDRTPCR） 動物、人類的癌癥、心臟病、糖尿病 植物胚胎發(fā)育、無融合生殖、植物抗逆與抗病性二、DDRT技術(shù)的原理（一）錨定PCR 錨定PCR（anchored PCR）是PCR技術(shù)的一種改進(jìn)，一般的PCR實(shí)驗(yàn)中需要知道目的基因兩端的序列，而錨定PCR技術(shù)不需要。 所謂的“錨定”就是指一端已經(jīng)定死了，另一端通過人工合成引物來定，這就為許多我們對不清楚其5端區(qū)域或是3端區(qū)域的RNA的分析找到了一條良好的途徑。（二）DDRT技術(shù)路線 提取B組織RNA提取A組織RNA錨定引物（GTGT1515A,GTA,GT15

10、15G,GTG,GT1515C C）反轉(zhuǎn)錄錨定引物（GTGT1515A,GTA,GT1515G,GTG,GT1515C C）反轉(zhuǎn)錄總RNA完整性鑒定總RNA完整性鑒定獲得cDNA第一鏈獲得cDNA第一鏈隨機(jī)引物擴(kuò)增獲得cDNA第二鏈隨機(jī)引物擴(kuò)增獲得cDNA第二鏈采用隨即引物和錨定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用隨即引物和錨定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析處理 對照將差異條帶切出并進(jìn)行回收重新用相同的錨定引物和隨即引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Northern雜交，Southern雜交確定差異條帶的真實(shí)性克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體測序、進(jìn)入GeneBank序列分析三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) 1、優(yōu)點(diǎn) 具有簡便

11、、靈敏、RNA用量少、效率高 可同時(shí)比較多種給定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的 細(xì)胞內(nèi)mRNA 2、缺點(diǎn) 1）所得特異性cDNA片段假陽性的比例高，75% 原因：總RNA有DNA污染 凝膠中有重疊帶 特異cDNA片段太短，得不到雜交信號三、mRNA差別顯示技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) 2、缺點(diǎn) 2）cDNA產(chǎn)物的質(zhì)量往往較低，在凝膠上 呈現(xiàn)smear狀態(tài) 3）得到的特異性的cDNA 片段非翻譯序列 利用GeneBank進(jìn)行數(shù)據(jù)分析不利四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用 1、研究植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差異 2、基因的鑒定與克隆 3、研究激素對植物發(fā)育的影響 4、植物抗逆性機(jī)理的研究 5、在營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用 6、在腫

12、瘤研究中的應(yīng)用 四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用 研究植物不同分化發(fā)育階段的基因表達(dá)差異 Ville Calzada和Nuccio 狼尾草的基因表達(dá) 有性生殖和無融合生殖的子房 2個錨定引物和20個10堿基隨即引物共顯示出2268個cDNA片段，其中有3個基因片段能在有性生殖的子房中特異表達(dá)。四、mRNA差別顯示技術(shù)的應(yīng)用 在營養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用 營養(yǎng)物質(zhì)的作用與基因調(diào)空有關(guān)，當(dāng)某種營養(yǎng)缺乏或過多時(shí)，在分子水平上就表現(xiàn)為某個或某些基因的開啟、關(guān)閉或表達(dá)量的變化銅在營養(yǎng)學(xué)中的作用缺銅6周的大鼠肝臟mRNA正常大鼠肝臟mRNA10個cDNA片段的差異表達(dá)量是對照的1.2倍新的未知基因五、mRNA差別顯示在

13、甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 被子植物無融合生殖使其子代繼承了母本所有的遺傳特性，并形成遺傳上穩(wěn)定的，可由種子繁殖的無性系。由此可以保存優(yōu)異的基因型，固定雜種優(yōu)勢，并可能使一些重要的作物實(shí)現(xiàn)“一系法”育種；如果無融合生殖被很好地利用，它將是二十世紀(jì)六十年代“綠色革命”之后的又一次農(nóng)業(yè)革命無性生殖革命。 五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 植物界中，無融合生殖廣泛存在。我們通過栽培甜菜（Beta vulgaris L.）與白花甜菜（B.corollifora Zoss）遠(yuǎn)緣雜交獲得了真實(shí)雜種，經(jīng)遺傳回交獲得了帶有白花甜菜染色體的完整單體附加系系列，并且通過單體附加系傳

14、遞研究，篩選出近100%高頻率傳遞的單體附加系M14品系。經(jīng)過標(biāo)記基因雜交、傳遞遺傳形態(tài)觀察、胚胎學(xué)及分子生物學(xué)鑒定它們是兼性無融合生殖的,1999年3月經(jīng)專家鑒定為無融合生殖品系；同時(shí)無融合生殖基因已經(jīng)定位在這條附加的白花甜菜染色體上，因此M14品系是克隆無融合生殖基因的極為難得的材料。 甜菜單體附加系M14M14品系 ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, 箭頭所指為附加的白花甜菜染色體 ) )五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 采用mRNA差異顯示技術(shù)比較甜菜無融合生殖系及正常進(jìn)行有性生殖的二倍體栽培植株在

15、無融合生殖基因表達(dá)的三個關(guān)鍵時(shí)期，即大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂期、助細(xì)胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差異，是進(jìn)行克隆無融合生殖相關(guān)基因的比較有效的方法 五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。 PCR反應(yīng)擴(kuò)增： cDNA第一鏈 1ul 2.5mM dNTP 1.2l 25mM Mgcl2 1.2l Ex Taq酶（5U/l） 0.2l 50m錨定引物 0.5l 隨機(jī)引物 1.0l 10PCR 緩沖液 2.0l H2O 12.9l 反應(yīng)體系為20ul 五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 PCR反應(yīng)程序：94

16、,5min;94,30sec;42,lmin;72,30sec , 40cycle。 PCR產(chǎn)物利用4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離出M14與A2Y相比較而對應(yīng)的差異片段。 將差異片進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化?？寺≥d體為 PMD18-T Vector， 按照-互補(bǔ)篩選原則，挑取部分白色菌落為模板，按原程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析，有插入片段的菌落應(yīng)擴(kuò)增出一條與插入片段大小一致的片段，挑取陽性克隆菌落，穿刺培養(yǎng)后由上海博亞生物技術(shù)有限公司測序 ，測序后進(jìn)入GenBank進(jìn)行序列同源性比較。 經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫比較，發(fā)現(xiàn)AP-3片段與B.Vulgaris mRNA for small

17、GTP-binding protein 具有同源性。種蛋白基因被稱為分子開關(guān)，但是否與無融合基因的表達(dá)有關(guān)，需要進(jìn)一步研究而AP-4為未知基因而。原核生物轉(zhuǎn)錄過程 RNA聚合酶亞基發(fā)現(xiàn)啟動子序列與-35區(qū)結(jié)合 進(jìn)一步與-10區(qū)結(jié)合 解鏈（17bp)使模板暴露 因子識別并起始啟動位點(diǎn) pppA/pppG 因子解離，NusA與RNA聚合酶結(jié)合（放松） RNA聚合酶向前滑動，繼續(xù)解12bp鏈 終止（依賴因子、不依賴 因子）第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞 中的表達(dá) 4、減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高外源基因的表達(dá)水平 將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分開成為兩個階段，以便減低宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 二、DDRT技術(shù)

18、的原理（一）錨定PCR 錨定PCR（anchored PCR）是PCR技術(shù)的一種改進(jìn)，一般的PCR實(shí)驗(yàn)中需要知道目的基因兩端的序列，而錨定PCR技術(shù)不需要。 所謂的“錨定”就是指一端已經(jīng)定死了，另一端通過人工合成引物來定，這就為許多我們對不清楚其5端區(qū)域或是3端區(qū)域的RNA的分析找到了一條良好的途徑。五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 被子植物無融合生殖使其子代繼承了母本所有的遺傳特性，并形成遺傳上穩(wěn)定的，可由種子繁殖的無性系。由此可以保存優(yōu)異的基因型，固定雜種優(yōu)勢，并可能使一些重要的作物實(shí)現(xiàn)“一系法”育種；如果無融合生殖被很好地利用，它將是二十世紀(jì)六十年代“綠色革命”之后的又一次農(nóng)業(yè)革命無性生殖革命。 五、mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。 PCR反應(yīng)擴(kuò)增： cDNA第一鏈 1ul 2.5mM dNTP 1.2l 25mM Mgcl2 1.2l Ex Taq酶（5U/l） 0.2l 50m錨定引物 0.5l 隨機(jī)引物 1.0l 10PCR 緩沖液 2.0l H2O 12.9l 反應(yīng)體系