大鼠肝細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響

1、精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載大鼠肝細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)對兩者功能和形態(tài)影響作者：寇晨光曹成波燕曉雯羅兵周巖冰【摘要】目的觀察大鼠肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞體外共同培養(yǎng)時對兩者生長、形態(tài)及功能的影響。方法采用原位二步IV型膠原灌注法、Percoll液密度梯度離心法分離Wistar大鼠肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞;體外將肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞按6：1比例共同培養(yǎng)。觀察不同情況下肝細胞生存時間和形態(tài)，每隔24h檢測培養(yǎng)上清液中清蛋白和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平，并在培養(yǎng)36h用放免法檢測上清液中白細胞介素1（IL擬1）

2、、白細胞介素6（IL擬6）、腫瘤壞死因子a（TNF擬a）精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載1精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載含量。結(jié)果單獨培養(yǎng)組肝細胞的生長、增殖迅速，并向正常肝細胞的形態(tài)演變，肝細胞可培養(yǎng)存活至15d;共同培養(yǎng)組肝細胞生長增殖緩慢，細胞可培養(yǎng)存活至10d。共同培養(yǎng)組上清液中清蛋白水平在24、36、48、60h比單獨培養(yǎng)組低（t=P）;ALT、AST水平在24、36、48、60h比單獨培養(yǎng)組高（t=，P）;共同培養(yǎng)組Kupffer細胞保持IL擬1、IL擬6、TNF擬a分泌功能，而單獨培養(yǎng)組未檢測到IL擬1、IL擬6、TN

3、F擬由結(jié)論大鼠Kupffer細胞和肝實質(zhì)細胞在適宜的培養(yǎng)條件下可進行共同培養(yǎng)，二者可以保持良好的分泌功能，可用于實驗研究?！娟P(guān)鍵詞】肝細胞;枯否細胞；共同培養(yǎng)技術(shù);清蛋白類;細胞因子類；大鼠ABSTRACTObjectiveToobservethegrowth,morphology,andfunctionofhepatocyteswhenculturedinvitrowithKupffercellsinrats.MethodsIn擬situK精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載2精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載collagenasetwo

4、擬stepperfusionmethodandlowspeedgradientcentrifugtionbypercollfluidwereusedtoisolateparenchymalhepaticcells(PHC)andKupffercellsinWistarrat,respectively.CocultivationofPHCandKupffercellswasdoneinvitroaccordingto6：1ratio.Thelivetimeandformofthecellsunderdifferentcircumstanceswereobserved.ALTandASTlevel

5、sinculturesupernatantweredetectedat24以hour擬interval,andtheconcentrationofIL擬1,IL擬6andTNF擬ameasiedbyradioimmunoassayat36hours.ResultsInsolitary擬culturegroup,thehepatocytesgrewquicklyanddeve擬lopedtotheformofnormallivercells,whichcouldsurvive15days;forthoseinco擬culturegroup,thecellsgrew精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類

6、，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載andgeneratedslowly,whichsurvived10days.Thelevelsofalbumeninsupernateofco擬culturegroup,at24h,36h,4and60h,werelowerthanthatinsolitary擬culturegroup(t=,P),andthatofALTandAST,atthesametimepointsasabove,werehigher(t=,P).Inco擬culturegroup,thesecretoryfunctionof

7、IL擬1,IL擬6,andTNF擬wasretained,andinsolitary擬culturegroup,noIL擬1,IL擬6,andTNF擬wweredetected.ConclusionHepatocytesandKupffercellsofratcanbeculturedtogetherunderasuitablecondition,andthefavourablesecretoryfunctionofthecellsbemaintainedforempiricalstudy.KEYWORDShepatocyte;Kupffercell;coculturetechnique;al

8、bumins;精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載cytokines;rats肝細胞分離、培養(yǎng)是研究肝臟和肝細胞的良好方法。盡管肝細胞在體內(nèi)擁有相當強的增殖能力，但要肝細胞在體外保持分化狀態(tài)且能繼續(xù)增殖卻非常困難。要明確影響肝細胞生長、分化和死亡的因素等，仍然面臨認識水平和技術(shù)的挑戰(zhàn)。實驗已證實，肝實質(zhì)細胞與非肝實質(zhì)細胞或非肝細胞的共同培養(yǎng)可有效延長肝細胞的生存時間，促進肝細胞增殖；有助于保持細胞間特有的膽管結(jié)構(gòu)，促進形成縫隙連接；可促進肝細胞的合成和分泌功能；有助于肝細胞維持其解毒功能1擬4。目前進行的共

9、同培養(yǎng)主要有肝細胞擬非肝細胞培養(yǎng)或肝實質(zhì)細胞擬非實質(zhì)細胞培養(yǎng)，而對肝細胞與Kupffer細胞的共同培養(yǎng)的報道還較少。本實驗在體外將肝實質(zhì)細胞與Kupffer細胞共同培養(yǎng)，觀察體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中肝細胞形態(tài)、生長情況、功能的變化精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載以及Kupffer細胞細胞因子分泌情況，旨在為肝細胞在病毒學、免疫學、藥理學及肝細胞移植等方面的研究提供良好的平臺。1材料與方法材料雄性Wistar大鼠6只，體質(zhì)量180200g,SPF級，青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供。RPMI擬1640完全培養(yǎng)基

10、購于中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所;W型膠原酶、g/L胰酶、錐蟲藍均購于美國Sigma公司;Percoll液購自于北京華美公司；考馬斯亮藍G擬250、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均杭州博日生物技術(shù)有限公司提供;125I腫瘤壞死因子擬a(TNF以a放射免疫分析試劑盒、125I白細胞介素1(IL擬1)放射免疫分析試劑盒、125I白細胞精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載介素擬6（IL擬6）放射免疫分析試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。方法肝細胞及Kupffer細胞的分離參照S

11、MEDSROD等5方法加以改良分離收集肝細胞，利用Percoll液密度梯度離心法收集Kupffer細胞。肝細胞和Kupffer細胞的培養(yǎng)及觀察單獨培養(yǎng)組調(diào)整肝細胞密度至X108/L并接種到培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)CO2孵箱，在37C、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。共同培養(yǎng)組將肝細胞按X108/L的細胞密度、Kupffer細胞按X107/L細胞密度（6：1）共同接種于培養(yǎng)皿，置于含體積分數(shù)CO2孵箱，在37C、100%濕度條件下培養(yǎng)，12h后更換新鮮培養(yǎng)液。每培養(yǎng)12h更換培養(yǎng)液并吸取上清液用全自動生化檢測儀檢測清蛋白、ALT、AST、IL擬1、IL擬6、TNF擬%并觀察細胞形態(tài)

12、及生長情況。精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載檢測指標采用考馬斯亮藍G擬250方法測定清蛋白，采用ELISA法分別檢測上清液中ALT、AST、IL擬1、IL擬6及TNF擬a含量統(tǒng)計學處理采用PPMS軟件6進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以“表示，組間比較用兩樣本均數(shù)t檢驗。2結(jié)果形態(tài)學觀察倒置顯微鏡下，新分離的大鼠肝細胞晶瑩透亮，呈圓球形，折光性強，有立體感。臺盼藍染色計數(shù)顯示健康肝細胞的比例平均為92%。同時，新分離的Kupffer細胞胞漿透亮，多呈圓球形，少數(shù)呈多形性，散在分布，大小不一致，約6h后，細胞開始伸展

13、,體積增大,h后細胞充分展開，呈典型的星形或多邊形，邊界不清。在單獨培養(yǎng)組，肝細胞的生長、增殖較共同培養(yǎng)組的細胞迅速，精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載接種4h后肝細胞貼壁、伸展，連接成條索狀;24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積明顯增大；4h后肝細胞貼壁牢固，細胞開始增殖，細胞間出現(xiàn)島狀連接，部分肝細胞呈雙核；72h后肝細胞開始增殖，在原來肝細胞周圍出現(xiàn)透明且體積較小的上皮樣細胞，呈多邊形，逐漸鋪滿培養(yǎng)皿底；10d后培養(yǎng)液的上清中懸浮細胞逐漸增多，細胞開始大量死亡;至培養(yǎng)15d時細胞全部死亡。在共

14、同培養(yǎng)組，24h后絕大多數(shù)肝細胞貼壁，呈扁平狀，體積增大；肝細胞生長增殖緩慢，于96h即開始出現(xiàn)少量的死亡細胞漂浮，至培養(yǎng)10d時細胞基本全部死亡。功能測定共同培養(yǎng)組清蛋白水平在24、36、48、60h低于于單獨培養(yǎng)組（t=，P）;共同培養(yǎng)組ALT、AST水平在24、36、48、60h明顯高于單獨培養(yǎng)組（t=，P）;培養(yǎng)36h后，共同培養(yǎng)組上清液中IL擬1為（士）Ng/LL擬6為（士）ng/LTNF擬精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載9精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載a為(z)pmol/L,而單獨培養(yǎng)組未檢測到上述細胞因子。見表13。表

15、1各組大鼠肝細胞上清中清蛋白水平比較(p/g-1沙4)組另Un24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組上山共同培養(yǎng)組6d*寸圭土與單獨培養(yǎng)組比較，*t=，PO表2各組大鼠肝細胞上清中ALT水平比較(z/UL-1,ds)組另ijn24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組共同培養(yǎng)組6至寸土士與單獨培養(yǎng)組比較，*t=，Po表3各組大鼠肝細胞上清中AST水平比較(z/UL-1,ds)組另ijn24h36h48h60h單獨培養(yǎng)組共同培養(yǎng)組6寸*士與單獨培養(yǎng)組比較，*t=，Po3討論肝細胞的分離及形態(tài)功能觀察肝細胞是肝臟最主要的實質(zhì)細胞類型，正常生理狀況下占60%。肝細胞完成肝臟的絕大部分功能，是肝臟的主要效應(yīng)細胞，

16、同時也是生物及化學損傷的主要靶點。肝細胞性狀的生物學檢測，精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載10精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載包括形態(tài)和功能兩方面。研究發(fā)現(xiàn)，細胞接種2h后就開始貼壁，20h后約有；0%的細胞貼壁，細胞貼壁后開始變平變薄，可見雙核細胞和多核細胞，部分細胞開始小范圍的呈島狀連接;48h變化更明顯，整個細胞變薄并向四周拉平，細胞形成島狀連接成片，可見許多雙核細胞和多核細胞；培養(yǎng)1周后可見少量的新生細胞，透亮，胞漿與胞核的區(qū)別不很明顯;培養(yǎng)2周后，可見大量的新生細胞，也呈島狀生長，極具立體感7擬8。Kupffer細胞在機體防

17、御和肝細胞損傷中的作用Kupffer細胞寄居于肝血竇內(nèi)皮細胞之間或之上，是體內(nèi)固定型巨噬細胞中最大的群體，占巨噬細胞總數(shù)的；0%90%,約占肝細胞總數(shù)的15%9。Kupffer細胞的主要生理功能包括吞噬和清除功能，能吞噬和清除進入肝臟有害于人體的外來抗原、某些有害物質(zhì)以及分泌前列腺素和氧化類物質(zhì)，殺滅腫瘤細胞。精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載11精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載以往研究發(fā)現(xiàn)，?；撬岷椭ф湴被釋λ穆然妓碌母渭毎麚p傷具有保護功能，其保護作用可能是通過抗脂質(zhì)過氧化作用實現(xiàn)的10。在病理情況下，多種因素致使Kupffer

18、細胞活化，活化后其功能則明顯增強，可合成和分泌多種生物活性物質(zhì)，釋放的大量促炎遞質(zhì)如TNF擬a、IL擬1、IL擬6、IL擬8、氧自基、一氧化氮以及花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，能夠參與機體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致和加重肝細胞的損傷11。Kupffer細胞能夠通過表達FasL,與肝細胞表面的Fas直接結(jié)合，誘導(dǎo)肝細胞凋亡12。Kupffer細胞還能募集中性粒細胞和淋巴細胞進入肝組織，加重肝細胞損傷。鑒于Kupffer細胞在肝臟功能中的重要作用，建立適宜的肝細胞Kupffer細胞體外培養(yǎng)體系，對于進行肝細胞移植、肝細胞功能和藥物代謝等的研究有重要意義。本實驗Kupffer細胞生長良好，保持IL擬1、IL擬6、TNF擬a等細胞因子精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，感謝閱讀下載12精選公文范文，管理類，工作總結(jié)類，工作計劃類文檔，歡迎閱讀下載分泌功能。共同培養(yǎng)體系中Kupffer細胞對肝細胞影響共同培養(yǎng)體系即是將兩種細胞（可以來自同一組織，亦可以來自不同的組織）混合共同培養(yǎng)，從而使其中一種細胞的