高效液相色譜

1、. .高效液相色譜百科名片高效液相色譜儀高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography HPLC又稱“高壓液相色譜、“高速液相色譜、“高別離度液相色譜、“近代柱色譜等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被別離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)展檢測，從而實(shí)現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的別離分析技術(shù)。目錄化學(xué)信息根本信息性狀描述物理說明藥理作用危險(xiǎn)說明歷史特點(diǎn)主要類型構(gòu)造組成綜述高壓輸液泵色

2、譜柱進(jìn)樣器檢測器餾分收集器數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)別離原理液固色譜法離子交換色譜法離子對色譜法離子色譜法空間排阻色譜法流程使用方法綜述色譜柱的理論板數(shù)別離度拖尾因子測定方法綜述面積歸一化法主成分自身對照法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法設(shè)備選型綜述相對分子質(zhì)量溶解度化學(xué)構(gòu)造儀器設(shè)備綜述高壓泵梯度洗提進(jìn)樣裝置色譜柱檢測器應(yīng)用實(shí)例化學(xué)信息根本信息性狀描述物理說明藥理作用危險(xiǎn)說明歷史特點(diǎn)主要類型構(gòu)造組成綜述高壓輸液泵色譜柱進(jìn)樣器檢測器餾分收集器數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)別離原理液固色譜法離子交換色譜法離子對色譜法離子色譜法空間排阻色譜法流程使用方法綜述色譜柱的理論板數(shù)別離度拖尾因子測定方法綜述面積歸一化法主成分自身對照法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法

3、設(shè)備選型綜述相對分子質(zhì)量溶解度化學(xué)構(gòu)造儀器設(shè)備綜述高壓泵梯度洗提進(jìn)樣裝置色譜柱檢測器應(yīng)用實(shí)例展開化學(xué)信息根本信息中文名稱：葛根素(HPLC),98% 中文別名：葛根黃酮，8-beta-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羥基異黃酮 英文名稱：Puerarin 英文別名：8-(-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 純度：98%CAS號：3681-99-0 分子式：C21H20O9 分子量：416.38 HPLC1性狀描述高含量為白色針狀結(jié)晶粉末，屬于黃酮類。 物理說明熔點(diǎn)187-189°

4、;C 藥理作用具有提高免疫，增強(qiáng)心肌收縮力，保護(hù)心肌細(xì)胞，降低血壓，抗血小板聚集等作用。 危險(xiǎn)說明危險(xiǎn)品標(biāo)志:F,C 危險(xiǎn)類別碼:11-34 平安說明:22-24/25-45-36/37/39-26-16 歷史1906年俄國植物化學(xué)家茨維特Tswett首次提出“色譜法Chromotography和“ 實(shí)驗(yàn)室最常用的P230高效液相色譜儀色譜圖Chromatogram的概念。他在論文中寫到： “原文一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端參加，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應(yīng)的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖。 1930年以后，相繼出

5、現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù)。 1952年，英國學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們在分配色譜方面的研究工作，提出了關(guān)于氣液分配色譜的比較完整的理論和方法，把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步，這是氣相色譜在此后的十多年間開展十分迅速的原因。 1958年，基于Moore和Stein的工作，離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn)，這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試，但別離效率尚不理想。 1960年中后期，氣相色譜理論和實(shí)踐的開展，以及機(jī)械、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步，液相色譜又開場活潑。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC。 1970年中期以后，微處理機(jī)

6、技術(shù)用于液相色譜，進(jìn)一步提高了儀器的自動化水平和分析精度。 1990年以后，生物工程和生命科學(xué)在國際和國內(nèi)的迅速開展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的別離、純化、制備的課題，如人類基因組方案，蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)別離等。 特點(diǎn)高效液相色譜法有“三高一廣一快的特點(diǎn)： 高效液相色譜HPLC流程示意高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。 高效：別離效能高?？蛇x擇固定相和流動相以到達(dá)最正確別離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的別離效能高出許多倍。 高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在uL數(shù)量級。 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可

7、用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的別離分析，顯示出優(yōu)勢。 分析速度快、載液流速快：較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在1530分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)。 此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間進(jìn)樣器、柱接頭、連接收和檢測池等中，如果流動相的流型有變化，被別離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。 主要類型1吸附

8、色譜Adsorption Chromatography 2分配色譜Partition Chromatography 3離子色譜Ion Chromatography 4體積排阻色譜Size Exclusion Chromatography 5親和色譜Affinity Chromatography 構(gòu)造組成綜述高效液相色譜儀可分為“高壓輸液泵、“色譜柱、“進(jìn)樣器、“檢測器、“餾分收集器以及“數(shù)據(jù)獲取與處理系統(tǒng)等局部。 高壓輸液泵功能 驅(qū)動流動相和樣品通過色譜別離柱和檢測系統(tǒng)； 性能要求 流量穩(wěn)定±1，耐高壓3060Mpa，耐各種流動相：例如：有機(jī)溶劑、水和緩沖液； 種類 往復(fù)泵和隔膜泵。

9、 色譜柱功能 別離樣品中的各個(gè)物質(zhì)； 尺寸 1030cm長，25mm內(nèi)徑的內(nèi)壁拋光的不銹鋼管柱； 填料粒度 5 10m ，高效微粒固定相； 進(jìn)樣器功能 將待分析樣品引入色譜系統(tǒng)； 種類 注射器，10Mpa以下，110m微量注射器進(jìn)樣 停流進(jìn)樣 閥進(jìn)樣，常用、較 理想、體積可變，可固定 自動進(jìn)樣器，有利于重復(fù)操作，實(shí)現(xiàn)自動化 檢測器功能 將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉(zhuǎn)化為光學(xué)或電學(xué)信號； 分類 示差折光化學(xué)檢測器 紫外吸收檢測器紫外一可同分光光度檢測器 二極管陣列紫外檢測器 熒光檢測器 電化學(xué)檢測器餾分收集器功能 如果所進(jìn)展的色譜別離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做其它波譜鑒定，或獲取少量

10、試驗(yàn)樣品的小型制備，餾分收集是必要的； 方法 手工，少數(shù)幾個(gè)餾分，手續(xù)麻煩，易出過失。 餾分收集器收集，比較理想，微機(jī)控制操作準(zhǔn)確。 數(shù)據(jù)獲取和處理系統(tǒng)功能 把檢測器檢測到的信號顯示出來。 別離原理液液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography)流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶極性不同，防止固定液流失，有一個(gè)明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)展分配。到達(dá)平衡時(shí)，服從于高效液相色譜計(jì)算公式： 高效液相色譜計(jì)算公式式中，cs溶

11、質(zhì)在固定相中濃度；cm-溶質(zhì)在流動相中的濃度； Vs固定相的體積；Vm流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即別離的順序取決于K，K大的組分保存值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小于固定液的極性。 b. 反相液 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大于固定液的極性。 c. 液 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；

12、流動相通過色譜柱時(shí)的機(jī)械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末開展的化學(xué)鍵合固定相見后，可抑制上述缺點(diǎn)。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛7080%。 液固色譜法流動相為液體，固定相為吸附劑如硅膠、氧化鋁等。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)展別離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時(shí)，溶質(zhì)分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑外表活性中心發(fā)生競爭吸附未進(jìn)樣時(shí)，所有的吸附劑活性中心吸附的是S，可表示如下：Xm nSa = Xa nSm 式中：Xm-流動相中的溶質(zhì)分子；Sa-固定相中的溶劑分子；Xa-固定相中的溶質(zhì)分子；Sm-流動相中的溶劑分子。 當(dāng)吸附競爭反響達(dá)平衡時(shí)： K=XaSm/XmSa 式中：K為吸附平衡常

13、數(shù)。討論：K越大，保存值越大。 離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱動相中具有一樣電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)展可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們別離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)= (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當(dāng)交換達(dá)平衡時(shí)： KX=-R4N X- Cl-/-R4N Cl- X- 分配系數(shù)為： DX=-R4N X-/X-= KX -R4N Cl-/Cl- 討論：DX與保存值的關(guān)系 但凡在

14、溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)展別離。 離子對色譜法(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保存行為。其原 離子色譜儀流程示意理可用下式表示：X 水相 Y-水相 = X Y-有機(jī)相式中：X 水相-流動相中待別離的有機(jī)離子也可是陽離子；Y-水相-流動相中帶相反電荷的離子對如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等；X Y-形成的離子對化合物。 當(dāng)達(dá)平衡時(shí)： KXY = X Y-有機(jī)相/ X 水相

15、Y-水相 根據(jù)定義，分配系數(shù)為： DX= X Y-有機(jī)相/ X 水相= KXY Y-水相 討論：DX與保存值的關(guān)系 離子對色譜法(特別是反相)發(fā)解決了以往難以別離的混合物的別離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等別離。 離子色譜法(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在別離柱和抑制柱上的反響原理與離子交換色譜法一樣。 以陰離子交換樹脂R-OH作固定相，別離陰離子如Br-為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動相

16、NaOH進(jìn)入色譜柱時(shí)，發(fā)生如下交換反響洗脫反響為交換反響的逆過程： 擔(dān)體圖示抑制柱上發(fā)生的反響： R-H NaOH- = R-Na H2O R-H Na Br- = R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響；試樣陰離子Br-那么被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最正確方法。也可用于陽離子分析。 空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶

17、質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)展別離，而是按分子大小進(jìn)展別離。別離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保存值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。 流程流程流程：如右圖所示，溶劑貯器1中的流動相被泵2吸入，經(jīng)3梯度控制器按一寫的梯度進(jìn)展混后然后輸出，經(jīng)4測其壓力和流量，導(dǎo)入5進(jìn)樣閥器經(jīng)6保護(hù)柱、7別離柱后到8檢測器檢測，由10數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理數(shù)據(jù)或11記錄儀記錄色譜圖，12餾分

18、收集器收集餾分，13為廢液。 使用方法綜述色譜柱的填料和流動相的組分應(yīng)按各品種項(xiàng)下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時(shí),所用流動相應(yīng)符合紫外分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求。 正文中各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn) 化學(xué)鍵合固

19、定相反響樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變 以適應(yīng)具體品種并到達(dá)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。 2.系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)展適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)展試驗(yàn)和調(diào)整,應(yīng)到達(dá)規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、別離度和拖尾因子. 色譜柱的理論板數(shù)在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖 化學(xué)鍵合固定相應(yīng)用，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保存時(shí)間t(R)和半頂峰寬W(h/2)，按n=5.54t(R)W(h/2)2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某

20、些條件如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等，使理論板數(shù)到達(dá)要求。 別離度定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的別離度。別離度R的計(jì)算公式為：2t(R2)-t(R1) ，R= -W1+W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保存時(shí)間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保存時(shí)間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規(guī)定外，別離度應(yīng)大于1.5。 拖尾因子為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為： W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)為0.

21、05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.951.05間。 也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對照品溶液，參加規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計(jì)算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。 測定方法綜述定量測定時(shí)，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)總量時(shí)，須采用峰面積法。 面積歸一化法測定供試品或經(jīng)衍生化處理的供試品中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計(jì)算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計(jì)算在內(nèi)。色譜 硅膠圖的記錄時(shí)間

22、應(yīng)根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保存時(shí)間決定，除另有規(guī)定外可為該品種項(xiàng)下主成分保存時(shí)間的倍數(shù)。 主成分自身對照法當(dāng)雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時(shí)，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進(jìn)樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準(zhǔn)確測量要求。然后取供試品溶液，進(jìn)樣，記錄時(shí)間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分保存時(shí)間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)限度。 內(nèi)標(biāo)法測定供試品中雜質(zhì)的總量限度 采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的

23、供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖I；再配制含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖。記錄的時(shí)間除另有規(guī)定外，應(yīng)為該品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)峰保存時(shí)間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰高應(yīng)為記錄儀滿標(biāo)度的30%以上，否那么應(yīng)調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。 如果色譜圖中沒有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)峰保存時(shí)間一樣的雜質(zhì)峰，那么色譜圖中各雜質(zhì)峰面積之和應(yīng)小于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積溶劑峰不計(jì)在內(nèi)。如果色譜圖中有與色譜圖上內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰保存時(shí)間一樣的雜質(zhì)峰，應(yīng)將色譜圖上的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積減去色譜圖中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應(yīng)小于內(nèi)

24、標(biāo)物質(zhì)峰的校正面積。 加校正因子測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精細(xì)稱量取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精細(xì)量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算校正因子： As/ms校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，Ar為對照品的峰面積或峰高； ms為參加內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的量mr為參加對照品的量。 再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品或其雜質(zhì)峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量：Ax 含量mx=f×-As/ms 式中 Ax為供試品或

25、其雜質(zhì)峰面積或峰高； mx為供試品或其雜質(zhì)的量。 f、As和ms的意義同上。 當(dāng)配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液時(shí)，那么配制內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液不必精細(xì)稱量取。 外標(biāo)法測定供試品中某個(gè)雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項(xiàng)下的規(guī)定,精細(xì)稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精細(xì)取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積或峰高，按下式計(jì)算含量： A<x> 含量mx=mr×-Ar式中各符號意義同上 由于微量注射器不易準(zhǔn)確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時(shí)，以定量環(huán)進(jìn)樣為好。 設(shè)備選型綜述要正確地選擇色

26、譜別離方法，首先必須盡可能多的 了解樣品的有關(guān)性質(zhì)，其 選型常用參照表次必須熟悉各種色譜方法的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用范圍。選擇色譜別離方法的主要根據(jù)是樣品的相對分子質(zhì)量的大小，在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極性和穩(wěn)定程度以及化學(xué)構(gòu)造等物理、化學(xué)性質(zhì)。 相對分子質(zhì)量對于相對分子質(zhì)量較低一般在200以下，揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)展分析。相對分子質(zhì)量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和離子交換色譜法。相對分子質(zhì)量高于2000，那么可用空間排阻色譜法。 溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法；微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離

27、子交換色譜法；油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。 化學(xué)構(gòu)造假設(shè)樣品中包含離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物例如配位體及有機(jī)螯合劑，可首先考慮用離子交換色譜，但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應(yīng)用于離子化合物；異構(gòu)體的別離可用液固色譜法；具有不同官能團(tuán)的化合物、同系物可用液液分配色譜法；對于高分子聚合物，可用空間排阻色譜法。 儀器設(shè)備實(shí)例綜述HPLC的出現(xiàn)不過三十多年的時(shí)間，但這種別離分析技術(shù)的開展十分迅猛，目前應(yīng)用也十分廣泛。其儀器構(gòu)造和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀構(gòu)造和流程可用以下方框圖表示See Fig.3-4。高效液相色譜儀一般都具備

28、貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置用雙泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。 高效液相色譜更適宜于別離、分析高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質(zhì)，因而廣泛應(yīng)用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、外表活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質(zhì)的分析。 高壓泵HPLC使用的色譜柱是很細(xì)的16 mm，所用固定相的粒度也非常小幾m到幾十m，所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費(fèi)時(shí)。為了到達(dá)快速、高效別離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進(jìn)展高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的

29、特點(diǎn)之一。 儀器主要組成HPLC使用的高壓泵應(yīng)滿足以下條件： a. 流量恒定，無脈動，并有較大的調(diào)節(jié)范圍一般為110 mL/min； b. 能抗溶劑腐蝕； c. 有較高的輸液壓力；對一般別離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效別離，要求到達(dá)150300×105Pa。 (1). 往復(fù)式柱塞泵 當(dāng)柱塞推入缸體時(shí)，泵頭出口上部的單向閥翻開，同時(shí)，流動相進(jìn)入的單向閥下部關(guān)閉，這時(shí)就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時(shí)，流動相入口的單向閥翻開，出口的單向閥同時(shí)關(guān)閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點(diǎn)是不受整個(gè)色譜體系中其余局部阻力稍有變化的影響，連續(xù)供給恒定體積的

30、流動相。 2氣動放大泵其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積 SA 活塞 A ，那么在小面積 SB 活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數(shù)取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，那么壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恒壓泵。 梯度洗提類似于GC中的程序升溫。已成為現(xiàn)代高效液相色譜中部缺少的局部。 氣動放大泵梯度洗提，就是載液中含有兩種或更多不同極性的溶劑，在別離過程中按一定的程序連續(xù)改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被別離組分的別離因素，以提

31、高別離效果。梯度洗提可以分為兩種： a. 低壓梯度也叫外梯度：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。 b.高壓梯度 ( 或稱內(nèi)梯度系統(tǒng) ) ：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。 進(jìn)樣裝置(1).注射器進(jìn)樣裝置：進(jìn)樣所用微量注射器及進(jìn)樣方式與 GC法一樣。進(jìn)樣壓力150×105Pa時(shí)，必須采用停流進(jìn)樣。(2).高壓定量進(jìn)樣閥：與GC法用的流通法相似，能在高壓下進(jìn)樣。 色譜柱色譜柱是色譜儀最重要的部件心臟。通常用厚壁玻璃管或內(nèi)壁拋光的不銹鋼管制作的，對于一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時(shí)，可

32、用銅管、鋁管或聚四氟乙烯管。柱子內(nèi)徑一般為16 mm。常用的標(biāo)準(zhǔn)柱型是內(nèi)徑為 4.6 或 3.9mm ，長度為 15 30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度 5 10m ，柱效以理論塔板數(shù)計(jì)大約 7000 10000 。 開展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。 檢測器(1).紫外光度檢測器 它的作用原理是基于被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守比爾定律。最常用的檢測器，應(yīng)用最廣，對大局部有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)： a.靈敏度高：其最小檢測量10-9g·mL-1，故即使對紫外光吸收很弱的物質(zhì)，也可以檢測； b. 線性范圍寬；(比爾定律) c. 流通池可做的很小1mm × 10mm ，容積 8L； d. 對流動相的流速和溫度變化不敏感可用于梯度洗脫； e. 波長可選，易于操作:如，使用裝有流通池的可見紫外分光