目的基因?qū)胧荏w細胞

1、第六章目的基因?qū)胧荏w細胞第三節(jié) 重組子的篩選 在重組在重組DNADNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，一般僅有少數(shù)受體細胞成為克隆過程中，一般僅有少數(shù)受體細胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細胞背子。必須采用合適的方法從大量的細胞背景中篩選出期待的克隆子景中篩選出期待的克隆子。概念概念 克隆子克隆子 轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子 重組子重組子將攝取外源將攝取外源DNADNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細胞統(tǒng)稱為受體細胞統(tǒng)稱為克隆子克隆子。把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（轉(zhuǎn)化子（導(dǎo)

2、入外源導(dǎo)入外源DNADNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為稱為轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子 ），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向?，F(xiàn)在這兩者有通用的趨向。含有含有重組重組DNADNA分子分子的克隆子被稱為的克隆子被稱為重組子重組子，如果重組如果重組子中含有子中含有外源目的基因外源目的基因則又稱為則又稱為陽性克隆子陽性克隆子或或期望期望重組子重組子 。經(jīng)過各種方法將外源經(jīng)過各種方法將外源DNADNA分子導(dǎo)入受體細胞后，獲得分子導(dǎo)入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選克隆子的篩選。 一、遺傳表型直接篩選法一、遺傳表型直接篩選法 （一）根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)

3、化子（一）根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子 在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時，通常在載體DNADNA分分子中組裝了一種或兩種子中組裝了一種或兩種選擇標記基因選擇標記基因，在受體，在受體細胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)細胞內(nèi)進行表達，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。 一般的做法一般的做法是是: : 將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在含適量將轉(zhuǎn)化處理后的受體細胞接種在含適量選擇藥物的培養(yǎng)基選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，根據(jù)菌落生長情

4、況挑選出轉(zhuǎn)化子。選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基是：是： 根據(jù)宿主細胞類型配置的培養(yǎng)基，對于根據(jù)宿主細胞類型配置的培養(yǎng)基，對于細菌受體細胞細菌受體細胞而言，通常用而言，通常用LBLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，在在LBLB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物：選擇物： 是由是由載體載體DNADNA分子上攜帶的分子上攜帶的選擇標記基因選擇標記基因所決定。所決定。（一）根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化（一）根據(jù)載體選擇標記初步篩選轉(zhuǎn)化子子 （1 1）抗藥性篩選）抗藥性篩選 （2 2）插入失活篩選法）插入失活篩選法 （3 3）插入表達篩選法）插入表達篩選法 （4 4

5、）顯色互補篩選法）顯色互補篩選法 （5 5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞 （6 6）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞（1 1）抗藥性篩選）抗藥性篩選正向選擇方式 注意：注意： 利用利用含一種選擇藥物的選擇培養(yǎng)基含一種選擇藥物的選擇培養(yǎng)基無法區(qū)分重組子和非重組子，只能區(qū)分轉(zhuǎn)無法區(qū)分重組子和非重組子，只能區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子。化子和非轉(zhuǎn)化子。（2 2）插插入入失失活活篩篩選選法法雙抗藥性篩選雙（3 3）插入表達篩選法）插入表達篩選法 利用外源目的基因插入特定載體后能利用外源目的基因插入特定載體后能激活篩選標記基因的表達，激

6、活篩選標記基因的表達，由此進行轉(zhuǎn)化由此進行轉(zhuǎn)化子的篩選。子的篩選。 有些載體在設(shè)計時，在篩選標記基因前面連接上一段有些載體在設(shè)計時，在篩選標記基因前面連接上一段負調(diào)控序列負調(diào)控序列，當，當插入失活插入失活該負調(diào)控序列該負調(diào)控序列時，其下游的篩選標記基因才能表達。時，其下游的篩選標記基因才能表達。 例如例如pTR262pTR262質(zhì)粒載體，它由質(zhì)粒載體，它由pBR322pBR322衍生而來，衍生而來，其其TcTcr r基因的上游基因的上游含有一段含有一段噬菌體噬菌體DNADNA的的CICI阻遏蛋白阻遏蛋白編碼基因及其調(diào)控序列，編碼基因及其調(diào)控序列，CICI基因表達的阻遏蛋白可以基因表達的阻遏蛋白

7、可以抑制抑制TcTcr r基因的表達?；虻谋磉_。當外源當外源DNADNA片段片段插入插入CICI基因的基因的Hin dHin d或或BglBgl位點位點上時，上時，CICI基因失活?；蚴Щ睢cTcr r基因基因因因阻礙解除而得以阻礙解除而得以表達表達，故陽性重組子為，故陽性重組子為TcTcr r表型。表型。 質(zhì)粒本身質(zhì)粒本身因為因為TcTcr r基因受阻礙為基因受阻礙為TcTcs s表型表型，當轉(zhuǎn)化，當轉(zhuǎn)化細菌涂布在細菌涂布在TcTc平板上時，只有含有外源平板上時，只有含有外源DNADNA插入片段插入片段的陽性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。的陽性重組子的轉(zhuǎn)化菌才能生長成菌落。（4 4）顯

8、色互補篩選法）顯色互補篩選法 lacZ lacZ 基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有基因上缺失操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性突半乳糖苷酶陰性突變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為變體之間實現(xiàn)互補，這種互補現(xiàn)象稱為-互補互補。 具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯具有完整乳糖操縱子的菌體能轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷半乳糖苷酶酶(Z)(Z)、IPTGIPTG和和X-galX-gal時，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使時，產(chǎn)生蘭色沉淀物，使菌落成為藍色。如果在載體菌落成為藍色。如果在載體DNADNA上組入上組入-半乳半乳糖苷酶基因（糖苷酶基因（lacZ)lacZ)部分缺失的片

9、段部分缺失的片段(lacZ(lacZ) )則重組則重組DNADNA分子轉(zhuǎn)化分子轉(zhuǎn)化lacZlacZ互補型菌落，互補型菌落，會在含有會在含有X-galX-gal和和IPTGIPTG的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基中得到的轉(zhuǎn)化子是藍色菌落。是藍色菌落。 lac Zlac Z是是-半乳糖苷酶基因部分缺失的半乳糖苷酶基因部分缺失的DNADNA片片段，含段，含lac Zlac Z的重組載體轉(zhuǎn)化的重組載體轉(zhuǎn)化lac Zlac Z互補型菌互補型菌株，株，可轉(zhuǎn)譯可轉(zhuǎn)譯-半乳糖苷酶半乳糖苷酶，在含有，在含有X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷）和半乳糖苷）和IPTG

10、IPTG（異（異丙基丙基-硫代半乳糖苷）硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化子成為藍色菌落，成為藍色菌落，而而lac Zlac Z互補型菌株本身為白互補型菌株本身為白色菌落色菌落。當。當lac Zlac Z區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化區(qū)插入外源基因后，再轉(zhuǎn)化lac Zlac Z互補型菌株，由于不能翻譯互補型菌株，由于不能翻譯-半乳糖苷半乳糖苷酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有酶，轉(zhuǎn)化子即使在含有X Xgalgal和和IPTGIPTG的培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上也只能長成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源上也只能長成白色菌落。這樣可以區(qū)分含外源基因和不含外源基因的轉(zhuǎn)化子?；蚝筒缓庠椿虻霓D(zhuǎn)化子。 此方法主要用于原

11、核生物。此方法主要用于原核生物。 互互補補的的檢檢測測 以顯色劑以顯色劑x-galx-gal作為選擇物時作為選擇物時: :DNADNA對照組對照組不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落；不應(yīng)出現(xiàn)任何菌落；感受態(tài)細胞對照組長感受態(tài)細胞對照組長出的菌落應(yīng)全是藍色的；出的菌落應(yīng)全是藍色的；感受態(tài)細胞有效性對照組長感受態(tài)細胞有效性對照組長出的菌落中應(yīng)有白色的。出的菌落中應(yīng)有白色的。 其中一項不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。其中一項不符，就有可能挑出假的轉(zhuǎn)化子菌落。 （5 5）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞胞 報告基因：報告基因：系指系指其編碼產(chǎn)物其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，能夠被快速地測定，常用

12、來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類細胞（器官或組織）并檢測其表達活性的一類特殊用途的基因。特殊用途的基因。 在在植物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因研究中，在有選擇壓力的情況下，研究中，在有選擇壓力的情況下，可利用報告基因在受體細胞內(nèi)的表達，從大量可利用報告基因在受體細胞內(nèi)的表達，從大量非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細胞；同時，報告基非轉(zhuǎn)化克隆中選擇出轉(zhuǎn)化細胞；同時，報告基因可以和某些目的基因構(gòu)成因可以和某些目的基因構(gòu)成嵌合基因嵌合基因，從報告，從報告基因的表達了解目的基因的表達情況及推測基基因的表達了解目的基因的表達情況及推測基因調(diào)控

13、序列因調(diào)控序列。常用的報告基因有抗生素抗性基。常用的報告基因有抗生素抗性基因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等因以及編碼某些酶類或其他持殊產(chǎn)物的基因等。 特征特征 作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個條件：作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個條件： (1)(1)已被克隆和全序列已測定；已被克隆和全序列已測定； (2)(2)表達產(chǎn)物在受體細胞中本不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細胞中無相似表達產(chǎn)物在受體細胞中本不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細胞中無相似的內(nèi)源性表達產(chǎn)物；的內(nèi)源性表達產(chǎn)物； (3)(3)其表達產(chǎn)物能進行定量測定。其表達產(chǎn)物能進行定量測定。 新霉素磷

14、酸轉(zhuǎn)移酶基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（nptnpt）抗新霉素、抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和卡那霉素、慶大霉素和G418G418等抗生素，成為篩等抗生素，成為篩選動植物轉(zhuǎn)化子的選擇標記基因。選動植物轉(zhuǎn)化子的選擇標記基因。 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpthpt）賦予轉(zhuǎn)化子能賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標記基因主要用于篩選動抗潮霉素，作為選擇標記基因主要用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎重重。 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（catcat）也被用于篩選也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標記基因。動植物轉(zhuǎn)化子的標記基因。

15、-葡萄糖酸酶基因（葡萄糖酸酶基因（gusgus） gusgus的基因產(chǎn)物的基因產(chǎn)物-葡萄糖酸酶葡萄糖酸酶（GUSGUS）能夠催化能夠催化4-4-甲基傘形花酮甲基傘形花酮-D-D-葡萄糖苷酸，葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光產(chǎn)生熒光物質(zhì)物質(zhì)4-4-甲基傘形花酮，以此篩選含甲基傘形花酮，以此篩選含gusgus基因的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化子?；印?由于植物細胞由于植物細胞GUSGUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。于篩選植物轉(zhuǎn)化子。 尤其是尤其是gusgus基因的基因的3 3端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的的嵌合基因嵌合基因仍能正常表達，產(chǎn)生的仍能正常表達，產(chǎn)生的

16、融合蛋白融合蛋白中中仍有仍有GUSGUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。的定位分析。螢火蟲熒光素酶基因（螢火蟲熒光素酶基因（lucluc） lucluc表達產(chǎn)物表達產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（螢火蟲熒光素酶（LUCLUC）在）在MgMg2+2+的作的作用下，用下，可以與熒光素和可以與熒光素和ATPATP底物發(fā)生反應(yīng)，底物發(fā)生反應(yīng)，形成形成與與酶結(jié)合的酶結(jié)合的腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，腺苷酸熒光素?；瘡?fù)合物，經(jīng)過氧化脫經(jīng)過氧化脫羧作用后，羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用化熒光素，可以用熒光測定儀熒光測

17、定儀快速靈敏地檢測出快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因。一種報告基因。 LucLuc基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)生的背景干擾，因成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)生的背景干擾，因此，此，LucLuc是是一種理想的報告基因一種理想的報告基因。 抗除草劑抗除草劑barbar基因?；颉arbar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（移酶（PATPAT），使轉(zhuǎn)化子對

18、含有磷化麥黃酮），使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮（PPTPPT）成分的除草劑具有抗性。）成分的除草劑具有抗性。 冠癭堿合成酶基因。冠癭堿合成酶基因。主要包括主要包括胭脂堿合成酶基因胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因和章魚堿合成基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒的的T-DNAT-DNA區(qū)段。區(qū)段。 冠冠癭癭堿合成酶基因在植物細胞中的表達產(chǎn)物可以催堿合成酶基因在植物細胞中的表達產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細胞的篩選。因

19、細胞的篩選。 冠冠癭癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報告基因所取代。現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報告基因所取代。 （6 6）利用遺傳選擇標記篩）利用遺傳選擇標記篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞 在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶酶(Cat)(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Npt)(Npt)基因基因也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的篩選。也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細胞的篩選。 常用的標記基因還有：常用的標記基因還有： - - 胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因

20、（tktk）、）、 - - 二氫葉酸還原酶基因（二氫葉酸還原酶基因（dhfrdhfr） - - 次黃嘌呤次黃嘌呤- -鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprthgprt） - - 細菌的黃嘌呤細菌的黃嘌呤- -鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因酶基因(ecogpt)(ecogpt)等。等。 胸腺核苷激酶基因（胸腺核苷激酶基因（tktk）、二氫葉酸還原酶基因）、二氫葉酸還原酶基因（dhfrdhfr）及次黃嘌呤）及次黃嘌呤- -鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（因（hgprthgprt）等的）等的表達產(chǎn)物直接或間接參與核苷表達產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合

21、成代謝。酸合成代謝。這些基因缺失的缺陷型細胞因核苷酸合成代謝失這些基因缺失的缺陷型細胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長。能生長。如果用這樣的如果用這樣的缺陷型細胞作為受體細胞缺陷型細胞作為受體細胞，導(dǎo)入含，導(dǎo)入含有上述基因的外源有上述基因的外源DNADNA，補充原來缺失的基因，補充原來缺失的基因，使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以在不添加核苷在不添加核苷酸的培養(yǎng)基酸的培養(yǎng)基中正常生長。根據(jù)這一性質(zhì)可以在不中正常生長。根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子。添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選

22、出轉(zhuǎn)化子。三、核酸分子雜交檢測法（三、核酸分子雜交檢測法（p239）基本原理基本原理復(fù)性復(fù)性RNADNA待測的核酸序列待測的核酸序列雜交的雙方雜交的雙方用于檢測的已知核酸片段用于檢測的已知核酸片段探針探針 根據(jù)待測核酸的來源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法的不同。根據(jù)待測核酸的來源以及將其分子結(jié)合到固相支持物上的方法的不同。 SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交NorthernNorthern印跡雜交印跡雜交斑點和狹線印跡雜交斑點和狹線印跡雜交菌落（或噬菌體）原位雜交菌落（或噬菌體）原位雜交核酸分子雜交檢測法分類核酸分子雜交檢測法分類又稱又稱DNA印跡雜交、印跡雜交、South

23、ern DNA印跡雜交印跡雜交1、Southern印跡雜交印跡雜交經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA片段片段轉(zhuǎn)移到濾膜上轉(zhuǎn)移到濾膜上 與標記的與標記的DNA或或RNA探針雜交探針雜交放射自顯影顯雜交帶放射自顯影顯雜交帶基本原理：基本原理：（1）提取總）提取總DNA （2）酶解）酶解 （3）電泳）電泳 （4）轉(zhuǎn)印）轉(zhuǎn)印 （5）變性解鏈）變性解鏈 （6）雜交）雜交 （7）洗脫）洗脫 （8）放射自顯影）放射自顯影 （9）比較分析）比較分析 毛細管虹吸印跡法電轉(zhuǎn)移印跡法真空轉(zhuǎn)移法核酸轉(zhuǎn)移（印跡）方法核酸轉(zhuǎn)移（印跡）方法毛細管虹吸印跡法濕濾紙濕濾紙高鹽緩沖液高鹽緩沖液濾紙橋濾紙橋凝膠凝膠

24、硝酸纖硝酸纖維素膜維素膜吸水紙吸水紙玻璃板玻璃板支持臺支持臺容器容器重物重物利用核酸分子在電場中的利用核酸分子在電場中的電泳作用電泳作用將凝膠將凝膠中的中的DNADNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。轉(zhuǎn)移到固相支持物上。濕式電轉(zhuǎn)移濕式電轉(zhuǎn)移干式電轉(zhuǎn)移干式電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法尼龍膜凝膠濾紙海綿凝膠支持夾緩沖液電極+濾紙電極濕式電轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移裝置硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜（簡稱（簡稱NCNC膜）膜）優(yōu)點：優(yōu)點：吸附能力強，雜交吸附能力強，雜交信號本底低信號本底低缺點：缺點：DNADNA分子結(jié)合不牢分子結(jié)合不牢固，膜易碎裂，依賴高鹽固，膜易碎裂，依賴高鹽溶液溶液常用的固相支持物常用的固相支持物尼龍膜

25、（尼龍膜（NylonNylon）優(yōu)優(yōu)點：點：結(jié)合單鏈，雙鏈結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比的能力比NC膜強，膜強，韌性高，可重復(fù)雜交韌性高，可重復(fù)雜交缺點：缺點：雜交信號本底高雜交信號本底高常用的固相支持物常用的固相支持物凝膠凝膠濾膜濾膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移RNA 至膜上至膜上RNA 分子分子甲醛變性電甲醛變性電泳（聚丙烯泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）酰胺凝膠電泳）帶有帶有RNA片段的凝膠片段的凝膠轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜雜交雜交、顯影顯影2、Northern印跡雜交印跡雜交兩種印跡技術(shù)的比較兩種印跡技術(shù)的比較(P248)12343 3、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交、斑點印跡雜交和狹線印跡雜交 兩種方法的兩種方法的基本原理基本原理和

26、和操作步驟操作步驟相同相同 即通過特殊的即通過特殊的加樣裝置加樣裝置將變性的將變性的DNA或或RNA核酸樣品，核酸樣品，直接轉(zhuǎn)移直接轉(zhuǎn)移到適當?shù)碾s到適當?shù)碾s交濾膜上，然后與核酸探針分子進行雜交以檢測核酸樣品中是否存在特異性交濾膜上，然后與核酸探針分子進行雜交以檢測核酸樣品中是否存在特異性DNA或或RNA。斑點雜交法斑點雜交法狹縫式點樣器狹縫式點樣器 1、斑點印跡為圓形、斑點印跡為圓形 2、狹縫印跡為線狀、狹縫印跡為線狀 3、鑒別、鑒別DNA、RNA 4、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品、簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量、特異性不高、不能鑒別核酸分子量斑點

27、及狹縫印跡雜交的特點4 4、菌落（或噬菌斑）原位雜交、菌落（或噬菌斑）原位雜交基本原理基本原理直接把菌落和噬菌斑轉(zhuǎn)移到濾膜上直接把菌落和噬菌斑轉(zhuǎn)移到濾膜上溶菌、變性溶菌、變性DNA暴露并于濾膜原位結(jié)合暴露并于濾膜原位結(jié)合與探針雜交與探針雜交溶菌、使溶菌、使DNA暴露暴露洗菌體碎片和洗菌體碎片和Pr使單鏈使單鏈DNA牢牢固結(jié)合在膜上固結(jié)合在膜上操操 作作用用 途途SouthernSouthern印跡雜交印跡雜交從轉(zhuǎn)化子中提取總從轉(zhuǎn)化子中提取總DNADNA，經(jīng)，經(jīng)酶切、電泳分帶及變性，酶切、電泳分帶及變性，轉(zhuǎn)移膜上，再用轉(zhuǎn)移膜上，再用DNADNA探針與探針與其雜交。操作麻煩。其雜交。操作麻煩。鑒定

28、轉(zhuǎn)化子中鑒定轉(zhuǎn)化子中是否是否含有含有待檢測重組待檢測重組DNADNA分子；分子；鑒定待檢測的鑒定待檢測的DNADNA分子分子的的大小大小。斑點印跡斑點印跡雜交雜交把提取的轉(zhuǎn)化子總把提取的轉(zhuǎn)化子總DNADNA直接直接點樣到膜上，變性處理后點樣到膜上，變性處理后再用再用DNADNA探針與其雜交。操探針與其雜交。操作簡單。作簡單。只能區(qū)別總只能區(qū)別總DNADNA中中是否是否含有含有待檢測重組待檢測重組DNADNA分分子的重組子子的重組子菌落（或菌落（或噬菌斑）噬菌斑）原位雜交原位雜交直接把菌落或噬菌斑印跡直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到膜上，經(jīng)溶菌和變轉(zhuǎn)移到膜上，經(jīng)溶菌和變性處理后使性處理后使DNADN

29、A暴露出來并暴露出來并與濾膜原位結(jié)合，再用與濾膜原位結(jié)合，再用DNADNA探針與其雜交。操作簡單。探針與其雜交。操作簡單。廣泛地用于從廣泛地用于從基因組基因組DNADNA文庫文庫和和cDNAcDNA文庫文庫中中篩選含目的基因的重組篩選含目的基因的重組子。子。三種篩選方法的比較三種篩選方法的比較 雜交探針雜交探針指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補的核酸序列復(fù)性指具有一定序列的核苷酸片段，它能與互補的核酸序列復(fù)性雜交，并且通過適當標記進行檢測。雜交，并且通過適當標記進行檢測。 5、核酸雜交探針( 自學(xué)) 同源或部分同源探針同源或部分同源探針 總總cDNAcDNA探針探針 特異性特異性cDNAc

30、DNA探針探針 人工合成的寡核苷酸探針人工合成的寡核苷酸探針（1）核酸雜交探針的種類 理想的探針標記物應(yīng)滿足的條件：理想的探針標記物應(yīng)滿足的條件： 1)1)不會影響探針的主要理化性質(zhì)；不會影響探針的主要理化性質(zhì)； 2)2)檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復(fù)性好；檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復(fù)性好； 3)3)操作簡便、省時經(jīng)濟實用：操作簡便、省時經(jīng)濟實用： 4)4)化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長期保存；化學(xué)穩(wěn)定性高、易于長期保存； 5)5)安全、無環(huán)境污染。安全、無環(huán)境污染。 常用于分子雜交的探針標記物分常用于分子雜交的探針標記物分放射性放射性及及非放射性。非放射性。（2 2）探針標記物）探針標記

31、物 放射性標記物放射性標記物是指以放射性同位素對核苷酸等進行標記后的產(chǎn)物，常見的放射是指以放射性同位素對核苷酸等進行標記后的產(chǎn)物，常見的放射性同位素有性同位素有3232P P、3 3H H、3535S S、1414C C、125125I I等，其中以等，其中以3232P P、3 3H H、3535S S最為常用。最為常用。 標記物放射性的檢測主要使用標記物放射性的檢測主要使用蓋革計數(shù)器蓋革計數(shù)器和和液體閃爍計數(shù)器液體閃爍計數(shù)器等等射線探測儀射線探測儀來完來完成。成。 放射性標記物 非放射性標記物的最大優(yōu)勢是非放射性標記物的最大優(yōu)勢是無放射性污染，分辨力高，穩(wěn)定性好，可以較長無放射性污染，分辨力

32、高，穩(wěn)定性好，可以較長時間保存使用，時間保存使用，但與放射性探針相比，但與放射性探針相比，多數(shù)非放射性探針的敏感性及特異性較多數(shù)非放射性探針的敏感性及特異性較差差。 目前已廣泛應(yīng)用的非放射性標記物有：目前已廣泛應(yīng)用的非放射性標記物有： 生物素生物素(biotin)(biotin)標記的核苷酸、標記的核苷酸、 地高辛地高辛(digoxigenin)(digoxigenin)標記的核苷酸標記的核苷酸 熒光素熒光素(fluorescein)(fluorescein)標記的核苷酸標記的核苷酸非放射性標記物（3 3）探針標記方法）探針標記方法 探針的標記有探針的標記有體內(nèi)標記體內(nèi)標記及及體外標記體外標記

33、兩種方法。兩種方法。 體內(nèi)標記法體內(nèi)標記法是以標記化合物作為代謝底物，通過活體生物或活細胞的體內(nèi)代謝完成核酸分子標記，例如在是以標記化合物作為代謝底物，通過活體生物或活細胞的體內(nèi)代謝完成核酸分子標記，例如在培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入3 3H-H-胸苷，就可以標記到生長在該培養(yǎng)基中的活細胞胸苷，就可以標記到生長在該培養(yǎng)基中的活細胞DNADNA分子上。分子上。 體內(nèi)標記法受多種因素的限制，且標記活性不高，一般很少使用。體內(nèi)標記法受多種因素的限制，且標記活性不高，一般很少使用。 體外標記體外標記 包括包括化學(xué)法化學(xué)法和和酶法酶法兩種。兩種。 化學(xué)標記法化學(xué)標記法是利用標記物的活性基團與核酸分子是利用標

34、記物的活性基團與核酸分子中的某種基因中的某種基因( (如磷酸基團如磷酸基團) )發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而直接發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而直接將標記物連接到探針分子上，具有簡單快速、標將標記物連接到探針分子上，具有簡單快速、標記均勻的特點，尤其適于制備記均勻的特點，尤其適于制備非放射性標記物非放射性標記物的的探針。探針。 酶標記法則酶標記法則是先將標記物標記在核苷酸上，然后是先將標記物標記在核苷酸上，然后通過酶促聚合反應(yīng)使帶標記的核苷酸摻入到核酸通過酶促聚合反應(yīng)使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列中，獲得核酸探針。序列中，獲得核酸探針。酶法應(yīng)用廣泛，適于制酶法應(yīng)用廣泛，適于制備所有放射性標記探針及部分非放射性標記探針備所有放

35、射性標記探針及部分非放射性標記探針。 常用的酶法有常用的酶法有DNADNA缺口平移標記法、缺口平移標記法、DNADNA隨機引物隨機引物標記法、標記法、DNADNA末端標記法末端標記法及及PCRPCR標記法標記法等。等。 切口平移標記法切口平移標記法(nick thanslation labeling) (nick thanslation labeling) DNA聚合酶聚合酶該法標記模板鏈該法標記模板鏈隨機引物標記法隨機引物標記法 (random primed DNA labeling)(random primed DNA labeling)Klenow片段催化片段催化該法標記模板互補鏈該法標

36、記模板互補鏈隨機引物隨機引物是含有各種可能排列的是含有各種可能排列的寡核苷酸片段的混合物。寡核苷酸片段的混合物。 隨機引物：隨機引物：4 46 6 使用隨機引物標記的探針一般長使用隨機引物標記的探針一般長400-600400-600個核苷酸，具多種序列，但都與模板互個核苷酸，具多種序列，但都與模板互補。補。 與切口平移法不同的是，該方法標記的是模板互補鏈，而非模板本身。與切口平移法不同的是，該方法標記的是模板互補鏈，而非模板本身。 末端標記法末端標記法(DNA terminal labeling)(DNA terminal labeling) 該法標記的是線性該法標記的是線性DNADNA或或R

37、NARNA的的5 5端或端或3 3端，屬端，屬非均一性標記。非均一性標記。 1)31)3凸出末端的加尾標記法：凸出末端的加尾標記法：末端脫氧核苷酸末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶將帶有標記的轉(zhuǎn)移酶將帶有標記的dGTPdGTP或或dCTPdCTP加到加到DNA3DNA3-OH-OH端端 2)2)雙鏈雙鏈DNA3DNA3隱蔽末端的填充標記隱蔽末端的填充標記：（若反應(yīng)體：（若反應(yīng)體系存在全部與模板序列互補的系存在全部與模板序列互補的dNTPdNTP）以凸出序）以凸出序列為模板，列為模板，KlenowKlenow酶或酶或T4DNAT4DNA連接酶催化補平連接酶催化補平3 3末端（若一種末端（若一種dNTPdNTP

38、帶標記則成為探針）。帶標記則成為探針）。 3)53)5末端標記末端標記：T4T4多聚核苷酸激酶將多聚核苷酸激酶將ATPATP的標記的標記的的-磷酸基團轉(zhuǎn)移到游離的磷酸基團轉(zhuǎn)移到游離的5 5-OH-OH上。上。 PCRPCR標記法標記法(PCR labeling)(PCR labeling)：標記的一種：標記的一種dNTP dNTP 光敏標記法光敏標記法 化學(xué)衍生結(jié)合標記法化學(xué)衍生結(jié)合標記法：生物素和地高辛等非放生物素和地高辛等非放射性標記物可以與事先經(jīng)過化學(xué)修飾得到的核酸衍射性標記物可以與事先經(jīng)過化學(xué)修飾得到的核酸衍生物更加牢固地結(jié)合，進行非放射性探針的制備。生物更加牢固地結(jié)合，進行非放射性探

39、針的制備。常用的化學(xué)修飾反應(yīng)包括磺化、轉(zhuǎn)氨、溴化等反應(yīng)常用的化學(xué)修飾反應(yīng)包括磺化、轉(zhuǎn)氨、溴化等反應(yīng)類型類型。 交叉相連標記法：交叉相連標記法：利用一些高分子化合物，利用一些高分子化合物，如細胞色素如細胞色素c c、組蛋白、組蛋白H1H1及大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋及大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)等能與核酸結(jié)合的特性，制備相應(yīng)的探針。白質(zhì)等能與核酸結(jié)合的特性，制備相應(yīng)的探針。四、四、 DNADNA序列測定法（錄像）序列測定法（錄像） DNADNA序列測定，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，簡稱序列測定，即核酸一級結(jié)構(gòu)的測定，簡稱DNADNA測序。測序。 對克隆對克隆DNADNA片段進行序列測定及分析片段進行序列測定及分析:

40、 :可以直觀地鑒定出重組可以直觀地鑒定出重組DNADNA分子中是否含有目的基因分子中是否含有目的基因; ;可以獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列可以獲得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列. .這對目的基因的表達及其功能研究具有重要意義。這對目的基因的表達及其功能研究具有重要意義。DNADNA序列分析序列分析目前用于測序的技術(shù)主要有目前用于測序的技術(shù)主要有: :SangerSanger等（等（19751975）發(fā)明的）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法雙脫氧鏈末端終止法MaxamMaxam和和GilbertGilbert（19771977）發(fā)明的）發(fā)明的化學(xué)降解法?；瘜W(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，

41、但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生某一個特定的堿基處終止，產(chǎn)生A A，T T，C C，G G四組不同長度的一系列核苷酸，然四組不同長度的一系列核苷酸，然后在后在尿素變性的尿素變性的PAGEPAGE膠膠上電泳進行檢測，從而獲得上電泳進行檢測，從而獲得DNADNA序列。序列。目前目前SangerSanger測序法得到了廣泛的應(yīng)用。測序法得到了廣泛的應(yīng)用。 1 DNA1 DNA的化學(xué)降解測序法的化學(xué)降解測序法 DNADNA的化學(xué)降解測序的化學(xué)降解測序法法也叫也叫Maxam-GilbertMaxa

42、m-Gilbert測序測序法法 基本原理基本原理是，將待測是，將待測DNADNA分子進行末端放射性標分子進行末端放射性標記，然后置于記，然后置于4 4組獨立的化學(xué)反應(yīng)體系中分別進組獨立的化學(xué)反應(yīng)體系中分別進行部分降解，其中每一組反應(yīng)特異性地針對某行部分降解，其中每一組反應(yīng)特異性地針對某一堿基或某一類堿基。通過化學(xué)降解一段時間一堿基或某一類堿基。通過化學(xué)降解一段時間后，在每一組反應(yīng)體系中，生成各種不同長度后，在每一組反應(yīng)體系中，生成各種不同長度的、一端為放射性標記固定的寡聚核苷酸分子，的、一端為放射性標記固定的寡聚核苷酸分子，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影檢測后可經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯

43、影檢測后可以讀出待測以讀出待測DNADNA分子的堿基序列。分子的堿基序列。（2 2）堿基切割反應(yīng)體系）堿基切割反應(yīng)體系 進行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)的試劑是硫酸二進行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)的試劑是硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）以及哌啶（六氫吡啶）。甲酯、肼（聯(lián)氨）以及哌啶（六氫吡啶）。硫酸二甲酯硫酸二甲酯、肼（聯(lián)氨）肼（聯(lián)氨）堿基進行化學(xué)修飾；堿基進行化學(xué)修飾；哌啶哌啶從修飾堿基處斷裂核苷酸鏈。從修飾堿基處斷裂核苷酸鏈。 在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三在不同的酸、堿、高鹽和低鹽條件下，三種化學(xué)試劑按不同的組合能特異地切割核苷酸序種化學(xué)試劑按不同的組合能特異地切割核苷酸序列中的特定堿基，降解待測模板

44、列中的特定堿基，降解待測模板DNADNA分子。分子。硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMSDMS）：）： G G；pH2pH2甲酸哌啶：甲酸哌啶： G+AG+A; ;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）：）： C+TC+T; ;肼（肼（NH2NH2NH2NH2）+ +高鹽：高鹽： C C1、待測模板、待測模板的制備的制備3、待測模板、待測模板DNA分子的分子的序列分析序列分析2、化學(xué)降解、化學(xué)降解待測模板待測模板DNA分子分子測序步驟 化學(xué)降解測序法不僅適于化學(xué)降解測序法不僅適于單鏈單鏈DNADNA，也適于也適于雙雙鏈鏈DNADNA的測序，主要用于研究的測序，主要用于研究DNADNA的一級和二的一級和二

45、級結(jié)構(gòu)、級結(jié)構(gòu)、DNADNA甲基化位點測定和甲基化位點測定和DNA-DNA-蛋白質(zhì)相蛋白質(zhì)相互作用等方面，結(jié)果準確可靠，是互作用等方面，結(jié)果準確可靠，是DNADNA測序的測序的基本方法之一?；痉椒ㄖ弧?它的它的缺點是一輪反應(yīng)所能測定模板缺點是一輪反應(yīng)所能測定模板DNADNA長度只長度只有有250bp250bp左右，若測定大片段左右，若測定大片段DNADNA分子時，操分子時，操作較為繁瑣費時。作較為繁瑣費時。另外，化學(xué)降解測序法另外，化學(xué)降解測序法不能不能在載體上直接進行，在載體上直接進行，標記后的模板標記后的模板DNADNA分子難分子難以純化。以純化。2 DNA的雙脫氧鏈終止測序法 雙脫氧

46、鏈終止測序法是由雙脫氧鏈終止測序法是由SangerSanger等在加減法的基礎(chǔ)上建立的一種簡單快速的等在加減法的基礎(chǔ)上建立的一種簡單快速的DNADNA序列分析法，故也稱為序列分析法，故也稱為SangerSanger測序法測序法。有時又稱為。有時又稱為引物合成法引物合成法，或，或酶促引物合成酶促引物合成法法，因為該法是以待測，因為該法是以待測DNADNA分子為模板，在分子為模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，利用適當?shù)牡淖饔孟拢眠m當?shù)腄NADNA合成引物進行合成引物進行DNADNA互補鏈的合成互補鏈的合成來完成測序工作的。來完成測序工作的。 基本原理基本原理：DNADNA聚合酶能夠利用

47、單鏈聚合酶能夠利用單鏈DNADNA作模板，合成出對應(yīng)的作模板，合成出對應(yīng)的DNADNA互補鏈，但在互補鏈，但在反應(yīng)過程中，如果反應(yīng)過程中，如果2 2，3 3- -雙脫氧核糖核苷三磷酸底物雙脫氧核糖核苷三磷酸底物（ddNTPddNTP）摻入到寡核苷）摻入到寡核苷酸鏈的酸鏈的3 3端，端，DNADNA鏈的延伸反應(yīng)即被終止。鏈的延伸反應(yīng)即被終止。 ddNTPddNTP鏈終止核苷酸鏈終止核苷酸 在在4 4個特定反應(yīng)體系中個特定反應(yīng)體系中分別加入一種分別加入一種ddNTPddNTP反應(yīng)反應(yīng)底物（底物（ddCTPddCTP、ddATPddATP、ddGTPddGTP、ddTTPddTTP）以及）以及DNA

48、DNA模板、合成引物、模板、合成引物、DNADNA聚合酶聚合酶I I、一定濃度的、一定濃度的dNTPdNTP（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP，其中有一種，其中有一種是帶是帶3232P P放射性標記的），放射性標記的），DNADNA鏈的合成隨機終鏈的合成隨機終止于某一特定止于某一特定ddNTPsddNTPs。最后通過聚丙烯酰胺凝。最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影技術(shù)讀出待測膠電泳和放射自顯影技術(shù)讀出待測DNADNA模板的堿模板的堿基序列?；蛄小?雙脫氧鏈終止測序法的精確度較高，絕大多數(shù)雙脫氧鏈終止測序法的精確度較高，絕大多數(shù)以單純測定以單純測定DN

49、ADNA序列為目的的實驗室均采用此法。序列為目的的實驗室均采用此法。 此法讀取的堿基序列是待測此法讀取的堿基序列是待測DNADNA模板的互補鏈，模板的互補鏈，而非模板鏈本身。而非模板鏈本身。ddNTP （2 2）雙脫氧核糖核苷三磷酸的作用機）雙脫氧核糖核苷三磷酸的作用機制制 2 2，3 3- -雙脫氧核糖核苷三磷酸（雙脫氧核糖核苷三磷酸（ddNTPddNTP）的分子結(jié)構(gòu)式與的分子結(jié)構(gòu)式與2 2- -脫氧核糖核苷三磷酸（脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPdNTP）極為相似，惟一的區(qū)別是，極為相似，惟一的區(qū)別是，ddNTPddNTP在脫氧核糖的在脫氧核糖的3 3位置上缺少一個羥基。位置上缺少一個羥基。

50、在在DNADNA鏈的合成過程中，鏈的合成過程中，ddNTPddNTP可以利用可以利用其其5 5- -磷酸基團與磷酸基團與DNADNA鏈上的游離羥基基團形成鏈上的游離羥基基團形成磷酸二酯鍵而使鏈得以延伸，但是由于磷酸二酯鍵而使鏈得以延伸，但是由于ddNTPddNTP缺缺少少3 3-0H-0H基團，不能與下一個底物分子的基團，不能與下一個底物分子的5 5- -磷磷酸基團進行反應(yīng)，因此新生的寡核酸鏈一旦加酸基團進行反應(yīng)，因此新生的寡核酸鏈一旦加入入ddNTPddNTP，DNADNA鏈的合成就會終止。鏈的合成就會終止。（3 3）待測模板）待測模板DNADNA分子的制備分子的制備 限制性核酸內(nèi)切酶消化切

51、割形成限制性核酸內(nèi)切酶消化切割形成DNADNA小片段小片段 隨機地克隆到一種合適的載體分子上隨機地克隆到一種合適的載體分子上 經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后得到含有同一來源經(jīng)轉(zhuǎn)化篩選后得到含有同一來源DNADNA片段的重組片段的重組子克隆后代子克隆后代 以此大量制備重組以此大量制備重組DNADNA分子，直接用于分子，直接用于DNADNA測序測序需要需要 因為新生因為新生DNADNA鏈的合成反應(yīng)是從引物鏈的合成反應(yīng)是從引物3 3端定向進行的，無須將待測端定向進行的，無須將待測DNADNA片片段從載體上切下。段從載體上切下。 事實上，載體的存在不但不會影響測序的結(jié)果，反而有利于測序的進行，事實上，載體的存在不但不會

52、影響測序的結(jié)果，反而有利于測序的進行，因為在實際操作中，因為在實際操作中，引物往往是與載體克隆位點的兩側(cè)序列互補引物往往是與載體克隆位點的兩側(cè)序列互補，這樣可以測，這樣可以測定完整的定完整的DNADNA序列。序列。 M13M13載體載體能克隆單鏈能克隆單鏈DNADNA分子，制備的產(chǎn)物可直接分子，制備的產(chǎn)物可直接用作引物合成反應(yīng)中的單鏈模板，同時，由于待測用作引物合成反應(yīng)中的單鏈模板，同時，由于待測DNADNA片片段均被克隆在段均被克隆在M13M13載體的同一個特定區(qū)段內(nèi)，載體的同一個特定區(qū)段內(nèi)，所有的待測所有的待測DNADNA片段，都可以使用同一種引物，即片段，都可以使用同一種引物，即M13M

53、13載體克隆位點載體克隆位點兩側(cè)的通用引物（兩側(cè)的通用引物（universal primeruniversal primer）進行）進行DNADNA鏈的合鏈的合成延伸成延伸，避免了因合成和分離各種不同引物而導(dǎo)致的許，避免了因合成和分離各種不同引物而導(dǎo)致的許多麻煩。多麻煩。 因此，因此，M13M13載體雙脫氧鏈終止法目前已經(jīng)成為一種載體雙脫氧鏈終止法目前已經(jīng)成為一種普遍采用的快速普遍采用的快速DNADNA序列分析法。序列分析法。 19851985年年ChenChen和和SeeburgSeeburg為了提高為了提高DNADNA測序速度建立。測序速度建立。 該法是將待測定的該法是將待測定的DNADN

54、A片段克隆到質(zhì)粒載體上，片段克隆到質(zhì)粒載體上，直接用直接用閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒閉合環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒DNADNA按雙脫氧鏈終止法測定按雙脫氧鏈終止法測定模板模板DNADNA序列。由于通常使用的質(zhì)粒是序列。由于通常使用的質(zhì)粒是PUCPUC載體系列，載體系列，所以又稱之為所以又稱之為SangerSanger雙脫氧鏈終止雙脫氧鏈終止-pUC-pUC體系體系DNADNA序列分序列分析法。析法。 這種方法的最大這種方法的最大優(yōu)點優(yōu)點是，它無須將是，它無須將DNADNA克隆到克隆到M13M13載體載體分子上，而是直接用堿變性的雙鏈閉合環(huán)形的重組質(zhì)粒分子上，而是直接用堿變性的雙鏈閉合環(huán)形的重組質(zhì)粒DNADNA作為

55、模板進行序列分析，因此比作為模板進行序列分析，因此比M13M13法更為簡單快法更為簡單快速，實用價值高。速，實用價值高。針對雙鏈DNA模板進行的雙脫氧鏈終止測序法（4 4）測序反應(yīng)物的合理應(yīng)用）測序反應(yīng)物的合理應(yīng)用 雙脫氧鏈終止測序法的雙脫氧鏈終止測序法的操作關(guān)鍵操作關(guān)鍵：是：是ddNTPddNTP與與dNTPdNTP的用量比例的用量比例，兩者較為理想的，兩者較為理想的分子比在分子比在1 1：3 3至至1 1：4 4之間。之間。 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶KlenowKlenow片段、測序酶（經(jīng)過改造的片段、測序酶（經(jīng)過改造的T7T7噬菌體聚合酶）、噬菌體聚合酶）、TaqDNAT

56、aqDNA聚合酶聚合酶 DNADNA序列分析中通常采用序列分析中通常采用-3535S SdATPdATP代替代替-3232P PdNTPdNTP，以便獲得更高的分，以便獲得更高的分辨率。辨率。3 3 大片段大片段DNADNA的測序策略的測序策略 DNADNA測序通常包括測序通常包括克隆、測序反應(yīng)和讀序克隆、測序反應(yīng)和讀序三個步驟。三個步驟。 前述兩種前述兩種DNADNA測序方法中，一次測序能直接讀出測序方法中，一次測序能直接讀出的的DNADNA序列長度受到序列長度受到聚丙烯酰胺凝膠分離效果聚丙烯酰胺凝膠分離效果的限制，的限制，一般情況下，最大限度不超過一般情況下，最大限度不超過350350個堿

57、基序列。因此，個堿基序列。因此，對于較大的對于較大的DNADNA片段而言，必須將其分成較小的片段分片段而言，必須將其分成較小的片段分別測序，才能獲得完整的堿基序列。別測序，才能獲得完整的堿基序列。 選擇選擇恰當?shù)臏y序策略恰當?shù)臏y序策略將直接關(guān)系到大片段將直接關(guān)系到大片段DNADNA或或基因組基因組DNADNA序列分析的工作效率。序列分析的工作效率。 隨機克隆策略隨機克隆策略 又叫又叫鳥槍法克隆策略鳥槍法克隆策略，先將克隆，先將克隆DNADNA片段用超聲片段用超聲波打斷或波打斷或DNADNA酶酶切斷，隨機亞克隆到切斷，隨機亞克隆到M13M13載體載體上，分別進行上，分別進行DNADNA序列測定，

58、然后利用計算機進序列測定，然后利用計算機進行數(shù)據(jù)分析，排出完整的行數(shù)據(jù)分析，排出完整的DNADNA序列。序列。 鳥槍法的缺點鳥槍法的缺點隨機亞克隆易造成序列重復(fù)測定，也易丟失某隨機亞克隆易造成序列重復(fù)測定，也易丟失某些序列；些序列；測序及測序后的數(shù)據(jù)處理和分析工作量大，并測序及測序后的數(shù)據(jù)處理和分析工作量大，并需要計算機幫助進行排序才能得到完整的序列。需要計算機幫助進行排序才能得到完整的序列。 引物步移策略引物步移策略 將待測將待測DNADNA片段克隆在片段克隆在質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從上，利用引物步移延伸，從DNADNA片段的一端開始片段的一端開始逐步進行序列測定，直到另一端

59、為止。逐步進行序列測定，直到另一端為止。 引物步移法克服了鳥槍法的盲目性，并省去亞引物步移法克服了鳥槍法的盲目性，并省去亞克隆制備的繁瑣步驟，也減輕了隨后數(shù)據(jù)分析克隆制備的繁瑣步驟，也減輕了隨后數(shù)據(jù)分析的工作量。的工作量。 但由于測定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列但由于測定下一段序列前要預(yù)先知道上游序列的堿基序列，才能合成適當?shù)囊镞M行測序，的堿基序列，才能合成適當?shù)囊镞M行測序，因此因此該策略難以自動化操作該策略難以自動化操作。此外，引物合成。此外，引物合成費時費力，再加上目前常用的費時費力，再加上目前常用的質(zhì)粒載體不易純質(zhì)粒載體不易純化化等也都影響了該法的實施。等也都影響了該法的實施。 最

60、近的研究表明最近的研究表明：隨機引物：隨機引物可作為引物步移法可作為引物步移法中的測序引物，例如采用線性連接的中的測序引物，例如采用線性連接的3 3條條6 6堿基堿基的隨機引物即可很好地引導(dǎo)測序反應(yīng)，這些結(jié)的隨機引物即可很好地引導(dǎo)測序反應(yīng)，這些結(jié)果為引物步移法的自動化帶來可能。果為引物步移法的自動化帶來可能。定向缺失克隆策略定向缺失克隆策略 利用核酸外切酶利用核酸外切酶、Bal31Bal31或或T4 DNAT4 DNA聚合酶等聚合酶等酶解方法，從克隆酶解方法，從克隆DNADNA片段一側(cè)進行片段一側(cè)進行不同時間的不同時間的定向缺失，逐步縮短定向缺失，逐步縮短DNADNA片段大小，分別回收并片段大