龜甲膠、鹿角膠添加牛皮源、驢皮源成分檢測方法解讀(給學(xué)員)

1、膠類藥材檢測新方法培訓(xùn)膠類藥材檢測新方法培訓(xùn)程顯隆程顯隆聯(lián)系電話：聯(lián)系電話：010-67095432010-67095432QQ:33965568QQ:33965568微信：微信：wxid_lncxlwxid_lncxlE-mailE-mail：; 培訓(xùn)內(nèi)容培訓(xùn)內(nèi)容 標(biāo)準(zhǔn)解讀標(biāo)準(zhǔn)解讀 樣品制備樣品制備 質(zhì)譜條件優(yōu)化質(zhì)譜條件優(yōu)化 結(jié)果判斷示例結(jié)果判斷示例一、標(biāo)準(zhǔn)解析一、標(biāo)準(zhǔn)解析膠類補充檢驗方法批準(zhǔn)件膠類補充檢驗方法批準(zhǔn)件一、標(biāo)準(zhǔn)解析一、標(biāo)準(zhǔn)解析膠類藥材鑒別項（中國藥典膠類藥材鑒別項（中國藥典2015版公示品種）版公示品種） 龜甲膠 鹿角膠 阿膠鑒別項與補充檢驗方法的目的鑒別項與補充檢驗方法的目的

2、鑒別項鑒別項 阿阿 膠膠阿膠特征離子阿膠特征離子 鹿角膠鹿角膠鹿角膠特征離子鹿角膠特征離子 龜甲膠龜甲膠龜甲膠特征離子龜甲膠特征離子補充檢驗方法補充檢驗方法 阿阿 膠膠牛皮特征離子牛皮特征離子 鹿角膠鹿角膠驢皮特征離子驢皮特征離子 牛皮特征離子牛皮特征離子 龜甲膠龜甲膠驢皮特征離子驢皮特征離子 牛皮特征離子牛皮特征離子【檢查】【檢查】 牛皮源成分牛皮源成分 照高效液相色譜-質(zhì)譜法（中國藥典2010年版一部附錄 D和二部附錄 J）測定。 色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱內(nèi)徑2.1mm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動

3、相B，梯度洗脫：025分鐘，A 95%80%，B 5%20%；2540分鐘，A 80%50%，B 20%50%。流速為0.3ml/min。以質(zhì)譜作為檢測器，電噴霧離子源：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），選擇m/z 641.3（雙電荷）726.2和m/z 641.3（雙電荷）783.3為檢測離子對。取牛皮源成分參比溶液，進(jìn)樣5l，m/z 641.3（雙電荷）726.2和m/z 641.3（雙電荷）783.3的MRM色譜峰的信噪比均應(yīng)大于3:1。 牛皮源成分參比溶液的制備牛皮源成分參比溶液的制備 取黃明膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氫銨 溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1

4、%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，用0.22m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1ml中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配) 10l, 搖勻，37恒溫酶解12小時，即得。 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“

5、用0.22m微孔濾膜濾過”起，照牛皮源成分參比溶液的制備方法同法操作，即得。 測定法測定法 分別吸取牛皮源成分參比溶液與供試品溶液各5l，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 以m/z 641.3（雙電荷）726.2和m/z 641.3（雙電荷）783.3提取的供試品離子流色譜中，應(yīng)不得同時出現(xiàn)與牛皮源成分參比溶液色譜保留時間一致的色譜峰；若同時出現(xiàn)，則供試品色譜中m/z 641.3（雙電荷）726.2的色譜峰面積值應(yīng)不得大于參比溶液中相應(yīng)的峰面積值。 驢皮源成分驢皮源成分 照高效液相色譜-質(zhì)譜法（中國藥典2010年版一部附錄 D和二部附錄 J）測定。 色譜、質(zhì)譜條件與

6、系統(tǒng)適用性試驗色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱內(nèi)徑2.1mm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：025分鐘，A 95%80%，B 5%20%；2540分鐘，A 80%50%，B 20%50%。流速為0.3ml/min。以質(zhì)譜作為檢測器，電噴霧離子源：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），選擇m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8作為檢測離子對。取驢皮源成分參比溶液，進(jìn)樣5l，m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8的MRM色譜峰的信噪比均應(yīng)大于3:1。 驢皮源

7、成分參比溶液的制備驢皮源成分參比溶液的制備 取阿膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，用0.22m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液（取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1ml中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配）10l, 搖勻，37恒溫酶解12小時，即得。 供試品溶液的制備供試

8、品溶液的制備 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1% 碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“用0.22m微孔濾膜濾過”起，照驢皮源成分參比溶液的制備方法同法操作，即得。 測定方法測定方法 分別吸取驢皮源成分參比溶液與供試品溶液各5l，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 以m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8提取的供試品離子流色譜中，應(yīng)不得同時出現(xiàn)與驢皮源成分參比溶液色譜保留時間一致的色譜峰；若同時出現(xiàn)，則供試品色譜中m/z 539.8（雙電荷）612.4的色譜峰面積值不得大于參

9、比溶液中相應(yīng)的峰面積值。8色譜條件色譜條件 驢皮源成分驢皮源成分 照高效液相色譜-質(zhì)譜法（中國藥典2010年版一部附錄 D和二部附錄 J）測定。 色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱內(nèi)徑2.1mm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：025分鐘，A 95%80%，B 5%20%；2540分鐘，A 80%50%，B 20%50%。流速為0.3ml/min。以質(zhì)譜作為檢測器，電噴霧離子源：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），選擇m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8作為檢測離

10、子對。取驢皮源成分參比溶液，進(jìn)樣5l，m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8的MRM色譜峰的信噪比均應(yīng)大于3:1。 驢皮源成分參比溶液的制備驢皮源成分參比溶液的制備 取阿膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，用0.22m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l，置微量進(jìn)樣瓶中，加

11、胰蛋白酶溶液（取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1ml中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配）10l, 搖勻，37恒溫酶解12小時，即得。 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1% 碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“用0.22m微孔濾膜濾過”起，照驢皮源成分參比溶液的制備方法同法操作，即得。 測定方法測定方法 分別吸取驢皮源成分參比溶液與供試品溶液各5l，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 以m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8提取的供試品

12、離子流色譜中，應(yīng)不得同時出現(xiàn)與驢皮源成分參比溶液色譜保留時間一致的色譜峰；若同時出現(xiàn)，則供試品色譜中m/z 539.8（雙電荷）612.4的色譜峰面積值不得大于參比溶液中相應(yīng)的峰面積值。保證檢測的最低要求保證檢測的最低要求 驢皮源成分驢皮源成分 照高效液相色譜-質(zhì)譜法（中國藥典2010年版一部附錄 D和二部附錄 J）測定。 色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱內(nèi)徑2.1mm）；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫：025分鐘，A 95%80%，B 5%20%；2540分鐘，A 80%50%，B 20%50%。流

13、速為0.3ml/min。以質(zhì)譜作為檢測器，電噴霧離子源：ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），選擇m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8作為檢測離子對。取驢皮源成分參比溶液，進(jìn)樣5l，m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8的MRM色譜峰的信噪比均應(yīng)大于3:1。 驢皮源成分參比溶液的制備驢皮源成分參比溶液的制備 取阿膠對照藥材粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液5ml置100ml量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g，置50

14、ml量瓶中，加1%碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1%碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，用0.22m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液（取序列分析級胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液制成每1ml中含1mg的溶液，臨用前現(xiàn)配）10l, 搖勻，37恒溫酶解12小時，即得。 供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取本品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1% 碳酸氫銨溶液40ml，超聲處理30分鐘，加1% 碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，自“用0.22m微孔濾膜濾過”起，照驢皮源成分參比溶液的制備方法同法操作，即得。 測定方法測定方法 分別吸取驢皮源成分參

15、比溶液與供試品溶液各5l，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，即得。 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 以m/z 539.8（雙電荷）612.4和m/z 539.8（雙電荷）923.8提取的供試品離子流色譜中，應(yīng)不得同時出現(xiàn)與驢皮源成分參比溶液色譜保留時間一致的色譜峰；若同時出現(xiàn)，則供試品色譜中m/z 539.8（雙電荷）612.4的色譜峰面積值不得大于參比溶液中相應(yīng)的峰面積值。參比溶液參比溶液: :正品膠類中摻加了正品膠類中摻加了5%5%的驢皮的驢皮二、溶液制備二、溶液制備2ml2ml離心管離心管微量進(jìn)樣器槍頭微量進(jìn)樣器槍頭200200 l l微量進(jìn)樣器微量進(jìn)樣器0.220.22 m m微孔濾膜微孔濾膜25

16、0250 l l進(jìn)樣內(nèi)襯管進(jìn)樣內(nèi)襯管2m2ml l進(jìn)樣瓶進(jìn)樣瓶注射器注射器二、溶液制備二、溶液制備0.1 g g 對照品或樣品對照品或樣品加入 50 mL of 1% NH4HCO3, 超聲處理過濾，取濾液100 L至200L 進(jìn)樣內(nèi)襯管取溶液取溶液5ml5ml置置100ml100ml量瓶中量瓶中加鹿角膠基質(zhì)溶液加鹿角膠基質(zhì)溶液胰蛋白酶溶液10l37恒溫酶解12小時進(jìn)樣胰蛋白酶胰蛋白酶 在堿性條件下使用在堿性條件下使用 序列分析用序列分析用Promega V5113Promega V5113，V5280V5280SigmaSigma，貨號為：，貨號為：T1426-50MGT1426-50MG中

17、檢院，批號：中檢院，批號：140615-200206140615-200206（使用時需加倍）（使用時需加倍） 實驗材料 胰蛋白酶三、質(zhì)譜條件優(yōu)化三、質(zhì)譜條件優(yōu)化取對照藥材母液進(jìn)行酶解取對照藥材母液進(jìn)行酶解針對特征離子進(jìn)行子離子全掃描針對特征離子進(jìn)行子離子全掃描優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)質(zhì)譜條件優(yōu)化質(zhì)譜條件優(yōu)化 取黃明膠對照藥材粉末取黃明膠對照藥材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加1% 1% 碳碳酸氫銨酸氫銨 溶液溶液40ml40ml，超聲處理，超聲處理3030分鐘，加分鐘，加1%1%碳酸氫銨溶液碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液稀釋至刻度，搖勻，取溶液5ml5m

18、l置置100ml100ml量瓶中，加鹿角量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶量瓶中，加中，加1%1%碳酸氫銨溶液碳酸氫銨溶液40ml40ml，超聲處理，超聲處理3030分鐘，加分鐘，加1%1%碳碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，用勻，用0.220.22m m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l100l，置微，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液( (取序列分析級胰蛋白酶取序列分析級胰蛋白酶，加，加1%1%碳

19、酸氫銨溶液制成每碳酸氫銨溶液制成每1ml1ml中含中含1mg1mg的溶液，臨用前的溶液，臨用前現(xiàn)配現(xiàn)配) 10l, ) 10l, 搖勻，搖勻，3737恒溫酶解恒溫酶解1212小時，即得。小時，即得。質(zhì)譜條件優(yōu)化質(zhì)譜條件優(yōu)化 取黃明膠對照藥材粉末取黃明膠對照藥材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加1% 1% 碳碳酸氫銨酸氫銨 溶液溶液40ml40ml，超聲處理，超聲處理3030分鐘，加分鐘，加1%1%碳酸氫銨溶液碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，稀釋至刻度，搖勻，取溶液取溶液5ml5ml置置100ml100ml量瓶中，加鹿角量瓶中，加鹿角膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末膠基質(zhì)溶液（取鹿角膠對照藥材粉末0.1g0.1g，置，置50ml50ml量瓶量瓶中，加中，加1%1%碳酸氫銨溶液碳酸氫銨溶液40ml40ml，超聲處理，超聲處理3030分鐘，加分鐘，加1%1%碳碳酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖酸氫銨溶液稀釋至刻度，搖勻，即得）稀釋至刻度，搖勻，勻，用用0.220.22m m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100l100l，置微，置微量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液量進(jìn)樣瓶中，加胰蛋白酶溶液( (取序列分析級胰蛋白酶取序列分析級胰蛋白酶，加，加1%1%碳酸氫銨溶液制成每碳酸氫銨溶液制成每1ml1ml中含中含1mg1mg的溶