食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)進展綜述

1、食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)研究進展摘要：免疫學(xué)檢測方法因特異性強、靈敏度高和操作簡便的優(yōu)點而備受青睞。該文介紹了部分國家和地區(qū)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)注情況，食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)，包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫層析技術(shù)、生物傳感器技術(shù)的研究進展和應(yīng)用。通過與質(zhì)譜、鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)技術(shù)(PCR)對比，探討了食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展方向。關(guān)鍵詞：食物；過敏原；免疫學(xué)檢測Abstract：Immunoassays have been paid extensive attention by scientists due to its high sensitivity and simple ope

2、ration. In this paper，the situations of major food allergens labeling in some countries and areas were introduced，and the research progresses and applications of immunoassay techniques of food allergens，including enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)，lateral flow immunoassay and biosensor techniq

3、ue were summarized. By contrast with mass spectrometry and Polymerase Chain Reaction (PCR) technique，the prospect of immunoassays of food allergens was further discussed.Key words：food；allergen；immunoassay；progress食物過敏是一個世界性公共衛(wèi)生問題。調(diào)查顯示世界上約4的人口對食物過敏。目前，已確定的過敏性食物多達180種以上，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture O

4、rganization，F(xiàn)AO)報告了90以上食物過敏原存在于牛奶、雞蛋、魚、甲殼類水產(chǎn)品、花生、大豆、堅果類及小麥8大類食物中。為保護易感者健康，部分國家和地區(qū)對食物過敏原的標(biāo)簽標(biāo)注進行了嚴(yán)格規(guī)定(如表1所示) ，并列入立法范圍，因此食物過敏原的檢測越來越重要。食物過敏原(Food allergen)檢測技術(shù)根據(jù)檢測目標(biāo)物的不同，以分析全蛋白或酶解后肽段氨基酸序列的質(zhì)譜技術(shù)、檢測編碼過敏原DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)及分析過敏原性的免疫學(xué)檢測技術(shù)為代表 。J。而質(zhì)譜存在操作費時、儀器昂貴、檢測費用相對較高等缺點 ；PCR方法檢測

5、易因操作不當(dāng)受到污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，存在操作要求技術(shù)性強、費時等缺陷。由于質(zhì)譜技術(shù)和PCR方法在便捷程度、檢測速度等方面的局限使其難以滿足市場應(yīng)用的需求，因此，建立快速、高效、精確的食物過敏原檢測方法顯得尤為重要。以酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫層析技術(shù)(Lateral flow immunoassay，LFIA)、生物傳感器技術(shù)為代表的免疫學(xué)檢測(Immunoassay)方法因其特異性強、靈敏度高及操作簡便而備受青睞 ，目前在眾多過敏原檢測方法中應(yīng)用最為廣泛。1 食物過敏原免疫學(xué)原理食物過敏原為食物中引發(fā)或激起過敏反應(yīng)

6、的物質(zhì)，通常為在特定食物中含有的含量豐富、天然存在的蛋白質(zhì)。根據(jù)過敏原反應(yīng)的速度及l(fā)臨床特點等將致敏機制分為I、，其中大部分食物過敏是由IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，包括致敏和發(fā)敏兩個階段。一定量的過敏原可誘導(dǎo)易感個體產(chǎn)生足夠量的IgE，IgE通過血循環(huán)分布全身，并與肥大細胞、嗜堿性粒細胞膜表面特定的受體結(jié)合，從而使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)再次接觸含相同或相似過敏原成分的食品時，過敏原分子特異性識別致敏細胞膜表面的IgE，誘導(dǎo)細胞脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)而觸發(fā)食物過敏癥。一般癥狀包括嘔吐、腹痛、腹瀉等，也包括皮膚反應(yīng)及呼吸道癥狀，甚至?xí)霈F(xiàn)系統(tǒng)性過敏性休克或者死亡l2 J，目前尚無有效的治療方法。能引起過敏

7、反應(yīng)的食物蛋白部分可能是一些氨基酸在一級結(jié)構(gòu)的簡單延伸，或蛋白質(zhì)的獨特三維結(jié)構(gòu)，分別稱為線性和構(gòu)象決定簇(構(gòu)象表位)。食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)的原理基于抗原決定簇和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補性與親和性，使得抗原與抗體能夠特異性結(jié)合，而過敏原的分離、鑒定、純化及抗體的制備是實現(xiàn)食物過敏原免疫學(xué)檢測的前提。利用過敏原的物理化學(xué)性質(zhì)，采用硫酸銨沉淀、磷酸鹽抽提等方法得到粗致敏蛋白提取液；聚丙酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)可使粗提液中不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)得到分離；利用對食物過敏原過敏患者的血清或特異性單克隆抗體，通過免疫印跡(Westernbloting)法鑒定過敏原原性；依據(jù)致敏蛋白溶解度不同的

8、硫酸銨沉淀、等電點沉淀、有機溶劑沉淀法，分子大小不同的凝膠過濾層析法，電荷差異不同的離子交換層析，配體的特異性親和層析方法，疏水性不同的疏水層析法或幾種方法的結(jié)合可得到純化的食物過敏原。利用純化的過敏原免疫兔子或小鼠等動物，抽取血清可得針對多種抗原決定簇的多克隆抗體；通過純化過敏原免疫小鼠、融合免疫脾細胞和骨髓瘤細胞、克隆篩選、大量腹水制備可得到針對一種抗原決定簇的具有高度均一陛和可重復(fù)性的單克隆抗體¨ ，但需動物取血甚至殺死動物。由于雞在其蛋中能富集抗體且免疫耐受性比哺乳動物好，所以從蛋黃中提取抗體是經(jīng)濟、方便、對動物友好的方法，得到的抗體可根據(jù)抗體類型，采用市售親和層析柱純化。過

9、敏原的分離、鑒定、純化及抗體的制備將為食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)提供重要的技術(shù)支撐和物質(zhì)基礎(chǔ)。表1 部分國家和地區(qū)食物過敏原標(biāo)簽標(biāo)注情況2 食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)2.1 酶聯(lián)免疫吸附法ELISA技術(shù)于20世紀(jì)70年代出現(xiàn)，是一種將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的免疫分析方法，其檢測特異性源于抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)。目前其檢測靈敏度一般可達到納克級，若再加以全自動酶標(biāo)儀的應(yīng)用，ELISA方法的特異性和靈敏度還可進一步提高。ELISA方法是目前在食物過敏原的常規(guī)檢測與篩選領(lǐng)域應(yīng)用最廣的免疫分析技術(shù)。ELISA的分類方法眾多，主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、捕獲法和競爭法，

10、其中，雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法應(yīng)用最為廣泛。Faeste等通過免疫兔子制備抗鱈魚過敏原小清蛋白的多克隆抗體，利用該抗體包被酶標(biāo)板，并用生物素標(biāo)記該多抗建立了雙抗夾心ELISA法，食物中小清蛋白的檢出限為0.0l mgkg，約每kg食物中可檢測5 mg魚肉成分，靈敏度較高。另外，該研究組應(yīng)用建立的雙抗夾心ELISA法對32種魚類及其它物種含有的小清蛋白進行了檢測，結(jié)果顯示該方法特異性強，與其它物種中小清蛋白不存在交叉反應(yīng)。此外，該方法穩(wěn)定性好，應(yīng)用此方法分析食物基質(zhì)中的鱈魚小清蛋白回收率達68138 ，其區(qū)內(nèi)和批問差分別小于12和19 ，具有較好的應(yīng)用價值。Kaw等 應(yīng)用相同的原理

11、，建立了針對羽扇豆中總過敏原的雙抗夾心ELISA，應(yīng)用該方法檢測食物中殘留的羽扇豆，其定量檢測限為1 mgkg，但該方法存在與大豆及黑豆發(fā)生交叉反應(yīng)的缺點。Mariager等_1 應(yīng)用競爭ELISA法，用兔多克隆抗體檢測了普通和抗過敏嬰兒奶粉中的主要過敏原之一 一乳球蛋白，其檢出限為0.08 L。張在軍等¨ 依據(jù)斑點一ELISA原理，將3種含過敏原成分的花生、雞蛋清、蝦過敏蛋白以適當(dāng)濃度點狀吸附于硝酸纖維素膜，使其與3種過敏原特異性IgE血清和生物素化羊抗鼠IgG分別反應(yīng)后，通過肉眼觀察硝化纖維膜上斑點的顯色確定待檢血清中是否含有相應(yīng)的過敏原成分。該方法操作簡便，特異性強，3種過敏原

12、之間無交叉反應(yīng)。包被過敏原的硝酸纖維膜可在4穩(wěn)定保存4個月，重復(fù)性較好。Blais等。利用蛋黃中提取的抗體建立了斑點一ELISA法，可同時檢測花生、榛子及巴西堅果中的過敏原，其定性檢測限分別為0.O1、0.03、0.03 mgL，檢測時間約為30 min。近十年來，市場上關(guān)于杏仁、大豆、花生、甲殼類、芝麻、芥末、羽扇豆、牛奶等食物過敏原的ELISA檢測試劑盒均有銷售，這些試劑盒可在3060 rain內(nèi)實現(xiàn)定性或半定量檢測 。目前，特異性強、快速和高通量式檢測的新型ELISA試劑盒已成為食物過敏原快速檢測方法的研究熱點之一。2.2 免疫層析技術(shù)免疫層析技術(shù)始于1990年Beggs等 設(shè)計的人絨毛

13、促性腺激素免疫膠體金層析系統(tǒng)，是ELISA技術(shù)原理的擴展應(yīng)用，一般使用乳膠顆粒、膠體硒、膠體金以及脂質(zhì)體等作為著色標(biāo)記物。層析時，標(biāo)記物與待測物之問形成的復(fù)合物被相應(yīng)的配體捕獲而聚集于硝化纖維膜上的檢測線并呈現(xiàn)出標(biāo)記物所帶有的顏色，因此可通過纖維膜上顯色條的有無、顏色的深淺和反射光線強弱等實現(xiàn)定性或定量檢測 。1997年，Mills等 首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于花生過敏原(伴花生球蛋白)的檢出，其中杏仁軟糖中花生成分的檢出限為0.01(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，巧克力中的檢出限為0.1(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。2003年，兩種檢測食物過敏原的免疫層析試紙條獲得工業(yè)化生產(chǎn)，從而引發(fā)了免疫層析技術(shù)用于食物過敏原檢測的研發(fā)熱潮

14、 。如2005年，Wen等以可目測的脂質(zhì)體為標(biāo)記物標(biāo)記花生主要過敏原之一Arah 1的兔多克隆抗體，建立了以競爭ELISA法為原理的免疫層析檢測方法，其在Ara h1質(zhì)量濃度范圍0.110gL的緩沖液中檢出限為0.45 mgL，定性檢測范圍110 mgL，檢測時問小于30 rain且不需精密儀器。2006年，吉坤美等 依據(jù)雙抗夾心ELISA法，把可目測的膠體金標(biāo)記的花生總蛋白多克隆抗體固定于樣品墊上，待測花生過敏原與膠體金一花生總蛋白抗體形成復(fù)合物，被包被在硝化纖維膜檢測線上的花生總蛋白抗體捕獲濃集成紅色，可檢測花生的主要過敏原組分Ara h 1與Ara h 2，靈敏度達50gL。另外，該研究

15、組還應(yīng)用建立的免疫層析法對食物標(biāo)簽標(biāo)注的含有花生成分、未含花生成分以及標(biāo)注不詳?shù)膌9種食品進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)17種食品的檢測結(jié)果與食物標(biāo)簽的內(nèi)容相符合，2種標(biāo)示不詳?shù)氖称窓z測結(jié)果均為陽性，說明該方法特異性強，對于是否含有花生過敏原成分的食物檢測具有實際應(yīng)用價值。目前，市場上至少有14種商業(yè)免疫層析檢測試劑盒，檢測物質(zhì)包括牛奶、花生、榛子、甲殼類水產(chǎn)品等，如麩質(zhì)谷物中的醇溶朊定性檢測限為2.5 mgkg，檢測時問為5 min，貝、甲殼類水產(chǎn)動物的定性檢測限為5 mgkg，檢測時問為10 min 。近二十年來，免疫層析技術(shù)在食物過敏原檢測中得到了快速發(fā)展，但多集中在花生、榛子等堅果類過敏原的研究

16、，商業(yè)化免疫層析檢測試紙條多為定性或半定量檢測。隨著納米材料學(xué)的發(fā)展，一些帶有功能基團的納米材料如膠體金、膠體銀、熒光素、超順磁性納米微球可作為標(biāo)記物與抗體偶聯(lián)達到定性或定量檢測的目的。因此，應(yīng)用免疫層析檢測技術(shù)結(jié)合新型納米材料作為標(biāo)記物，優(yōu)化層析體系將是食物過敏原檢測技術(shù)的研究熱點之一。2.3 生物傳感器技術(shù)自1 967年科學(xué)家研制出第一個生物傳感器葡萄糖傳感器以來，生物傳感器在食品安全方面如致病菌檢測、抗生素殘留檢測、農(nóng)獸藥殘留檢測、毒素檢測方面得到了廣泛應(yīng)用 ，但在食物過敏原檢測方面的應(yīng)用研究較少。生物傳感器根據(jù)待測物質(zhì)和分子識別元件特異性結(jié)合，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的生物學(xué)信息通過信號

17、轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為可以定量處理的電、光等信息，再經(jīng)儀表放大和輸出，從而達到分析和檢測的目的，如靶分子(抗體或單鏈DNA分子等)固定在傳感器芯片表面，可實時定量檢測一一種或多種分子問的反應(yīng)。過敏原的檢測是通過不同的物理化學(xué)技術(shù)實現(xiàn)的，如表面等離子體共振(Surface plasmon reso.nance，SPR)、共振增強吸收(Resonanceenhanced absorption，REA) ?！暗?。Lu等 副采用SPR生物傳感器定量檢測了鯉魚過敏原小清蛋白，檢測時間為5 min，且僅需少量樣品(低至3.55 mgL)，對樣品純化程度要求較低。微型SPR生物檢測器已應(yīng)用于食品生產(chǎn)過程中花生過敏原的

18、檢測，該檢測器可實現(xiàn)在線定量檢測?；赗EA生物傳感器檢測牛奶過敏原 .乳球蛋白的研究顯示，REA生物傳感器在檢測時需使用標(biāo)記探針，納米金顆粒標(biāo)記的抗體可得到更強的REA信號 。沈麗燕¨糾以抗原抗體免疫反應(yīng)和壓電型傳感技術(shù)為基礎(chǔ)，選擇1，6一己二硫醇一納米金自組裝方式，建立了食物過敏原的壓電型免疫傳感器快速檢測方法。該傳感器對河蝦過敏原原肌球蛋白的檢出限為0.03 mgL，花生蛋白的檢出限為0.2 mgL，檢測時間約6 rain。其交叉試驗結(jié)果與ELISA一致，且免疫傳感器可再生1次之多，具有較好的應(yīng)用前景。最近，Bremer等 研究出一種快速靈敏的免疫檢測生物傳感器，可在橄欖油中檢

19、出高于0.08 mgkg的榛子蛋白，檢測時間少于4.5 rain，同時可用于鑒別橄欖油中摻雜的榛子油，保護對榛子過敏者的健康。目前，已開發(fā)的商業(yè)化生物傳感器可用于牛奶、雞蛋、堅果、花生、魚、芝麻等食物中致敏蛋白成分的檢測 。生物傳感器技術(shù)兼具免疫檢測技術(shù)和光電學(xué)技術(shù)的優(yōu)點，在食物過敏原檢測方面，選用最佳生物傳感器、擴大應(yīng)用范圍將是生物傳感技術(shù)的研究熱點之一，另外高靈敏度、集成化、微型化、多功能化及商業(yè)化也是生物傳感技術(shù)的發(fā)展趨勢和重點研究方向。3 討論及展望近年來，隨著人們對食物過敏意識的增強，部分國家和地區(qū)已建立嚴(yán)格的食品過敏原標(biāo)簽制度，并立法強制要求對食物過敏原進行標(biāo)示，推動了食物過敏原檢

20、測技術(shù)的不斷發(fā)展，表2對食物過敏原的幾種主要檢測技術(shù)進行了比較。表2列出的幾種主要檢測方法中，質(zhì)譜技術(shù)能精確測定全蛋白或酶解后肽段的氨基酸序列，再根據(jù)相應(yīng)數(shù)據(jù)庫確定致敏蛋白。液相Z重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、高精度四極桿一飛行時問串聯(lián)質(zhì)譜儀、飛克級氣相色譜三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、全新的代謝物譜庫和軟件平臺使質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度有了新突破，但質(zhì)譜技術(shù)鑒定過敏原多是結(jié)合高性能的分離純化手段如雙向電泳、液相色譜、毛細管電泳、場流分級等技術(shù)，存在操作費時、儀器昂貴、檢測費用相對較高等缺點。PCR主要通過引物的特異性選擇從而使具有一定同源性的DNA分子之間的交叉反應(yīng)降低到最低 ，其靈敏度和特異性均較高，但經(jīng)系列加

21、工處理后食物樣本中的DNA受損較大因而較難提取，且DNA需經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程才能表達為具有一定生物功能的蛋白質(zhì)，而此過程又受諸多因素的影響。因此PCR檢測的陽性結(jié)果只能說明食物中含有致敏因素，但不能反映食物的真正過敏性即人們攝入該食物后會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。傳統(tǒng)PCR多是定性分析，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，實時熒光PCR、PCRELISA法可實現(xiàn)定量檢測，但即使商業(yè)PCR試劑盒也需78 h，較為費時。質(zhì)譜技術(shù)和PCR方法因在便捷程度、檢測速度等方面的局限性而難以滿足市場的應(yīng)用需求，食物過敏原的免疫學(xué)檢測技術(shù)因較好的特異性、操作簡便性和低成本等優(yōu)點受到食品工業(yè)界的青睞。其中ELISA技術(shù)較為成熟，可實現(xiàn)多樣本同時檢測，目前應(yīng)用也最為廣泛，較適合于過敏原的常規(guī)篩選和檢測；基于生物傳感器的檢測方法克服了以往酶法分析成本高和化學(xué)分析步驟繁瑣的缺點，其檢測結(jié)果不受顏色、濁度的影響，操作系統(tǒng)比較簡單，容易實現(xiàn)自動分析和現(xiàn)場檢測，因而較適合于大規(guī)模樣本的實時高通量檢測。免疫層析技術(shù)將免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)移到玻璃纖維和硝化纖維膜上進行，從而省略了標(biāo)記物的結(jié)合與分