外源性DNA殘留量測定法qPCR法

1、重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體外源性DNA殘留量測定法(qPCR法)1原理實時定量PCR（qPCR）擴(kuò)增分2個階段，指數(shù)增長階段和之后出現(xiàn)的非指數(shù)平臺階段。在指數(shù)增長階段，每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加一倍。然而，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系組成成分的消耗，其中的一種或多種成分限制反應(yīng)，產(chǎn)物增長速度變慢，反應(yīng)進(jìn)入平臺期。反應(yīng)最初，雖然產(chǎn)物呈指數(shù)增長，但是熒光處于背景水平，檢測不到熒光增加。但積累了足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，才可檢測到的熒光信號，這個循環(huán)數(shù)叫初始循環(huán)數(shù)，即CT。CT值主要由擴(kuò)增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定的。如果模板初始濃度高，只需要較少的擴(kuò)增循環(huán)就可以積累足夠的產(chǎn)物，產(chǎn)生高過背景的熒

2、光信號，因此，反應(yīng)就有一個小或早出現(xiàn)的CT；相反，如果模板初始濃度低，需要較多的擴(kuò)增循環(huán)才能產(chǎn)生高過背景的熒光信號，反應(yīng)就有一個大或遲出現(xiàn)的CT。兩者之間關(guān)系的建立是qPCR用于定量的依據(jù)。2主要儀器表2 儀器信息表名 稱廠 家型 號實時定量PCR儀Bio-RadCFX Connect3主要試劑表3 試劑信息表名 稱廠 家規(guī) 格殘留DNA樣品制備試劑盒ABI1） Lysis Buffer,2 bottles,50ml/bottle;2） Binding Solution,1 empty bottle;3） Wash Buffer Concentrate, 2 bottles, 26 ml/bo

3、ttle;4） Elution Buffer; 1 bottle, 25ml;5） Proteinase K (PK) Buffer, 1 bottle, 50ml;6） Magnetic Particles, 2 tubes, 1.5 ml/tube;7） Proteinase K, 2 tubes, 20 mg/ml, 1.25 ml;8） Yeast tRNA, 2 tubes,10mg/ml,0.5ml;Glycogen, 2 tubes,5mg/ml,1.0ml/tube.殘留DNA定量檢測試劑盒（CHO）ABI1) DNA Control,1 bottle,40l;2) DNA D

4、ilution Buffer(DDB),1 bottle,7ml;3) 2×Environmental Master Mix, 2 tubes,0.75ml/tube;4) 10×DNA Resl-Time PCR Assay Mix, 1 tube,300l;5) Negative Control, 1 tube,1.0ml.4溶液配制4.1 蛋白酶K混合液（新配）附件13-14重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體外源性DNA殘留量測定法（qPCR）1 reaction（100l/sample）10 reaction（100l/sample）Proteinase K1

5、0l100lProteinase K Buffer60l600l4.2 裂解混合液（新配）試 劑體 積（l）Glycogen（5mg/ml）180tRNA（10mg/ml）4Lysis Buffer7600合 計77844.3 DNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋Tube labelDilutionpg/lpg/ reactionDNA Control30000300000SD110l DNA Control+990l DDB3003000SD250l SD1+450l DDB30300SD350l SD2+450l DDB330SD450l SD3+450l DDB0.33SD550l SD4+450l DDB

6、0.030.3SD650l SD5+450l DDB0.0030.03NTCDDB00注：DNA標(biāo)準(zhǔn)品溶液4放置保存1天，-20放置保存1周。5測定方法5.1樣品處理5.1.1除蛋白1）在2ml離心管中加入100l樣品；2） 每100l的樣品中加入70l的蛋白酶K混合液，混合均勻，56水浴30min；3） 每100l的樣品中加入360l的裂解液，室溫裂解2小時以上。5.1.2 DNA的純化1）磁珠使用前于37溫浴10min，高速渦旋，徹底懸浮磁珠；2）每100l的樣品加入30l的磁珠懸浮液；3）每100l的樣品加入300l的Binding Solution，渦旋混合5min；4）12000r/

7、min離心30sec，將離心管放置于磁力架上，靜置5min直至溶液清澈，棄上清；5）從磁力架上取下離心管，加入300l的Wash Buffer，渦旋混合5 sec；6）12000r/min離心30sec，將離心管放置于磁力架上，靜置2min，棄上清；7）重復(fù)步驟6）1次，打開離心管的蓋子，室溫下風(fēng)干；8）加入50l的Elution Buffer，高速渦旋10 sec，70處理10min，在溫浴過程中，渦旋23次；附件13-14重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體外源性DNA殘留量測定法（qPCR）9）12000r/min離心30sec，將離心管放置于磁力架上，靜置2min，將含有洗脫DNA

8、的液體轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管中，用于進(jìn)行qPCR反應(yīng)。5.2 PCR反應(yīng)體系1）標(biāo)準(zhǔn)品、NTC和樣品均做2個復(fù)孔；2）反應(yīng)母液用量按表4進(jìn)行計算：表4 PCR反應(yīng)體系Kit ReagentsVolume for 1 30-lreaction（l）Volume for 36 30-lreaction（l）Negative Control27210×DNA Resl-Time PCR Assay Mix31082×Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合 計307205.3 PCR儀運(yùn)行程序設(shè)置 PCR反應(yīng)體系1） 標(biāo)

9、準(zhǔn)品、NTC和樣品均做2個復(fù)孔；2） 反應(yīng)母液用量按表5進(jìn)行計算：表5 PCR反應(yīng)體系Kit ReagentsVolume for 1 30-lreaction（l）Volume for 36 30-lreaction（l）Negative Control27210×DNA Resl-Time PCR Assay Mix31082×Environmental Master Mix15540DNA template10N/A合 計30720 PCR儀運(yùn)行程序設(shè)置1）熒光基團(tuán)選擇FAM；2）96孔反應(yīng)模塊設(shè)置見下表，樣品根據(jù)實際數(shù)量依次設(shè)置：123456789101112ASD1SD1樣品1樣品1BSD2SD2樣品2樣品2CSD3SD3樣品3樣品3DSD4SD4ESD5SD5FSD6SD6GNTCNTCH附件13-14重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體外源性DNA殘留量測定法（qPCR）3）PCR反應(yīng)條件設(shè)置步 驟溫 度時 間（min:sec）19510:002950:103600:304GOTO 2，39循環(huán)4） 運(yùn)行上述設(shè)置的程序。6接受標(biāo)準(zhǔn)