生化分析知識點總結(jié)

1、一. 氨基酸1八種必須氨基酸的英文命名及縮寫。賴氨酸 Lysine Lys K甲硫氨酸 Methionine Met M繳氨酸 valine Val V異亮氨酸 isoleucine Ile I苯丙氨酸 phenylaninePhe F亮氨酸 leucine Leu L色氨酸 tryptophanTry W蘇氨酸 threoninethrT2倆種氨基酸組成多肽時，有幾種？成二肽，有四種成三肽時，有八種(僅供參考，不一定正確，有不同意見請指出來)。二酶分析1酶活性的定義，國際常用的單位：酶活性(enzyme activity)也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)速率，即規(guī)定條件下在單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或底

2、物的減少量。酶活性單位：表示酶的相對含量，指在一定條件下，單位時間內(nèi)牛成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。a.國際單位 IU ( " mol/mir)定義：在規(guī)定條件下(25 C及其他最適條件)，每分鐘催化lmol 底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為 1IU或1U。1IU=1 w mol/minbB. Katal 單位（mol/s）定義：IKatal是在規(guī)定條件下，每秒鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量。1Katal= 1mol/s。IU 與 Katal單位的關(guān)系：Ikatal = 60x 106IU,1IU = 16.67nkatal3酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)的歷程：延滯期，線性期，非線性

3、期a.酶促反應(yīng)式：lei口E + 3* ES + P/.酶 底物酶'屬物復合物嚼 產(chǎn)物，B.米氏方程A S，+SC. Km的含義與意義.Km的含義:當Km=S時，2 可見Km值等于反應(yīng)速率達到最大反應(yīng)速率Vmax一半時的底物濃度。Km的意義：Km是酶的一個特征性常數(shù)(其他如等電點)，Km的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)反映酶對底物親和力的大小選擇酶的最適底物或天然底物計算不同底物濃度時的反應(yīng)程度鑒別酶的種類判斷可逆反應(yīng)的速率判斷酶偶聯(lián)反應(yīng)的限速反應(yīng)計算工具酶的用量3 .兩種測定酶活性的方法：a.定時法原理：定時法是固定時間法的簡稱，是指測定反應(yīng)開始后一段時間(t1t2)產(chǎn)物的增加量或底物的減少量

4、以測定酶活性的方法。該方 法一般需要在反應(yīng)進行到一定時間后用強酸、 強堿、蛋白沉淀劑等終 止反應(yīng)。優(yōu)點：簡單、不需要保溫設(shè)備、不用考慮酶的活性。缺點：如果不做預試驗則無法了解其酶促反應(yīng)進程（t1-t2）是否 為零級反應(yīng)，故難以確保測定結(jié)果的準確性。b.連續(xù)檢測法：原理：連續(xù)監(jiān)測法是指在多個時間點連續(xù)測定產(chǎn)物（或底物）在線性期內(nèi)的生成量（或消耗量）即零級反應(yīng)速率以測定酶活性的方法，又稱 速率法、零級反應(yīng)速率法、斜率法。該方法是在一定的反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)（至少 9120s）每隔一定時 間（常為230s）讀取一次吸光度值，連續(xù)測定多點（至少 4點）, 然后對吸光度數(shù)據(jù)作最小二乘法處理，再用線性期內(nèi)的數(shù)據(jù)

5、計算單位 時間內(nèi)的反應(yīng)速率 A/min,最后計算出酶活性。A 106 Vtutu l Vu連續(xù)監(jiān)測法的特點：屬于即時觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添 加其他呈色試劑，可將多點的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶 促反應(yīng)進程，很容易找到呈直線的線性期；連續(xù)監(jiān)測法要求不顯色而是直接測定底物 （或輔助底物即中間底 物）或產(chǎn)物量的變化，因此，可以選擇紫外吸收法或生色原顯色法；能夠準確地控制溫度、pH值和底物濃度等，要求儀器具有恒溫 裝置及自動監(jiān)測功能，半自動及全自動生化分析儀都能滿足這些要求；測定結(jié)果常較定時法高4 .固定化酶和游離酶的優(yōu)點和缺點：a.固定化酶 優(yōu)點：增加了酶的活性和穩(wěn)定性可回收重復使用

6、，降低了酶耗 酶反應(yīng)過程便于控制 適用于連續(xù)反應(yīng) 易于反應(yīng)體系分離 對環(huán)境的耐受性增強 缺點：對酶的物理化學性質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。b.游離酶優(yōu)點：易溶于水 于底物的作用面積大，反應(yīng)充分 活性接近生理狀態(tài) 缺點：難與底物分離 反應(yīng)條件控制嚴格 不能反復利用，易失活 三蛋白質(zhì)分析1 . 蛋白質(zhì)的鹽析，變性及二者的區(qū)別鹽析：在蛋白質(zhì)溶液中加入某些無機鹽的濃溶液，使蛋白質(zhì)的溶解度下降而從溶液中析出來的現(xiàn)象。變性：在熱、重金屬、酸、堿、某些有機物等作用下，蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)和生理功能發(fā)生改變的現(xiàn)象，稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)鹽析和變性的區(qū)別與對比腦她即姍甜、M舶聯(lián)批理 嘛曲喻解垢，加WiW一砸翅 被4網(wǎng)挪舐先

7、姓騰2 .蛋白質(zhì)的序列分析：測得的是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的序列，一級結(jié)構(gòu)的作用力：肽鍵，S-S鍵。二級結(jié)構(gòu)：口-螺旋，（3-折疊，B-轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)形成的力量：氫鍵超二級結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結(jié)構(gòu)組合體是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位，在空間上彼此分隔，各自具有部分生物功能的結(jié)構(gòu)含 100200個氨基酸殘基，1 條長的多肽鏈首先折疊成幾個相對獨立的結(jié)構(gòu)域再締合成三級 結(jié)構(gòu)。三級結(jié)構(gòu)：由若干二級結(jié)構(gòu)單位，完全折疊后可組成一個完整的蛋白質(zhì)分子，即為三級結(jié)構(gòu)，可具有活性。三級結(jié)構(gòu)形成的力量：氫鍵，離子

8、鍵，疏水鍵，雙硫鍵3 .蛋白質(zhì)分子量的測定方法：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和凝膠過濾層析法。a.十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠色譜法： 基本原理：SDS可以破壞蛋白質(zhì)中的疏水鍵和氫鍵， 并按一定比例(1g蛋 白質(zhì)結(jié)合1.4g SDS和蛋白質(zhì)組成復合物，使蛋白質(zhì)帶的負電荷的量 遠遠超過其本身的電荷量，并與蛋白質(zhì)的分子量成正比。2-巰基乙醇破壞了蛋白質(zhì)二硫鍵，使蛋白質(zhì)呈橢圓棒形，其軸 長與分子量成正比。尸q/f=q/6 r ,所有蛋白質(zhì)的遷移率都相同。b.凝膠過濾層析法：原理：蛋白質(zhì)在凝膠過濾層析柱中的洗脫體積Ve,與其分子量的關(guān)系如下式所示：lgMr = K1K2

9、Ve在實驗中，只要測得幾種蛋白質(zhì)分子量標準物的Ve,并以它們 的lgMr對Ve作圖得一直線，再測出樣品的 Ve,即可從圖中得到樣品的分子量。倆者的聯(lián)系與關(guān)系：凝膠過濾法測得的是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)（如果它有的話）的分子量；SDS-PAG蒯得的是蛋白質(zhì)亞基的分子量；在有2-航基乙醇（或DTT）存在時，SDS-PAG圖測得蛋白質(zhì)每 條多肽鏈的分子量。綜合應(yīng)用這兩種方法，可得到待測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的許多信息。SDS-PAG自凝膠過濾法是互補的4 .兩種測定蛋白質(zhì)的方法：a.凱氏定氮法：蛋白質(zhì)+硫酸-CO2+H2O+NH3硫酸鏤+強堿-氨優(yōu)點：適用樣品廣泛，結(jié)果可靠缺點： 樣品中非蛋白態(tài)氨影響測定值；蛋白質(zhì)氨基酸

10、有偏差時（大量堿性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）誤差較大；操作繁瑣。b.紫外光譜吸收法：原理：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm 附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的A280 與其濃度呈正比，據(jù)此可進行蛋白質(zhì)定量測定。是一種快速簡便分析溶液中蛋白質(zhì)含量的的方法。計算方法：標準曲線法：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45 x A280-0.74 x A260注意事項：石英比色杯調(diào)零所用溶液光密度范圍四.抗原抗體，全抗原和半抗原的關(guān)系1 .抗原抗原是能夠引起免疫反應(yīng)的分子?？乖哂幸韵聝煞N特性：免疫原性(immunogenicity),即誘導刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體或

11、者激活淋巴細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，具有這種特性的物質(zhì)稱為免疫原(immunogen);抗原性(antigenicity ),指能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結(jié)合，引起免疫反應(yīng)的性能。全抗原：具有上述兩種特性的物質(zhì)稱為完全抗原。包括：蛋白質(zhì)，多糖，核酸，合成多肽，低分子物質(zhì)。半抗原：不能誘導產(chǎn)生抗體，但能和適當抗體起反應(yīng)，即有免疫反應(yīng) 性的簡單分子稱為半抗原。只具有抗原性。全抗原能引起機體的免疫反應(yīng)，半抗原不能引起機體的免疫反應(yīng)。2 .親和常數(shù)：免疫反應(yīng)：Ag+Ab'' Ag-Ab該免疫反應(yīng)遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學基本原理，其反應(yīng)式為Ab -Agki/=KAbA

12、gk2式中：Ab為游離的抗體結(jié)合位點的濃度；Ag為游離的抗原結(jié)合位 點的濃度；Ab-Ag為抗原-抗體復合物的濃度；ki為正反應(yīng)速率常數(shù)； k2為負反應(yīng)速率常數(shù)；K為反應(yīng)平衡常數(shù)（親和常數(shù)）?？乖涂贵w在體內(nèi)進行的反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)， 在體外進行的反 應(yīng)稱為血清學反應(yīng)。3 .酶聯(lián)免疫分析法（ELISA。酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA 原理使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面；抗原或抗體與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標抗原或抗體；在測定時，使受檢標本和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相抗原或固相抗體起反應(yīng)；用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合

13、物與其他物質(zhì)分開，結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例； 加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標本中受檢 物的量相關(guān)，用分光光度法進行定量。酶聯(lián)免疫分析法的流程洗板力nA晞曲力nA脆腿齦力也鼬封閉螞閉I測位則各孔 的OD值以檢測氯胺酮為例 i包被抗原（io和5 u g/ml 2洗滌 3加入氯胺酮抗體和氯胺酮小分子 4洗滌 5加酶標抗體-HRP標記羊抗兔IgG 6洗滌 7加底物顯色、終止 8觀察結(jié)果4 .時間分辨熒光分析法TRFIA所用的標記物是鐲系元素螯合物，利用這類熒光物質(zhì)熒 光壽命長及Stokes位移大的特點，通過波長和時間兩種分辨技術(shù)，有 效排除了非特異本底

14、熒光的干擾，具有靈敏度高，標記物制備簡單， 穩(wěn)定性好，標準曲線線性范圍寬，操作方便的優(yōu)點。5 .單克隆抗體和多克隆抗體的比較:比較項目塞克隆抗體CPcAb)單克隆抗體CMAb>免疫原孽求免疫原純受高，抗體 純度才能高不純的免疫原可以獲得高純度抗體抗體產(chǎn)生細胞多克隆性單克隆性均質(zhì)性高度異質(zhì)高度純質(zhì)特異性技高.與抗原上多種決定朝臺高,與抗原上特定決定鎮(zhèn)結(jié)合穩(wěn)定性較好相對較差，對理化條件敏感標準化較難不同批次的抗體.威 量差異大昌于標準化，批次間差異小交叉反應(yīng)很常見.難避免非特異性 反應(yīng)不常見.可避免非特異反應(yīng)沉淀反應(yīng)有參數(shù)沒有實用的血清學試監(jiān)數(shù)血清學試驗一種或多種，需適當選擇供應(yīng)量有RL無限

15、有效抗體含量0.1*0 2小鼠腹水2_m nig4nl無效但含量10.G-I5.0 inml體外培養(yǎng)一般沒有,小鼠腹水 0 5-5.0 mg ml其它正清蛋白存在悻外培養(yǎng)可能有少量小牛血清 蛋白, 小附腹水有少量晶蛋白6 .設(shè)計合適的方案檢測生活中的小分子有機物。五，核酸（DNA和RNA1. DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，RNA是單鏈的！DNA:ATGCRNA: AUGC2. PCR勺意義和簡單操作流程意義：PCR（Polymerase chain reaction）是用一對寡聚 DNA作為引物，通過加溫變性退火DNA 合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的

16、，經(jīng)25 30 個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達106.流程： （一）原理雙鏈DNA通過高溫變性解離成互補單鏈 DNA變性與一對寡核苷酸引物（5， 3）降低溫度退火DNA加熱變性+引物慢慢冷卻使其結(jié)合，形象地稱為退火適溫延伸5 /3引物形成新鏈變成 4條鏈 DNA 延伸第二輪：變性一退火一延伸 呈指數(shù)增長理論值：一輪一倍10輪103=1000倍20 輪 10630 輪 109理論模板擴增30輪1ng1g實際模板擴增30輪1ng10g模板DNA經(jīng)加熱至93c左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或 經(jīng)PCRT增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后

17、，溫度降至55 c左右，引物與模 板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；DNA模板一引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為 反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈.每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴 增放大幾百萬倍.3. DNA測序的倆種方法基本原理：a. sanger雙脫氧鏈終止法：引入了雙脫氧核甘三磷酸（2' ,3' -ddNTB作為鏈終止劑；2' ,3' -ddNTP與普通的dNTP不同之處在于前者的脫氧核糖的 3'位 又少了個羥基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核甘酸鏈的 3&

18、#39;羥 基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止；在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的dNTP外，再加入一種少量的ddNTP， 反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長短不一的核苷酸鏈。在 4組獨立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP,結(jié)果將生成4 組核甘酸鏈，它們將分別終止于每一個 A,每一個G,每一個C,每 一個T的位置上。對這4組核甘酸鏈進行聚丙烯酰胺凝膠電泳， 就可 讀出序列 .bGillbert 化學裂解法：將 DNA 片段的5端磷酸基作放射性標記，再分別采用不同的化學方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長度不一而5' 端被標記的 DNA

19、 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的DNA 的堿基序列 .4. 分子印記的原理和流程：（一） Southern Blot原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針 洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的 片段及其相對大小.DNA 一瓊脂糖電泳印跡轉(zhuǎn)移 預雜交雜交（變性探針）

20、一洗膜一放射自顯影或顯色 用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài)，如是否有點突變、擴增重排等.（二）Northern Blot原理：在變性條件下將待檢的 RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼 而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測.操作過程mRNA提取甲醛變性電泳1k印跡轉(zhuǎn)移 1k預雜交一雜交（變性探針）一洗膜一 放射自顯影或化學發(fā)光。用途：檢測樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。六生物大分子。1 .倆種分離純化蛋白質(zhì)的方法：a。反向高效液相色譜蛋白質(zhì)分子中既有親水性基團（-OH, -NH、-COOH SH等），也有疏水性基團（如苯環(huán)、-C

21、H3 -CH2和-CH等）.不同的蛋白質(zhì)在相同流動相中由于疏水基團多少、種類以及表面分布情況不同，與填料的親合力也不同，從而得到分離.結(jié)果： 疏水性強的蛋白質(zhì)親合力大,出峰遲;疏水性小的蛋白質(zhì)就容易被洗脫.其分離蛋白質(zhì)和酶等生物大分子具有速度快、分離性能好，重復性好，溶劑和流動相易除去等優(yōu)點. 在所有的液相色譜法中反相色譜的分離性能.缺點是很多蛋白質(zhì)或酶在分離過程中失活，而且回收的樣品中總含有有機溶劑.b.凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩，是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種方法.其機理是分子篩效應(yīng)。在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外；而小分子可以進入凝膠顆粒內(nèi)部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開.它具有分離條件溫和，產(chǎn)品收率高，生物活性好，分離面寬等優(yōu)