【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、從社會(huì)中來番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降。番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用科學(xué)家通過精心設(shè)計(jì)，用“分子工具分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。病毒。DNA雙螺旋的直徑只有雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門的更需要專門的“分子工具分子工具”。轉(zhuǎn)基因番木瓜（左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)并通過體外DNA重

2、組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)?！練w納定義】【歸納定義】工程工程別名：別名： 操作對(duì)象：操作對(duì)象： 操作水平：操作水平： 工程工程實(shí)質(zhì)：實(shí)質(zhì)：什么是基因工程？DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)基因基因DNADNA分子水平分子水平基因重組基因重組第1節(jié)三種“分子工具”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運(yùn)輸車”來源：種類：主要來自原核生物特點(diǎn)：數(shù)千種能識(shí)別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（限制酶不是一種酶，而是一類酶）一、限制性內(nèi)切核

3、酸酶 分子手術(shù)刀根據(jù)你所掌握的知識(shí)你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么？主要起到切割外源DNA使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。12345 G限制酶12345 A磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵TGCCGTAA一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀5353仔細(xì)觀察仔細(xì)觀察以下四種以下四種限制酶識(shí)別的特定序列有何限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？特點(diǎn)？EcoR G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GHind A-A-G-C-T-TT-T-C-G-A-ABamH G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-GTaqT-C-G-AA-G-C-T限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)

4、堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ，稱為回文序列。一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀EcoRI 限制酶的切割：只能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開。伸出的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)黏性末端中軸線SmaI 限制酶的作用： 只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。在C和G之間切開一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀結(jié)果： 產(chǎn)生黏性末端或平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀（1）該DNA片段上EcoRI的識(shí)別序列在哪兒？（2）請(qǐng)用剪刀模擬EcoRI的識(shí)別

5、序列和切割位點(diǎn)將目的基因“切割”下來。實(shí)踐活動(dòng)一、實(shí)踐活動(dòng)一、用剪刀模擬用剪刀模擬EcoRIEcoRI剪切目的基因剪切目的基因(Bt(Bt基因基因) )操作操作5.TAG3.ATCTTAAAATTCCA.3 GGT.5AATTC . B t . GG .基因.CTTAA黏性末端目的基因黏性末端 要想獲得某個(gè)特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性(平)末端？ 如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會(huì)怎樣？要切2個(gè)切口，產(chǎn)生4個(gè)黏性(平)末端。會(huì)產(chǎn)生相同的黏性(平)末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀【反饋練習(xí)】【反饋練習(xí)】1.下面哪項(xiàng)不具有限制酶識(shí)別序列的特征（ ）A

6、GAATTC BGGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGGCCTGCAG DCTAAATC GACGTC GATTTAGD一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀 2.下列下列是由同種限制酶切割形成的是由同種限制酶切割形成的DNA片段是片段是（ ）CTGCA GGCTTAA GACGTC AATTC GA. ； B. ；C. ； D.以上都不對(duì)以上都不對(duì)A 缺口怎么辦？缺口怎么辦？一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀什么樣的末端才能連接起來？，1. 作用：2. 種類： Ecoli DNA連接酶 T4 DNA連接酶將雙鏈 DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 。二、DN

7、A連接酶 分子縫合針兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！3、DNA連接酶的縫合作用二、DNA連接酶 分子縫合針 可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵二、DNA連接酶 分子縫合針二、DNA連接酶 分子縫合針3.Ecoli DNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？二、DNA連接酶 分子縫合針 A A T T

8、 GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶DNA聚合酶的作用二、DNA連接酶 分子縫合針4.幾種相關(guān)酶的比較幾種相關(guān)酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶 DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶二、DNA連接酶 分子縫合針磷酸二酯鍵堿基對(duì)之間的氫鍵將DNA切成兩個(gè)片段磷酸二酯鍵將兩個(gè)DNA片段連接為一個(gè)DNA分子磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個(gè)脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈3.根據(jù)所學(xué)知識(shí)，完成以下填空：限制酶 解旋酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_B.連接

9、a處的酶為_C.切斷b處的酶為_a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵【反饋練習(xí)】二、DNA連接酶 分子縫合針4.4.如圖為DNADNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性內(nèi)切核酸酶、DNADNA聚合酶、DNADNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是() A B C DC二、DNA連接酶 分子縫合針5.基因工程技術(shù)也稱為DNA重組技術(shù),下列有關(guān)基因工程的說法錯(cuò)誤的是 ()A.基因工程的基本原理是基因重組B.基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體C.基因工程可以定向改造生物的性狀D.基因工程常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒B【反饋練習(xí)】二、DNA連接酶 分子縫合針質(zhì)粒將外源基因送入受

10、體細(xì)胞, 在受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制. 1.作用：動(dòng)植物病毒噬菌體2.種類：三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖3、運(yùn)載體需具備的條件（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（2）有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)（3）有某些標(biāo)記基因（4）對(duì)受體細(xì)胞無害、易分離能進(jìn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；便于與不同目的基因結(jié)合便于鑒定和篩選三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車5. pBI121 .GAATTC.3 3. 質(zhì) 粒 .CTTAAG.5 實(shí)踐活動(dòng)二實(shí)踐活動(dòng)二 、請(qǐng)請(qǐng)

11、將代表將代表pBI121pBI121質(zhì)粒的序列首尾黏貼在一起，模擬環(huán)化質(zhì)粒質(zhì)粒的序列首尾黏貼在一起，模擬環(huán)化質(zhì)粒三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車5. pBI121 .GAATTC.3 3. 質(zhì) 粒 .CTTAAG.5 實(shí)踐活動(dòng)三、重組實(shí)踐活動(dòng)三、重組DNADNA分子的模擬操作分子的模擬操作三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車 請(qǐng)請(qǐng)用剪刀模擬用剪刀模擬EcoRIEcoRI識(shí)別下面質(zhì)粒識(shí)別下面質(zhì)粒序列和切割位點(diǎn)進(jìn)行序列和切割位點(diǎn)進(jìn)行“切割切割”，將將切下的片段與目的基因片段進(jìn)行重組，并用透明膠條將切口粘連起來切下的片段與目的基因片段進(jìn)行重組，并用透明膠條將切口粘連起來。目的基因1.剪刀剪刀和透明膠條分

12、別代表哪種和透明膠條分別代表哪種“分子工具分子工具” ？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。3.你你插入的插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？片段能稱得上一個(gè)基因嗎？不能，因?yàn)榛虻拈L度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車6.下列有關(guān)質(zhì)粒的敘述中,正確的是 ()A.質(zhì)粒是存在于細(xì)菌中的一種細(xì)胞器 B.質(zhì)粒改造后可用作基因工程的載體C.質(zhì)粒

13、上基因的表達(dá)不遵循中心法則 D.質(zhì)粒必須具有抗生素抗性基因以便篩選B三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車7基因運(yùn)輸工具載體，必須具備的條件之一及理由均正確的是（ ） A能夠復(fù)制，以便目的基因插入其中 B具有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，便于目的基因的表達(dá) C具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選 D對(duì)受體細(xì)胞無害，便于重組DNA的篩選C8.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí),回答下列問題:(1)限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段,其末端類型有 和 。 (2)載體質(zhì)粒用EcoR切割后產(chǎn)生的片段如下:為使載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外,還可用另一種限制性內(nèi)切核酸酶切割,該酶必須具有的特

14、點(diǎn)是 。 平末端切割產(chǎn)生的DNA片段黏性末端與EcoR切割產(chǎn)生的相同黏性末端三、基因進(jìn)入細(xì)胞的載體分子運(yùn)輸車(3)按其來源不同,基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類,即DNA連接酶和DNA連接酶。 (4)基因工程中除質(zhì)粒外,和也可作為載體。 T4噬菌體動(dòng)植物病毒E.coli限制酶DNA連接酶載體對(duì)受體細(xì)胞無害；有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)；有特殊的標(biāo)記基因；能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體衍生物 、動(dòng)植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點(diǎn)：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵 種類： E.coliDNA連接

15、酶、T4 DNA連接酶作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來 課堂小結(jié)DNA含量相對(duì)較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：（注意：不能選擇不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中，因?yàn)椴溉閯?dòng)物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含和線粒體，幾乎不含DNA。）材料用具1.選材：2.試劑：研磨液體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精2mol/L 的NaCl溶液二苯胺試劑蒸餾水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用四、DNA的粗提取與鑒定稱取 ，切碎，放入研缽，倒入 ，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4冰箱中靜置后取

16、；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取 。在上清液中加入體積相等的、 溶液, 靜置23min，溶液中出現(xiàn)的 就是粗提取的DNA 。2.去除雜質(zhì)3.DNA的析出1.破碎細(xì)胞洋蔥研磨液上清液上清液預(yù)冷的酒精白色絲狀物方法步驟 思考：如何評(píng)價(jià)結(jié)果？看提取物顏色看與二苯胺反應(yīng)顏色的深淺DNA純度DNA的量用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取沉淀物晾干。析出DNA四、DNA的粗提取與鑒定將絲狀物或沉淀物溶于 溶液中，加入 試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min4.DNA的鑒定二苯胺2mol/L的NaCl方法步驟 空白對(duì)照組： 在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，

17、將試管置于同等沸水浴中加熱5min。四、DNA的粗提取與鑒定（1）選什么樣的材料實(shí)驗(yàn)更易成功？用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？（2）豬血和雞血，哪個(gè)適合用作提取DNA的材料？操作時(shí)如何防止血液凝固？（3）如果用雞血?jiǎng)游锛?xì)胞做材料，也需要研磨裂解釋放細(xì)胞中的DNA嗎？豬血（哺乳動(dòng)物的成熟紅細(xì)胞）無細(xì)胞核，不適合；雞血中紅細(xì)胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功率更大。充分研磨，可以破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，釋放DNA。加入清水，讓細(xì)胞吸水脹破，釋放DNA。思考與討論：思考與討論：如果是豬肝呢？雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。四、D

18、NA的粗提取與鑒定1.一環(huán)狀DNA分子,設(shè)其長度為1。限制性內(nèi)切核酸酶A在其上的切點(diǎn)位于0.0處;限制性內(nèi)切核酸酶B在其上的切點(diǎn)位于0.3處;限制性內(nèi)切核酸酶C的切點(diǎn)未知。但C單獨(dú)切或與A或B同時(shí)切的結(jié)果如下表,請(qǐng)確定C在該環(huán)形DNA分子的切點(diǎn)應(yīng)位于圖中的( )A.0.2和0.4處 B.0.4和0.6處 C.0.5和0.7處 D.0.6和0.9處AC單切長度為0.8和0.2的兩個(gè)片段C與A同時(shí)切2個(gè)長度為0.2和1個(gè)0.6的片段C與B同時(shí)切2個(gè)長度為0.1和1個(gè)0.8的片段課 堂 測 評(píng)【能力提升】2.有2個(gè)不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進(jìn)行切割，B片段分別用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI進(jìn)行切割。各限制酶