微生物實驗廈門大學 微生物考研

1、實驗一 光學顯微鏡-油鏡的使用 一、實驗目的1 復習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術2 了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。二、實驗材料和用具細菌三型的染色裝片、香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟(一)觀察前的準備1將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上。2調節(jié)光源。(二)低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉動粗調節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺下降)至發(fā)現(xiàn)物像時，改用細調節(jié)器調節(jié)到物像清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。(三)高

2、倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側面觀察，旋轉轉換器，將高倍鏡轉至正下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細調節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細調節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。(四)油鏡觀察1提起鏡筒約2cm，將油鏡轉至正下方。在玻片標本的鏡檢部位(鏡頭的正下方)滴一滴香柏油。2從側面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3將光線調亮，左眼從目鏡觀察，用粗調節(jié)器將鏡筒徐徐上升(切忌反方向旋轉)，當視野中有物像出現(xiàn)時，再用細調節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到

3、位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側面觀察，將油鏡降下，重復操作直至物像看清為止。仔細觀察并繪圖。4再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復觀察時可比第一次少加香柏油。(五)鏡檢完畢后的工作1移開物鏡鏡頭。 2取出裝片。3清潔油鏡。 4擦凈顯微鏡，將各部分還原。四、注意事項1使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察。2下降鏡頭時，一定要從側面注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦

4、鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、實驗報告1繪制油鏡下的細菌三型圖。2使用油鏡應特別注意哪些問題？3當物鏡從低倍鏡轉到高倍鏡和油鏡時，對照明度有何要求？應如何調節(jié)？實驗二 培養(yǎng)基的配制 一、實驗目的1 學習和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。2 明確培養(yǎng)基的配制原理。二、實驗材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、NaCl。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。三、操作步驟牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制，其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，

5、NaCl 5g，瓊脂1520g，水1000mL，PH 7.47.6 1稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2加熱溶解 此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。3調pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用lmol/L HCl進行調節(jié)。pH的調節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調過頭，以免回調而影

6、響培養(yǎng)基內各離子的濃度。4過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。5分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內，以

7、防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。然后用記號筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8滅菌 9擺斜面 滅菌后，擺斜面，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。10無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內，備用。四、注意事項 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。調pH時要小心操作，避免回調。不同培養(yǎng)基各有配制特點，要

8、注意具體操作。五、實驗報告1 記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量。2配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么?3培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查? 實驗三 高壓蒸汽滅菌一、實驗目的1了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍。2學習高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、實驗器材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，立式高壓蒸汽滅菌鍋等。三、操作步驟1首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 切勿忘記加水，同時水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2放回內層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠

9、，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加到逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內冷空氣必須完全排盡后，才能關上排氣閥，維持所需壓力。5滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌

10、鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養(yǎng)基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。6將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。四、實驗報告l高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？2在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素?3滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義? 實驗四

11、 細菌的革蘭氏染色 一、實驗目的掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟。二、實驗材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(E.coli)菌液，待測菌菌液12種。革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復紅液等)、香柏油、二甲苯；顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、吸水紙、試管、小滴管、酒精燈。三、操作步驟(一)制片1涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌。2干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3固定 目的是殺

12、死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細菌涂片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色l初染 于制片上滴加結晶紫染液，染l min后，用水洗去剩余染料。2媒染 滴加盧戈氏碘液，l min后水洗。3脫色 滴加95%乙醇脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止 (根據(jù)涂片之厚薄需時30s至l min)，水洗。4復染 滴加石炭酸復紅液復染l min，水洗。5濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結果革蘭氏陽性菌染成藍紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。四、注意事項1. 涂片務求均勻，切忌過厚。2在染色過程中，不可使染液干涸。3脫色時間十分重要，過長，則脫

13、色過度，會使陽性菌被染成陰性菌；脫色不夠，則會使陰性菌被染成陽性菌。4老齡菌因體內核酸減少，會便陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。五、實驗報吉(一)繪圖1大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。2金黃色葡萄球菌或蘇云金桿菌革蘭氏染色視野圖。(二)問題和思考1涂片后為什么要進行固定?固定時應注意什么?2什么是革蘭氏染色法?染色過程應注意什么?3. 革蘭氏染色中哪一步是關鍵，為什么？應如何控制這一步？實驗五 霉菌的形態(tài)觀察 一、實驗目的掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，并觀察其形態(tài)特征。二、實驗材料和用具產(chǎn)黃青霉(Penicfillium chrysogenum)、黑曲霉(Aspergillus niger)

14、、黑根霉(Rhizopus nigrians)、總狀毛霉(Mucor racemosus)等斜面菌種。半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20%甘油；培養(yǎng)皿、載玻片、U形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)等。三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)1準備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“冂”形載玻片擱架，在擱梁上放一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)12lC濕熱滅菌30min后，置60烘箱中烘干，備用。2接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾

15、下即可(務必記住接種的位置)。3加培養(yǎng)基 用無菌細口滴管吸取少量融化約60的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應滴得圓而薄，其直徑約為0.5cm(滴加量一般以l/2小滴為宜)。4加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固前用無菌鑷子將皿內蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上，用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁，否則不透氣。5倒保濕劑 每皿倒大約3mL 20%的無菌甘油，使皿內的濾紙完全潤濕，以保持皿內濕度，皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28恒溫培養(yǎng)35d。(二)黑根霉假根的培養(yǎng) 將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的l/2。冷凝后，用接種環(huán)沾取根

16、霉孢子，在平板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內放一無菌載玻片，于28培養(yǎng)23d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構。(三)鏡檢觀察1濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片 從培養(yǎng)1620h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。2粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下

17、，放在染液上。鏡檢。3假根觀察 用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調節(jié)焦距以看清各種構造。4制成永久裝片 制備方法是，輕輕揭去蓋玻片，如果載玻片上有瓊脂，仔細挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。四、實驗報告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖1毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。 2 青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察記錄 各菌種的載玻片標本觀察結果：菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細、色澤、菌絲有隔或無隔等）無性孢子特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結構（有無假根、足細胞匍匐菌絲、囊軸等）實

18、驗六 細菌大小的測定 一、實驗目的掌握用顯微測微尺測量微生物大小的基本方法。二、實驗材料和用具釀酒酵母的玻片標本；香柏油、二甲苯；顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、擦鏡紙。三、操作步驟 l測微尺的構造 顯微鏡測微尺是由目鏡測微尺和鏡臺接物測微尺組成，目鏡測微尺是一塊圓形玻璃片，其中有精確的等分刻度，在5mm刻尺上分50份(圖14一lC)。目鏡測微尺每格實際代表的長度隨使用接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，因此在使用前必須用鏡臺測微尺進行標定。鏡臺測微尺為一專用中央有精確等分線的載玻片(圖141A)，一般將長為1mm的直線等分成100個小格，每格長0.0lmm即10m，是專用于校正目鏡測微

19、尺每格長度的。2目鏡測微尺的標定 把目鏡的上透鏡旋開，將目鏡測微尺輕輕放在目鏡的隔板上，使有刻度的一面朝下。將鏡臺測微尺放在顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上。先用低倍鏡觀察，調焦距，待看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，并使兩尺左邊的一條線重合，向右尋找另外一條兩尺相重合的直線(圖15lB)。3計算方法標定公式：  目鏡測微尺每格長度（m）=兩條重合線間鏡臺測微尺的格數(shù)×10÷兩條重合線間目鏡測微尺的格數(shù) 例如，目鏡測微尺20個小格等于鏡臺測微尺3小格，已知鏡臺測微尺每格為10m，則3小格的長度為3×

20、;10=30m，那么相應地在目鏡測微尺上每小格長度為3×10÷20=1.5m。用以上計算方法分別校正低倍鏡、高倍鏡及油鏡下目鏡測微尺每格實際長度。4菌體大小的測定 將鏡臺測微尺取下，分別換上大腸桿菌及金黃色葡萄球菌玻片標本，先在低倍鏡和高倍鏡下找到目的物，然后在油鏡下用目鏡測微尺測量菌體的大小。先量出菌體的長和寬占目鏡測微尺的格數(shù)，再以目鏡測微尺每格的長度計算出菌體的長和寬。并詳細記錄于表151中。例如，目鏡測微尺在這架顯微鏡下，每格相當于1.5m，測量的結果，若菌體的平均長度相當于目鏡測微尺的2格，則菌體長應為3×1.5m=3.0m。一般測量菌體的大小，應測定1

21、020個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。四、注意事項1鏡臺測微尺的玻片很薄，在標定油鏡頭時，要格外注意，以免壓碎鏡臺測微尺或損壞鏡頭。2標定目鏡測微尺時要注意準確對正目鏡測微尺與鏡臺測微尺的重合線。五、實驗報告1目鏡測微尺標定結果：低倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 m。高倍鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 m。油鏡下 倍目鏡測微尺每格長度是 m。2菌體大小測定結果：菌號大腸桿菌測定結果金黃色葡萄球菌的直徑大小測定結果目鏡測微尺格數(shù)實際長度目鏡測微尺格數(shù) 實際直徑/µm寬長寬長      實驗七 微生物數(shù)量的測定 一、實驗目的1了解血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。2掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。二、實驗器材1菌種 釀酒酵母2儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。三、操作步驟l菌懸液制備 以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃