細(xì)胞生物學(xué)：第十三章細(xì)胞周期

1、CELL CYCLE細(xì)胞增殖是生命的基本特征。初生嬰兒1012個(gè)細(xì)胞，成人1014個(gè)，約200種類型。成人每秒鐘有數(shù)百萬(wàn)新細(xì)胞產(chǎn)生。一個(gè)大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過(guò)地球的重量。第一節(jié) 基本概念MAJOR CONCEPTS一、什么是細(xì)胞周期 細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程。分為：G1期(gap1)，分裂完成到DNA復(fù)制之前。S期(synthesis phase)，DNA復(fù)制階段。G2期(gap2)，DNA復(fù)制完成到分裂之前。M期，又稱D期，分裂開(kāi)始到結(jié)束。Eucaryotic Cell Cycle A typical mammalian cell h

2、as a cell cycle time of 24 hours, with 12 hr G1, 6-8 hr S, 3-4 hr G2, and 1 hr M 根據(jù)細(xì)胞周期可將高等動(dòng)物細(xì)胞分為3類：連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層、骨髓干細(xì)胞。休眠細(xì)胞，暫不分裂，適當(dāng)刺激下可重新進(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。不分裂細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，不再分裂，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等。二、細(xì)胞周期時(shí)間的測(cè)定G1期差異較大，M期最短，約0.54.5小時(shí)。周期長(zhǎng)短與物種/細(xì)胞類型有關(guān)。測(cè)定方法：標(biāo)記有絲分裂百分率法（PLM），用3H TDR對(duì)測(cè)定細(xì)胞脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)

3、胞百分?jǐn)?shù)來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。50100TG20TMTsTcTG2 +1/2TMTPLM常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM三、細(xì)胞同步化（一）自然同步化1. 多核體：粘菌、瘧原蟲(chóng)。2 . 水生動(dòng)物受精卵：海膽、兩棲類。3. 增殖抑制解除后的同步分裂：真菌休眠孢子。（二）人工同步化1. 選擇同步化1）有絲分裂選擇法優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。缺點(diǎn)：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少（分裂細(xì)胞約占1%2%） 。2）細(xì)胞沉降分離法優(yōu)點(diǎn)：可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。缺點(diǎn)：同步化程度較低。2. 誘導(dǎo)同步化1）DNA合成阻斷法：用DNA合成抑制劑，可逆阻斷細(xì)胞周期，然后釋放。常用TDR雙阻斷法。

4、優(yōu)點(diǎn)：同步化程度高；缺點(diǎn)：產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。2）中期阻斷法用秋水仙素等微管抑制劑將細(xì)胞阻斷在中期。優(yōu)點(diǎn)是便于觀察染色體，缺點(diǎn)是可逆性較差。第二節(jié) 有絲分裂MITOSIS一、細(xì)胞分裂的類型無(wú)絲分裂：又稱直接分裂，由Remark（1841）發(fā)現(xiàn)于雞胚血細(xì)胞，不涉及紡錘體形成及染色體變化 。有絲分裂：又稱間接分裂，由Fleming (1882)和Strasburger(1880)發(fā)現(xiàn)。減數(shù)分裂：DNA復(fù)制1次，細(xì)胞連續(xù)分裂2次。二、有絲分裂過(guò)程為了便于描述人為的劃分為六個(gè)時(shí)期：間期（interphase）；前期(prophase)；前中期(premetaphase)；中期(metap

5、hase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。間期包括G1期、S期和G2期，進(jìn)行DNA、中心體復(fù)制，細(xì)胞體積增大等準(zhǔn)備工作。（一）前期（一）前期染色質(zhì)凝縮，分裂極確立與紡錘體開(kāi)始形成，核仁解體，核膜消失。S期中心粒已完成復(fù)制，核膜解體時(shí)，中心粒已到達(dá)兩極，并形成紡錘體。紡錘體的三種微管結(jié)構(gòu)：極體微管（polar mt）；著絲點(diǎn)微管（kinetochore mt；星體微管（astral mt）。Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the su

6、rface of an early prophase newt lung cell nucleus. 圖片來(lái)自/圖片來(lái)自/（二）前中期（二）前中期從核膜解體到染色體排列到赤道面上。（三）中期（三）中期染色體排列到赤道面上。（四）后期（四）后期指妹妹染色體單體分開(kāi)并移向兩極的時(shí)期。分為后期A、后期B兩個(gè)過(guò)程。Anaphase A: separation of the sister chromatids.Anaphase B: separation of the poles. 植物細(xì)胞有沒(méi)有后期B ？Mic

7、rotubules and Motors in the spindle （五）末期 從子染色體到達(dá)兩極，至形成兩個(gè)新細(xì)胞為止的時(shí)期。涉及子核的形成和胞質(zhì)分裂兩個(gè)方面。 末期核纖肽B去磷酸化，介導(dǎo)核膜重新裝配，同時(shí)染色體解聚縮，核仁出現(xiàn)和核膜重新形成。 核分裂與胞質(zhì)分裂是相繼發(fā)生的，屬于兩個(gè)分離的過(guò)程，如： 大多數(shù)昆蟲(chóng)的卵，核可進(jìn)行多次分裂而無(wú)胞質(zhì)分裂，某些藻類的多核細(xì)胞可長(zhǎng)達(dá)數(shù)尺，以后胞質(zhì)才分裂形成單核細(xì)胞。子核的形成與胞質(zhì)分裂子核的形成與胞質(zhì)分裂 動(dòng)物的胞質(zhì)分裂通過(guò)胞質(zhì)收縮環(huán)的收縮實(shí)現(xiàn)，收縮環(huán)由平行排列的肌動(dòng)蛋白組成。用細(xì)胞松弛素處理這一時(shí)期的細(xì)胞，會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象？Dividing Musc

8、le Myoblast (primitive muscle cell) (SEM x8,000) 植物細(xì)胞末期近兩極處紡錘絲消失，中間微管保留，形成成膜體。 來(lái)自高爾基體囊泡沿微管轉(zhuǎn)運(yùn)到成膜體中間。融合形成細(xì)胞板，囊泡的內(nèi)含物形成初生壁和中膠層，囊泡膜形成質(zhì)膜，融合留下的管道形成胞間連絲。第三節(jié) 減數(shù)分裂Meiosis由連續(xù)兩次分裂構(gòu)成：通 常 減 數(shù) 分 裂 I 分 離 的 是 同 源 染 色 體 ， 所 以 稱 為 異 型 分 裂（heterotypic division）或減數(shù)分裂（reductional division）。減數(shù)分裂II分離的是姊妹染色體，類似于有絲分裂，所以稱為同型分

9、裂（homotypic division）或均等分裂（equational division）。為了描述方便將減數(shù)分裂分為不同時(shí)期。MeiosisConcepts:1. Gametic meiosis2. Sporic meiosis3. Zygotic meiosis減數(shù)分裂可分為3種主要類型 配子減數(shù)分裂（gametic meiosis），也叫終端減數(shù)分裂(terminal meiosis)，其特點(diǎn)是減數(shù)分裂和配子的發(fā)生緊密聯(lián)系在一起，在雄性脊椎動(dòng)物中，一個(gè)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成4個(gè)精細(xì)胞，后者在經(jīng)過(guò)一系列的變態(tài)發(fā)育，形成成熟的精子。在雌性脊椎動(dòng)物中，一個(gè)卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成1個(gè)卵細(xì)

10、胞和2-3個(gè)極體。 孢子減數(shù)分裂（sporic meiosis），也叫中間減數(shù)分裂(intermediate meiosis)，見(jiàn)于植物和某些藻類。其特點(diǎn)是減數(shù)分裂和配子發(fā)生沒(méi)有直接的關(guān)系，減數(shù)分裂的結(jié)果是形成單倍體的配子體（小孢子和大孢子）。小孢子再經(jīng)過(guò)兩次有次分裂形成包含一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)雄配子（精子）的成熟花粉（雄配子體），大孢子經(jīng)過(guò)三次有絲分裂形成胚囊（雌配子體），內(nèi)含一個(gè)卵核、兩個(gè)極核、3個(gè)反足細(xì)胞和兩個(gè)助細(xì)胞。 合子減數(shù)分裂（zygotic meiosis），也叫初始減數(shù)分裂(initial meiosis),僅見(jiàn)于真菌和某些原核生物，減數(shù)分裂發(fā)生于合子形成之后，形成單倍體的孢子，孢

11、子通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生新的單倍體后代。 此外某些生物還具有體細(xì)胞減數(shù)分裂（somatic meiosis）現(xiàn)象，如在蚊子幼蟲(chóng)的腸道中，有一些由核內(nèi)有絲分裂形成的多倍體細(xì)胞（可高達(dá)32X），在蛹期又通過(guò)減數(shù)分裂降低了染色體倍性，增加了細(xì)胞數(shù)目。一、間期稱前減數(shù)分裂間期或前減數(shù)分裂期(premeiosis)，也分為G1、S和G2期。G2期是有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時(shí)期。S期時(shí)間較長(zhǎng)，部分DNA（約0.3%左右）是在合線期合成的。二、分裂期（一）減數(shù)分裂I1. 前期I通常分為5個(gè)時(shí)期：leptotene ，zygotene ，pachytene，diplotene，diakinesis。 1）細(xì)線期

12、: 染色體呈細(xì)線狀，具有念珠狀的染色粒。持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，占減數(shù)分裂周期的40%。細(xì)線期雖然染色體已經(jīng)復(fù)制，但光鏡下分辨不出兩條染色單體。由于染色體細(xì)線交織在一起，偏向核的一方，所以又稱為凝線期(synizesis)，在有些物種中表現(xiàn)為染色體細(xì)線一端在核膜的一側(cè)集中，另一端放射狀伸出，形似花束，稱為花束期(bouquet stage)。 2）合線期：持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，占有絲分裂周期的20%。亦稱偶線期，是同源染色體配對(duì)的時(shí)期，這種配對(duì)稱為聯(lián)會(huì)(synapsis)。這一時(shí)期同源染色體間形成聯(lián)會(huì)復(fù)合體(synaptonemal complex，SC)。在光鏡下可以看到兩條結(jié)合在一起的染色體，稱為二價(jià)體（b

13、ivalent）。每一對(duì)同源染色體都經(jīng)過(guò)復(fù)制，含四個(gè)染色單體，所以又稱為四分體（tetrad）。 3)粗線期：持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)天，此時(shí)染色體變短，結(jié)合緊密，在光鏡下只在局部可以區(qū)分同源染色體，這一時(shí)期同源染色體的非姊妹染色單體之間發(fā)生交換的時(shí)期。在果蠅粗線期SC上具有與SC寬度相近的電子致密球狀小體，稱為重組節(jié)，與DNA的重組有關(guān)。 4）雙線期：聯(lián)會(huì)的同源染色體相互排斥、開(kāi)始分離，但在交叉點(diǎn)(chiasma)上還保持著聯(lián)系。雙線期染色體進(jìn)一步縮短，在電鏡下已看不到聯(lián)會(huì)復(fù)合體。 交叉的數(shù)目和位置在每個(gè)二價(jià)體上并非是固定的，而隨著時(shí)間推移，向端部移動(dòng)，這種移動(dòng)現(xiàn)象稱為端化(terminalizati

14、on)，端化過(guò)程一直進(jìn)行到中期。 植物細(xì)胞雙線期一般較短，但在許多動(dòng)物中雙線期停留的時(shí)間非常長(zhǎng)，人的卵母細(xì)胞在五個(gè)月胎兒中已達(dá)雙線期，而一直到排卵都停在雙線期，排卵年齡大約在12-50歲之間。成熟的卵細(xì)胞直到受精后，才迅速完成兩次分裂，形成單倍體的卵核。 在魚(yú)類、兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類以及無(wú)脊椎動(dòng)物的昆蟲(chóng)中，雙線期的二價(jià)體解螺旋而形成燈刷染色體，這一時(shí)期是卵黃積累的時(shí)期。 5）終變期：二價(jià)體顯著變短，并向核周邊移動(dòng)，在核內(nèi)均勻散開(kāi)。所以是觀察染色體的良好時(shí)期。 由于交叉端化過(guò)程的進(jìn)一步發(fā)展，故交叉數(shù)目減少，通常只有一至二個(gè)交叉。終變期二價(jià)體的形狀表現(xiàn)出多樣性,如V形、O形等。 核仁此時(shí)開(kāi)始消失，

15、核被膜解體，但有的植物，如玉米，在終變期核仁仍然很顯著。 2 . 中期I:核仁消失，核被膜解體，標(biāo)志進(jìn)入中期I，中期I的主要特點(diǎn)是染色體排列在赤道面上。每個(gè)二價(jià)體有4個(gè)著絲粒、姊妹染色單位的著絲粒定向于紡錘體的同一極，故稱聯(lián)合定向(co-orientation)。 3 . 后期I：同源染色體隨機(jī)分向兩極，染色體重組，人類染色體重組概率有223個(gè)。4 . 末期I:染色體到達(dá)兩極后，解旋為細(xì)絲狀、核膜重建、核仁形成，同時(shí)進(jìn)行胞質(zhì)分裂。 5 . 減數(shù)分裂間期:在減數(shù)分裂I和II之間的間期很短，不進(jìn)行DNA的合成，有些生物沒(méi)有間期，而由末期I直接轉(zhuǎn)為前期II。 （二）減數(shù)分裂II 可分為前、中、后、末

16、四個(gè)四期，與有絲分裂相似。 一個(gè)精母細(xì)胞形成4個(gè)精子；一個(gè)卵母細(xì)胞形成一個(gè)卵子及2-3個(gè)極體。 Chromosome recombination 1Chromosome recombination 2Minimum number of gamete types = 2n , In humans, n = 23三、聯(lián)會(huì)復(fù)合體SC由兩條同源染色體沿縱軸形成，外觀呈梯子狀。SC幫助交換的完成，SC上有重組節(jié)，是交換發(fā)生的部位。SC主要由堿性蛋白質(zhì)和RNA組成，含有少量DNA。SC形成合線期，成熟于粗線期，消失于雙線期。在細(xì)線期/合線期加入DNA合成抑制劑，則抑制SC形成。 synaptonemal

17、complex第四節(jié) 細(xì)胞周期調(diào)控CELL CYCLE CONTROL一、研究背景1970s Rao等發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個(gè)部位開(kāi)始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說(shuō)明DNA復(fù)制已完成。不同類的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說(shuō)明M期細(xì)胞具有促進(jìn)間期細(xì)胞進(jìn)行分裂的因子，即成熟促進(jìn)因子( MPF)。prematurely condensed chromosome，PCCG1SG2Hartwell 1960s, Nurse 1970s 分別以芽殖酵母和裂殖酵母為材料，利用溫度敏

18、感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因( cdc)。如：裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無(wú)法分裂；wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂；cdc2和cdc28都編碼34KD的蛋白激酶，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進(jìn)cdc2的活性。FISSION YEAST BUDDING YEAST Cdc 25 & Wee1 mutantT. Hunt 1980s發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過(guò)程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為cyclin A和B，其mRNA能誘導(dǎo)蛙卵成熟。1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由

19、32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=cdc2+clyclin BLeland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日美國(guó)人Leland Hartwell、英國(guó)人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機(jī)理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。二、CDKcdc2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)。cdc2又稱CDK1，可將特定蛋白磷酸化，如：將核纖肽磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動(dòng)

20、物中已知7種CDK。均含PSTAIRE保守序列，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。三、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 CKI對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為： Ink4: 抑制cdk4cyclin D1, cdk6cyclin D1。 Kip：抑制大多數(shù)CDK。其中P21cip1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。四、細(xì)胞周期蛋白cyclin特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個(gè)氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)與CDK結(jié)合。作用：激活和引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體 *包括D1

21、-3，各亞型cyclin D在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。G1期，在生長(zhǎng)因子的刺激下，cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，激活DNA復(fù)制。G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1引起染色體凝縮、核膜解體等。G1 CDK activate transcription factor E2FCELL CYCLE REGULATION中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時(shí)，激活A(yù)PC，通過(guò)泛素化途徑降解cyclin B，完成細(xì)胞周期。分裂期周期蛋白N端具有降解盒。泛素由76個(gè)氨基酸組成，高度保守。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白能被蛋白酶體識(shí)別和降解，是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和異常蛋白降解的普遍途徑。Destruction Box in Cyclins26S蛋白酶體是大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。 M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。 結(jié)合cyclin B的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。 在M期，Wee1的活性下降，cdc2