第3章細(xì)胞分離技術(shù)

1、第三章第三章 細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞肺細(xì)胞包含體肺細(xì)胞包含體大腸桿菌大腸桿菌 成為最常用的一種外源基因表達(dá)工具，具有容易培養(yǎng)、生長繁殖快等特點(diǎn)。釀酒酵母釀酒酵母 具有簡單糖基化，高生長率，低蛋白酶及清晰的遺傳體系等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用也較為廣泛。缺陷：缺陷：不能將產(chǎn)物高水平釋放到培養(yǎng)基中；不能解決胞內(nèi)產(chǎn)物及包含體的問題。第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞分離細(xì)胞分離生物懸浮液生物懸浮液大部分是水大部分是水其次是微生物和動(dòng)、植物或碎片及少量其次是微生物和動(dòng)、植物或碎片及少量未用完的培養(yǎng)基未用完的培養(yǎng)基第三部分是代謝產(chǎn)物第三部分是代謝產(chǎn)物一、過濾一、過濾是在某一支撐物上放過濾介質(zhì)，注入含固體顆是在某一支撐

2、物上放過濾介質(zhì)，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下。粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下。是固液分離的常用是固液分離的常用方法方法之一。之一。根據(jù)被分離的物質(zhì)顆粒大小，分為一般過濾和根據(jù)被分離的物質(zhì)顆粒大小，分為一般過濾和膜過濾。膜過濾。1.影響過濾的因素影響過濾的因素1).菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌2).培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉培養(yǎng)基：黃豆，花生，淀粉3).發(fā)酵時(shí)間：菌絲自溶前放罐發(fā)酵時(shí)間：菌絲自溶前放罐2.改善過濾方法改善過濾方法1)1)助濾劑：質(zhì)地堅(jiān)硬不可壓縮性固體助濾劑：質(zhì)地堅(jiān)硬不可壓縮性固體v機(jī)理：表面吸附膠體及不可壓縮型格子結(jié)構(gòu)機(jī)理：表面吸附膠體及不

3、可壓縮型格子結(jié)構(gòu)v使用方法：使用方法：a a 預(yù)先制成濾餅預(yù)先制成濾餅b b 助濾劑混入懸浮液中一起過濾助濾劑混入懸浮液中一起過濾(1)常用助濾劑：常用助濾劑：硅藻土，珍珠巖，活性碳硅藻土，珍珠巖，活性碳v應(yīng)用優(yōu)化因素：應(yīng)用優(yōu)化因素： a a 單位質(zhì)量助濾劑的濾液最大產(chǎn)量單位質(zhì)量助濾劑的濾液最大產(chǎn)量 b b 使用周期使用周期 c c 流速流速 濾餅濾餅傳統(tǒng)的過濾傳統(tǒng)的過濾 (2)過濾設(shè)備過濾設(shè)備: 從傳統(tǒng)的板框式過濾機(jī)到旋轉(zhuǎn)式真空過濾設(shè)備，種類很多。板框式過濾機(jī)板框式過濾機(jī)螺旋式過濾機(jī)螺旋式過濾機(jī)1.1.重力沉降重力沉降: : 指當(dāng)懸浮液靜置時(shí)，密度較大的固體顆粒指當(dāng)懸浮液靜置時(shí)，密度較大的固

4、體顆粒在在重力的作用重力的作用下逐漸下沉下逐漸下沉 通常十分緩慢通常十分緩慢二、離心沉降二、離心沉降是化工過程中常用的氣固、液是化工過程中常用的氣固、液固、液液分離的手段。也是下固、液液分離的手段。也是下游加工過程的基本分離技術(shù)。游加工過程的基本分離技術(shù)。重力沉降式液固分離設(shè)備重力沉降式液固分離設(shè)備菌體細(xì)胞體積小，沉降慢，先將其菌體細(xì)胞體積小，沉降慢，先將其細(xì)胞凝細(xì)胞凝聚成較大凝聚體顆粒聚成較大凝聚體顆粒后再進(jìn)行沉降操作。后再進(jìn)行沉降操作。方法：中性鹽方法：中性鹽 高分子絮凝劑高分子絮凝劑2.2.離心沉降離心沉降 利用懸浮液或乳濁液中利用懸浮液或乳濁液中密度不同密度不同的組分在離心的組分在離心

5、力場中迅速沉降分層，實(shí)現(xiàn)固液分離力場中迅速沉降分層，實(shí)現(xiàn)固液分離 操作方式：間歇式、連續(xù)式操作方式：間歇式、連續(xù)式 型式：管式、套筒、碟片式型式：管式、套筒、碟片式針對固體顆粒小、液體粘度大、過濾速度慢甚針對固體顆粒小、液體粘度大、過濾速度慢甚至難以過濾的懸浮液有效。至難以過濾的懸浮液有效。大型離心機(jī)大型離心機(jī)小型離心機(jī)小型離心機(jī)使懸浮液在使懸浮液在離心力場離心力場作用下產(chǎn)生的離心力壓力作用下產(chǎn)生的離心力壓力作用在過濾介質(zhì)上，使液體通過過濾介質(zhì)成為濾作用在過濾介質(zhì)上，使液體通過過濾介質(zhì)成為濾液液是離心與過濾單元操作的集成，分離效率更高是離心與過濾單元操作的集成，分離效率更高適用于菌體細(xì)胞、血球

6、、胞內(nèi)細(xì)胞器、病毒以及適用于菌體細(xì)胞、血球、胞內(nèi)細(xì)胞器、病毒以及蛋白質(zhì)的分離，應(yīng)用于液液相間的分離。蛋白質(zhì)的分離，應(yīng)用于液液相間的分離。離離 心心 分分 離離離心分離離心分離離心分離模式圖離心分離模式圖懸浮液中的固體粒子主要受三個(gè)力作用，浮力、懸浮液中的固體粒子主要受三個(gè)力作用，浮力、粘滯力和重力。要使粘滯力和重力。要使固體和液體分離，必須克服固體和液體分離，必須克服粘滯力的束縛是主要方面粘滯力的束縛是主要方面。只須提高離心加速度只須提高離心加速度（轉(zhuǎn)數(shù)）（轉(zhuǎn)數(shù)），即可獲得較好的分離效果。，即可獲得較好的分離效果。常數(shù)離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)小于常數(shù)離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)小于30003000 中速離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)中速離

7、心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)3000-50003000-5000 高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)大于高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)大于50005000 超高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)超高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)數(shù)20000-100000020000-1000000 1) 差速離心差速離心在密度均一的介質(zhì)中在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器, ,以以菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心菌體細(xì)胞的收集或除去為目的的固液離心分離。又稱一級分級分離。分離。又稱一級分級分離。離心力：離心力：600g600g；10000g10000g；100000g100000g離心分離法離心分離法2)

8、2)密度梯度離心密度梯度離心： 用一定的用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液置于介質(zhì)，將細(xì)胞混懸液置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心場作用使細(xì)胞分的頂部，通過重力或離心場作用使細(xì)胞分離。離。 介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、多聚蔗糖介質(zhì)：蔗糖、氯化銫、多聚蔗糖3)3)離心過濾：離心過濾： 將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓中結(jié)合離心力作用將料液送入有孔的轉(zhuǎn)鼓中結(jié)合離心力作用進(jìn)行過濾。進(jìn)行過濾。 以離心力為推動(dòng)力完成過濾操作以離心力為推動(dòng)力完成過濾操作，兼有離，兼有離心和過濾雙重作用。心和過濾雙重作用。分離效率遠(yuǎn)高于單獨(dú)分離效率遠(yuǎn)高于單獨(dú)離心或過濾。離心或

9、過濾。 （1）管式離心機(jī)）管式離心機(jī) 最簡單，可提供較大離心力最簡單，可提供較大離心力 可用冷卻水冷卻可用冷卻水冷卻 懸浮液由管底進(jìn)，澄清液由管口流出懸浮液由管底進(jìn)，澄清液由管口流出離心分離設(shè)備離心分離設(shè)備（2）碟片式離心機(jī)）碟片式離心機(jī) 有許多等間隔的碟形分離板有許多等間隔的碟形分離板 沉降面積大沉降面積大 轉(zhuǎn)數(shù)較低，轉(zhuǎn)數(shù)較低，10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分分碟片式離心機(jī)碟片式離心機(jī)第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎條件：條件：目標(biāo)產(chǎn)物不在發(fā)酵液中，而是存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)沉積。產(chǎn)物包裹在生物體內(nèi)，屬胞內(nèi)產(chǎn)物。 胞內(nèi)產(chǎn)物與培養(yǎng)液的隔離是由于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜等屏障引起的，

10、細(xì)胞破碎就是要除去此屏障，釋放胞內(nèi)產(chǎn)物。一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)一、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎是指選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)是指選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。械的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。其中其中細(xì)胞壁細(xì)胞壁的破碎最為關(guān)鍵。主要是破的破碎最為關(guān)鍵。主要是破碎細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的碎細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵共價(jià)鍵。細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)菌的細(xì)胞壁細(xì)菌的細(xì)胞壁不是堅(jiān)硬的剛性球體，而是不是堅(jiān)硬的剛性球體，而是頗頗具彈性具彈性的。繃得緊緊的原生質(zhì)會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生的。繃得緊緊的原生質(zhì)會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定的堅(jiān)韌度。一定的堅(jiān)韌度。細(xì)菌的細(xì)胞壁經(jīng)酸性水解后，可得到如下產(chǎn)物細(xì)菌的細(xì)胞壁經(jīng)酸性水解后，可得到如

11、下產(chǎn)物(1)(1)肽聚糖；肽聚糖；(2)(2)氨基酸；氨基酸；(3)(3)磷壁酸；磷壁酸； (4) (4) 糖糖類；類；(5)(5)脂質(zhì)脂質(zhì)1.細(xì)菌1)G+菌的細(xì)胞壁肽聚糖肽聚糖(peptidoglycan):磷壁酸磷壁酸(teichoic acid)細(xì)胞壁厚度細(xì)胞壁厚度 較厚，較厚，2030nm細(xì)胞壁分層細(xì)胞壁分層 不分層不分層肽聚糖含量肽聚糖含量 含量高（含量高（30-70）肽聚糖層數(shù)肽聚糖層數(shù) 層數(shù)多層數(shù)多交聯(lián)度交聯(lián)度 交聯(lián)度高交聯(lián)度高磷壁酸磷壁酸 有有脂多糖脂多糖 無無DAP 無無2)G的細(xì)胞壁細(xì)胞壁厚度細(xì)胞壁厚度 較薄較薄10-15nm細(xì)胞壁分層細(xì)胞壁分層 分層：分層： 外壁層外壁層

12、 6-10nm 內(nèi)壁層內(nèi)壁層2-3nm肽聚糖含量肽聚糖含量 只占組分的只占組分的5-10%肽聚糖層數(shù)肽聚糖層數(shù) 低，一般低，一般1-2層層肽聚糖交聯(lián)度肽聚糖交聯(lián)度 較低較低磷壁酸磷壁酸 無無脂多糖脂多糖 有有 抗原決定因子抗原決定因子 O-抗原抗原 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)LPS層的主要功能構(gòu)成某些革蘭氏陰性細(xì)菌致病物質(zhì)構(gòu)成某些革蘭氏陰性細(xì)菌致病物質(zhì)內(nèi)毒素內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)；的物質(zhì)基礎(chǔ)；起細(xì)菌自我保護(hù)作用，它可以阻止溶菌酶、起細(xì)菌自我保護(hù)作用，它可以阻止溶菌酶、抗生素和染料等侵入菌體，也可以阻止周質(zhì)空抗生素和染料等侵入菌體，也可以阻止周質(zhì)空間中的酶外漏；間中的酶外漏；作為重要的抗原因子決定了革蘭氏陰性菌抗作

13、為重要的抗原因子決定了革蘭氏陰性菌抗原的多樣性；原的多樣性；是許多噬菌體吸附的受體。是許多噬菌體吸附的受體。外層：甘露聚糖（外層：甘露聚糖（約占約占30%30%，以，以-糖苷鍵聯(lián)結(jié)（并非所有酵母菌都有）糖苷鍵聯(lián)結(jié)（并非所有酵母菌都有） 內(nèi)層：葡聚糖（內(nèi)層：葡聚糖（約占約占30-40%30-40%，由，由D-D-葡萄糖以葡萄糖以-糖苷鍵聯(lián)結(jié)）糖苷鍵聯(lián)結(jié)）中間層：蛋白質(zhì)（中間層：蛋白質(zhì)（含含6-8%，多為酶類），多為酶類） 細(xì)胞壁細(xì)胞壁a.a.細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)：酵母細(xì)胞壁呈酵母細(xì)胞壁呈“三明治三明治”結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)2.2.酵母細(xì)胞壁酵母細(xì)胞壁 b.b.壁外成分：壁外成分： 有些菌壁外含有由多糖構(gòu)成

14、的類似莢膜的結(jié)有些菌壁外含有由多糖構(gòu)成的類似莢膜的結(jié)構(gòu)。構(gòu)。 包括異多糖、甘露聚糖和淀粉類物質(zhì)。包括異多糖、甘露聚糖和淀粉類物質(zhì)。 c.c.細(xì)胞壁的少量組分細(xì)胞壁的少量組分脂類和幾丁質(zhì)（脂類和幾丁質(zhì)（chitin)chitin)：為聚乙酰氨基葡萄糖為聚乙酰氨基葡萄糖 幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量幾丁質(zhì)并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因種而異。裂殖酵母一般不含幾丁質(zhì)，釀酒酵也因種而異。裂殖酵母一般不含幾丁質(zhì)，釀酒酵母含母含1 12%2%，有的假菌絲酵母含量超過了，有的假菌絲酵母含量超過了2%2%。3.3.植物細(xì)胞壁植物細(xì)胞壁植物細(xì)胞壁由胞間層、初生壁、次生壁組成。植物細(xì)胞壁由胞間層、

15、初生壁、次生壁組成。胞間層胞間層: :位于兩個(gè)相鄰細(xì)胞之間，為兩細(xì)胞共有的一層膜；初生壁初生壁: :纖維素、果膠質(zhì)及結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成；次生壁次生壁: :初生壁內(nèi)繼續(xù)積累纖維素和半纖維素，稱為次生壁。二、細(xì)胞破碎動(dòng)力學(xué)二、細(xì)胞破碎動(dòng)力學(xué)1.1.細(xì)胞破碎的目的：細(xì)胞破碎的目的： 使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞或破碎，增大其通透性，使細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)產(chǎn)物得到釋放。2.2.破碎率的評價(jià)破碎率的評價(jià)1)1)直接計(jì)數(shù)：直接計(jì)數(shù)：對適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)對適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，可以通過平板計(jì)數(shù)技術(shù)或在血行計(jì)數(shù)，可以通過平板計(jì)數(shù)技術(shù)或在血球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察來實(shí)現(xiàn)最終染球細(xì)胞器上用顯微鏡觀察來實(shí)現(xiàn)最終染色細(xì)胞的

16、計(jì)數(shù)。色細(xì)胞的計(jì)數(shù)。 （1 1）計(jì)數(shù)器）計(jì)數(shù)器 （2 2）平板計(jì)數(shù)）平板計(jì)數(shù) （3 3）顯微鏡）顯微鏡2)2)間接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法 在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的在細(xì)胞破碎后，測定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量化合物的量 ( (例如可溶性蛋白、酶等例如可溶性蛋白、酶等) )進(jìn)行計(jì)算。進(jìn)行計(jì)算。 （1 1） 活性測定活性測定（2 2） 電導(dǎo)率測定：破碎后，帶電荷的內(nèi)容物釋放，使懸電導(dǎo)率測定：破碎后，帶電荷的內(nèi)容物釋放，使懸浮液的導(dǎo)電率增加。浮液的導(dǎo)電率增加。3)細(xì)胞破碎率：細(xì)胞破碎率：%100%00NNNX隨著破碎的進(jìn)行，N(未破碎細(xì)胞)不斷發(fā)生變化，而N0 (總細(xì)胞)是恒定不變的，

17、因此破碎率也不斷發(fā)生改變。三、細(xì)胞破碎方法三、細(xì)胞破碎方法方法方法:各種機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法，或相結(jié)合方法。各種機(jī)械破碎法和化學(xué)破碎法，或相結(jié)合方法。機(jī)械破碎機(jī)械破碎:細(xì)胞所受的作用力主要有壓縮力和剪切力?；瘜W(xué)破碎化學(xué)破碎:利用化學(xué)或生化試劑（酶）改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率；或者完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)。壓擠壓擠化學(xué)滲透化學(xué)滲透產(chǎn)物釋放產(chǎn)物釋放（一）機(jī)械破碎（一）機(jī)械破碎主要有主要有高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎高壓勻漿法、珠磨法、撞擊破碎和超聲波破碎和超聲波破碎特點(diǎn)：處理量大，破碎效率高，速度快。特點(diǎn)：處理量大，破碎效率高

18、，速度快。方法方法技術(shù)技術(shù)原理原理效果效果成本成本舉例舉例化學(xué)法化學(xué)法滲透沖擊滲透沖擊滲透壓破壞細(xì)胞滲透壓破壞細(xì)胞溫和溫和便宜便宜血紅細(xì)胞的破血紅細(xì)胞的破壞壞酶消化法酶消化法細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞壁被消化，使細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎溫和溫和昂貴昂貴增溶法增溶法表面活性劑溶解細(xì)表面活性劑溶解細(xì)胞壁胞壁溫和溫和適中適中膽鹽作用于大膽鹽作用于大腸桿菌腸桿菌脂溶法脂溶法有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)壁并使之失穩(wěn)適中適中便宜便宜甲苯破碎酵母甲苯破碎酵母細(xì)胞細(xì)胞堿處理法堿處理法堿的皂化作用使細(xì)堿的皂化作用使細(xì)胞壁融解胞壁融解劇烈劇烈便宜便宜 細(xì)胞化學(xué)破碎法細(xì)胞化學(xué)破碎法方法方法技術(shù)技術(shù)原理原理效果效果

19、成本成本舉例舉例機(jī)械法機(jī)械法勻漿法（片型）勻漿法（片型）細(xì)胞被攪拌器劈碎細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞物細(xì)胞研磨法研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎細(xì)胞被研磨物磨碎適中適中便宜便宜超聲波法超聲波法用超聲波的空穴作用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎用使細(xì)胞破碎適中適中昂貴昂貴細(xì)胞懸浮液小細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理規(guī)模處理勻漿法（孔型）勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎切力而破碎劇烈劇烈適中適中細(xì)胞懸浮液大細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理規(guī)模處理珠磨破碎法珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎珠搗碎劇烈劇烈便宜便宜細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞懸浮液和

20、植物細(xì)胞的大植物細(xì)胞的大規(guī)模處理規(guī)模處理 細(xì)胞物理破碎法細(xì)胞物理破碎法1.1.高壓勻漿法高壓勻漿法1 1）結(jié)構(gòu)和原理）結(jié)構(gòu)和原理高壓勻漿器，由高壓泵和勻高壓勻漿器，由高壓泵和勻漿閥組成。見圖漿閥組成。見圖高壓勻漿高壓勻漿操作壓力：5070MPa原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力的綜合作用下破碎。原理：原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力的綜合作用下破碎。操作壓力：5070MPa剪切剪切J

21、J-2組織搗碎勻漿機(jī) 1) 影響破碎率的因素影響破碎率的因素（P36P36圖）圖）2) 適用范圍和操作注意點(diǎn)適用范圍和操作注意點(diǎn)酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達(dá)酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達(dá)到到20%左右，團(tuán)狀和絲狀及小的左右，團(tuán)狀和絲狀及小的G+菌不適。菌不適。1)壓力壓力2)循環(huán)操作次數(shù)溫度循環(huán)操作次數(shù)溫度3)細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度4)細(xì)胞生長速率細(xì)胞生長速率 不同生長期及不同培養(yǎng)條件下得到的細(xì)胞不同生長期及不同培養(yǎng)條件下得到的細(xì)胞在破碎效果也不一樣。在破碎效果也不一樣。破碎效率隨細(xì)胞比生長速率減小而降低。破碎效率隨細(xì)胞比生長速率減小而降低。主要原因是緩慢的生長條件更適

22、合細(xì)胞發(fā)育成堅(jiān)硬的細(xì)胞壁。對料液作冷卻處理，保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的活性。對料液作冷卻處理，保護(hù)目標(biāo)產(chǎn)物的活性。2.2.珠磨法珠磨法 1) 1) 結(jié)構(gòu)與原理結(jié)構(gòu)與原理-見圖見圖 2) 2) 適用范圍和操作注意點(diǎn)適用范圍和操作注意點(diǎn) 大多數(shù)微生物的細(xì)胞破碎大多數(shù)微生物的細(xì)胞破碎將細(xì)胞在珠磨機(jī)中破碎被認(rèn)為是最有效的一種將細(xì)胞在珠磨機(jī)中破碎被認(rèn)為是最有效的一種細(xì)胞物理破碎法。破碎微生物細(xì)胞用的珠磨機(jī)細(xì)胞物理破碎法。破碎微生物細(xì)胞用的珠磨機(jī)有多種形式。有多種形式。動(dòng)力分離器，可調(diào)節(jié)其縫隙動(dòng)力分離器，可調(diào)節(jié)其縫隙攪拌磨簡圖在這類設(shè)備中，由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和珠子在這類設(shè)備中，由于圓盤的高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞

23、懸浮液和珠子相互攪動(dòng)，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾相互攪動(dòng)，細(xì)胞的破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動(dòng)引起的。破碎作用將遵循一級動(dòng)力學(xué)定律。動(dòng)引起的。破碎作用將遵循一級動(dòng)力學(xué)定律。珠磨珠磨3)3)影響破碎效果的因素：影響破碎效果的因素： 磨珠大小、攪拌速度、流量、細(xì)胞濃度、裝珠量、溫度等。 要想獲得一個(gè)最大破碎率:要有較高的裝珠量、較高的攪拌速度、較小的磨珠直徑和適中的細(xì)胞濃度。WSK臥式高效全能珠磨機(jī)ZM系列臥式密閉珠系列臥式密閉珠(砂砂)磨機(jī)磨機(jī)撞擊撞擊3.3.噴霧撞擊破碎噴霧撞擊破碎 細(xì)胞是彈性體，難于破碎，將其冷凍成為細(xì)胞是彈性體，難于破碎，將其冷凍成為剛性球體，可以降

24、低破碎難度。剛性球體，可以降低破碎難度。 懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成微粒子，懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成微粒子，在高速載氣作用下送入破碎室，高速撞擊在高速載氣作用下送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。 聲頻高于聲頻高于151525KHZ25KHZ的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸?shù)某暡ㄔ诟邚?qiáng)度聲能輸入下，利用空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使入下，利用空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎。超聲波超聲波氣泡形成氣泡形成氣泡長大氣泡長大破碎破碎超聲波的聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度超聲波的聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型均影響破碎效率。及菌種類型

25、均影響破碎效率。缺點(diǎn)：產(chǎn)生化學(xué)自由基團(tuán)缺點(diǎn)：產(chǎn)生化學(xué)自由基團(tuán)氧化產(chǎn)物，且噪氧化產(chǎn)物，且噪聲大。聲大。 4.4.超聲波破碎超聲波破碎作用原理：作用原理： 將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量將電能通過換能器轉(zhuǎn)換為聲能，這種能量通過液體介質(zhì)變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，通過液體介質(zhì)變成一個(gè)個(gè)密集的小氣泡，這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生象小炸彈一樣這些小氣泡迅速炸裂，產(chǎn)生象小炸彈一樣的能量，從而起到破碎細(xì)胞的作用。的能量，從而起到破碎細(xì)胞的作用。超聲波破碎過程的效率受下列幾個(gè)參數(shù)影響：超聲波破碎過程的效率受下列幾個(gè)參數(shù)影響：(1)(1)振幅：振幅直接與聲能有關(guān)，影響蛋白質(zhì)振幅：振幅直接與聲能有關(guān)，影響蛋白質(zhì)釋放

26、的比速度。釋放的比速度。(2)(2)細(xì)胞懸浮液的黏度：黏度影響能耗并會(huì)抑細(xì)胞懸浮液的黏度：黏度影響能耗并會(huì)抑制空穴現(xiàn)象制空穴現(xiàn)象。(3)(3)表面張力：添加表面活性劑或從細(xì)胞中釋表面張力：添加表面活性劑或從細(xì)胞中釋放出表面活性物質(zhì)放出表面活性物質(zhì)( (如蛋白質(zhì)如蛋白質(zhì)) )，能顯著地，能顯著地影響聲波破碎效率。因?yàn)閺?qiáng)烈氣泡在氣影響聲波破碎效率。因?yàn)閺?qiáng)烈氣泡在氣- -液液界面上會(huì)促使蛋白質(zhì)變性和空穴清除。界面上會(huì)促使蛋白質(zhì)變性和空穴清除。 (4)(4)被處理懸浮液的體積：大體積需要高的被處理懸浮液的體積：大體積需要高的聲能引起強(qiáng)烈的渦流和大的氣泡形成。聲能引起強(qiáng)烈的渦流和大的氣泡形成。(5)(5

27、)細(xì)胞懸浮液的流速。細(xì)胞懸浮液的流速。 聲波破碎是細(xì)胞破碎中的一種普通方法，聲波破碎是細(xì)胞破碎中的一種普通方法，在許多實(shí)驗(yàn)室研究或生化物質(zhì)的分離制備在許多實(shí)驗(yàn)室研究或生化物質(zhì)的分離制備中都能見到，但是要向大量細(xì)胞懸浮液中中都能見到，但是要向大量細(xì)胞懸浮液中通入足夠的能量是很因難的，故在工業(yè)范通入足夠的能量是很因難的，故在工業(yè)范圍中還未采用這種方法。圍中還未采用這種方法。超聲破碎超聲破碎超聲波超聲波超聲波破碎儀超聲波破碎儀 5 5、其他類型機(jī)械破碎法、其他類型機(jī)械破碎法X-pressX-press法法：將濃縮的細(xì)胞懸浮液低溫冷卻：將濃縮的細(xì)胞懸浮液低溫冷卻形成冰晶，再施以高壓，高壓力沖擊造成形成

28、冰晶，再施以高壓，高壓力沖擊造成冰晶磨損使細(xì)胞破裂。冰晶磨損使細(xì)胞破裂。微波法微波法：胞內(nèi)物質(zhì)局部受熱，內(nèi)壓升高使：胞內(nèi)物質(zhì)局部受熱，內(nèi)壓升高使細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞或裂紋，小分子能夠出細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞或裂紋，小分子能夠出入細(xì)胞，細(xì)胞仍保持其形態(tài)。入細(xì)胞，細(xì)胞仍保持其形態(tài)。此法處理蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)隨微波場方此法處理蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu)隨微波場方向變化而被破壞，蛋白質(zhì)分子纏繞成球，向變化而被破壞，蛋白質(zhì)分子纏繞成球，改變?nèi)芙庑裕阌诎w中重組蛋白的回改變?nèi)芙庑?，便于包含體中重組蛋白的回收。收。（二）化學(xué)和生物化學(xué)滲透（二）化學(xué)和生物化學(xué)滲透1.1.酸堿法酸堿法 加入酸或堿調(diào)節(jié)溶液pH值，改變兩性物質(zhì)

29、的電荷性，從而使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)之間的相互作用力下降而易于溶解。2.2.鹽法：鹽法： 高濃度鹽可產(chǎn)生高的滲透壓，破壞細(xì)胞壁的通透性，使細(xì)胞失水，質(zhì)壁分離，造成細(xì)胞自身破裂釋放出內(nèi)容物（化學(xué)滲透學(xué)說）。3.3.酶溶法酶溶法 利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法進(jìn)一步破壞。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，能選擇性釋放產(chǎn)物，胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形完整，便于后步分離。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：酶水解價(jià)格高，只適用于小規(guī)模應(yīng)用。 除上述外，可采用的酶還有其他類型的蛋白酶、脂除上述外，可采用的酶還有其他類型的蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等。肪酶、

30、溶菌酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等。重要微生物細(xì)胞壁的降解酶4.4.表面活性劑處理：表面活性劑處理： 表面活性劑作用于與膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，形成膠束而溶解膜，使細(xì)胞破碎。如SDS5.5.有機(jī)溶劑法：有機(jī)溶劑法： 又稱脂溶法。使用有機(jī)溶劑可使細(xì)胞壁膜溶脹而破碎，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。如甲苯6.6.變性劑法變性劑法 加入變性劑，可削弱氫鍵作用，使胞內(nèi)產(chǎn)物相互之間的作用力減弱而易于釋放。如鹽酸胍。7.7.溫和化學(xué)滲透劑處理溫和化學(xué)滲透劑處理 滲透劑一般采用分子量較小的非極性甘氨酸、丙氨酸，其更易滲透到細(xì)胞壁中，通過氫鍵、范德華力、靜電引力等化學(xué)親和力改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而改變細(xì)胞的通透性。同時(shí)能維持高活性，有廣泛

31、的應(yīng)用前景。（三）物理破碎法（三）物理破碎法1.1.凍融法凍融法 將細(xì)胞凍結(jié)后再融化。破壞細(xì)胞膜的疏水鍵，增加親水性和通透性。同時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶使細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生濃度差，而導(dǎo)致滲透壓產(chǎn)生，并且細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶也會(huì)破壞細(xì)胞壁。2.2.低溫玻璃化法低溫玻璃化法 低溫?cái)嗔咽菑某⒔Y(jié)構(gòu)上損傷細(xì)胞，使細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等成分破壞。避免了高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿對營養(yǎng)活性成分的破壞。（四）各種破碎方法的比較及選擇（四）各種破碎方法的比較及選擇 細(xì)胞破碎方法都有其局限性，單獨(dú)運(yùn)用細(xì)胞破碎方法都有其局限性，單獨(dú)運(yùn)用一種方法往往不能達(dá)到理想的效果，需將一種方法往往不能達(dá)到理想的效果，需將幾種不同的方法結(jié)合使用，以達(dá)到交破碎

32、幾種不同的方法結(jié)合使用，以達(dá)到交破碎率與高產(chǎn)物活性的目的。率與高產(chǎn)物活性的目的。(五五)選擇破碎方法的依據(jù)選擇破碎方法的依據(jù)(1)(1)細(xì)胞的處理量細(xì)胞的處理量(2)(2)細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(3)(3)目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性目標(biāo)產(chǎn)物對破碎條件的敏感性(4) (4) 破碎程度破碎程度 適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低的能耗和便于后步提取這二方面進(jìn)行權(quán)衡的能耗和便于后步提取這二方面進(jìn)行權(quán)衡破碎技術(shù)研究的方向(1)(1)多種破碎法的結(jié)合多種破碎法的結(jié)合(2)(2)與上游技術(shù)結(jié)合與上游技術(shù)結(jié)合(3)(3)與下游操作技術(shù)結(jié)合與下游操作技術(shù)結(jié)合

33、目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放 破碎細(xì)胞的目的是要得到一種或幾種有用的目標(biāo)產(chǎn)物，使其他物質(zhì)盡量少地釋放出來，并且盡量降低細(xì)胞的破碎程度，對后面的操作是很有必要的。 (1) 僅破壞或破碎目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍 (2) 選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物第三節(jié)第三節(jié) 胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解及復(fù)性利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物或多肽，利用微生物大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物或多肽，成為一個(gè)有效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)新途徑，其中成為一個(gè)有效的蛋白質(zhì)生產(chǎn)新途徑，其中以大腸桿菌為宿主最為常用。以大腸桿菌為宿主最為常用。大腸桿菌大腸桿菌中高效表達(dá)的蛋白質(zhì)常在胞內(nèi)聚中高效表達(dá)的蛋白質(zhì)常在胞內(nèi)聚集，形成集，形成不可溶、不可溶、無

34、生物活性的包含體無生物活性的包含體。包含體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得生物包含體必須經(jīng)過變性、復(fù)性才能獲得生物學(xué)功能。學(xué)功能。一、包含體及其形成一、包含體及其形成包含體包含體: :聚集蛋白形成的濃密顆粒，不可溶、無生聚集蛋白形成的濃密顆粒，不可溶、無生物活性物活性, ,在適當(dāng)條件下，其中蛋白可達(dá)細(xì)胞中總蛋白的50%甚至更多。包含體中主要是重組蛋白。 是蛋白的沉積與溶解的不平衡狀態(tài)形成的一種動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)。 包含體蛋白的聚體是個(gè)可逆過程，蛋白質(zhì)水平的表達(dá)、蛋白質(zhì)形成錯(cuò)誤的二硫鍵、重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺乏相應(yīng)的翻譯后加工功缺乏相應(yīng)的翻譯后加工功能，蛋白折疊過程中缺乏酶和輔助因子能，蛋白折疊過程中

35、缺乏酶和輔助因子等是包含體形成的主要原因。二、包含體的分離和溶解二、包含體的分離和溶解包含體蛋白沒有生物活性包含體蛋白沒有生物活性，需要有效的，需要有效的溶溶解、折疊和純化工藝解、折疊和純化工藝恢復(fù)其活性恢復(fù)其活性。細(xì)胞破碎后，分離出來的細(xì)胞破碎后，分離出來的包含體中主要是包含體中主要是重組蛋白重組蛋白，也含有上些細(xì)胞碎片、膜蛋白、，也含有上些細(xì)胞碎片、膜蛋白、脂類、核酸及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離。脂類、核酸及其他雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離。包含體密度較大，用低速離心即可包含體密度較大，用低速離心即可分離純分離純化化。包含體包含體中重組中重組蛋白處于錯(cuò)誤折疊狀態(tài)蛋白處于錯(cuò)誤折疊狀態(tài),主要靠非共主要靠非共價(jià)鍵連接價(jià)鍵連接,唯一的共價(jià)鍵是二硫鍵唯一的共價(jià)鍵是二硫鍵(分子間) ，因，因此要獲得此要獲得正確的折疊正確的折疊首先要破壞二硫鍵首先要破壞二硫鍵(分子間)和非共價(jià)鍵。和非共價(jià)鍵。方式：方式：還原劑還原劑有助于半胱氨酸維持還原態(tài)，可有助于半胱氨酸維持還原態(tài)，可防防止堿性條件下形成二硫鍵而聚集止堿性條件下形成二硫鍵而聚集。螯合劑螯合劑可防止可防止金屬催化的半胱氨酸空氣氧化。金屬催化的半胱氨酸空氣氧化。 三、蛋白質(zhì)復(fù)性三、蛋白質(zhì)復(fù)性變性劑去除或濃度降低后，變性