免疫磁珠技術(shù)

1、關(guān)于免疫磁珠技術(shù)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁(yè)，共37頁(yè)目錄目錄1 1 免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.2 免疫磁珠技術(shù)2 2 免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用2.1 IMB技術(shù)在食品有害微生物檢測(cè)中的應(yīng)用2.2 免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用2.3 免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用2.4 免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展方向現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁(yè)，共37頁(yè)1. 1.免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介免疫磁珠技術(shù)簡(jiǎn)介1.1 1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁珠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.1.1 1.1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)免疫磁珠的結(jié)構(gòu) 免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB），）， 也稱免疫磁性微球，也稱免疫磁性微球，

2、是一種均勻、是一種均勻、具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上由載體微具有超順磁性及保護(hù)性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層球和免疫配基結(jié)合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料，包裹一層高分子料， 最外層是免疫配基。最外層是免疫配基。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁(yè)，共37頁(yè)載體微球載體微球 載體微球功能基高分子層磁性物質(zhì)金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)，使其表現(xiàn)具有疏水

3、-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同的物理性質(zhì)。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁(yè)，共37頁(yè)免疫配基免疫配基 免疫配基通過生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同， 從而可結(jié)合不同的免疫配基， 如抗原、抗體、凝集素、DNA 和RNA 等。配基必須具有生物專一性的特點(diǎn)， 而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或改變配基原有的生物學(xué)特性， 保證磁珠的特殊識(shí)別功能?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁(yè)，共37頁(yè)1.1.2 1.1.2 免疫磁珠的性質(zhì)免疫磁珠的性質(zhì)由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性，由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性， 從而可使靶從而可使靶物質(zhì)迅

4、速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的新復(fù)物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁珠上，也可使生成的新復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一致合物在磁場(chǎng)中具有相同的磁響應(yīng)性，且行為一致磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異磁珠的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異性結(jié)合性結(jié)合順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)，順磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)， 從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除，從磁場(chǎng)移出時(shí)磁性消除， 磁珠分散，磁珠分散， 由此可方便地進(jìn)行分由此可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向離和磁性導(dǎo)向保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕；保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕； 免疫配基可

5、特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗免疫配基可特異性地結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)。體、核酸等生物活性物質(zhì)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁(yè)，共37頁(yè)1.2 1.2 免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠技術(shù)免疫磁珠免疫磁珠( immunomagnetic bead, IMB)( immunomagnetic bead, IMB)技術(shù)：技術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應(yīng)介質(zhì)中特異性抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場(chǎng)的作用下發(fā)生定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的目的?；驹恚夯驹恚捍判晕⑶蚪?jīng)過一定處理后,可將抗體結(jié)合到磁珠

6、上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗體與特異性抗原結(jié)合形成抗原微球復(fù)合物,該復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性,在磁力作用下,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng),從而達(dá)到分離抗原的目的。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁(yè)，共37頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁(yè)，共37頁(yè)2.1 2.1 食品有害微生物檢測(cè)中的應(yīng)用食品有害微生物檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，它能從樣品中優(yōu)點(diǎn)，它能從樣品中迅速、有選擇性地分離出迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高了精準(zhǔn)性。了精準(zhǔn)性。還能還能捕獲受損傷的靶細(xì)菌捕獲受損

7、傷的靶細(xì)菌，而目前所用的幾種常而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁珠技規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁珠技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品樣品中致病微生物的檢測(cè)。術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品樣品中致病微生物的檢測(cè)。2 .免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁(yè)，共37頁(yè)2.1.1 2.1.1 大腸桿菌大腸桿菌O157O157的檢測(cè)的檢測(cè) 傳統(tǒng)分離E.coli O157 H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coli O157 H7，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。 現(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)

8、被英國(guó)公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國(guó)也已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌O157的檢測(cè)納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.36-2008）和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T 1059.5-2006)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁(yè)，共37頁(yè) 檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質(zhì)225mL 免疫磁珠捕獲涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板挑取可疑菌落5個(gè)10個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSI MUG-LST 陽(yáng)性GB/T 4789.36-2008 GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕獲法檢測(cè)程序免疫磁珠捕獲法檢測(cè)程序 陰性 血清

9、學(xué)試驗(yàn) 非O157細(xì)菌 生化試驗(yàn) 報(bào)告36 1oC18h24h36 1oC36 1oC18h24h18h24h現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁(yè)，共37頁(yè)增菌增菌免疫磁珠捕獲與分離免疫磁珠捕獲與分離 1.1.將將EppendorffEppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用用1 1支支EppendorffEppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩合器上輕輕振蕩E. coli O157E. coli O157免疫磁珠溶液后，用開蓋器免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支打開每支EppendorffEppe

10、ndorff管的蓋子，每管加人管的蓋子，每管加人20 L E. coli 20 L E. coli 01570157免疫磁珠懸液。免疫磁珠懸液。 2.2.取取mEC+nmEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物肉湯增菌培養(yǎng)物1 mL1 mL，加人到，加人到EppendorffEppendorff管管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10 s10 s。每個(gè)樣品更換。每個(gè)樣品更換1 1支加樣支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進(jìn)行，避免交叉污染。 具體操作步驟現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁(yè)，共37頁(yè) 3. 3.結(jié)合結(jié)合: :在在18183030環(huán)境中，將上述環(huán)境中

11、，將上述EppendorffEppendorff管連同管連同磁板架放在磁板架放在Dynal MXlDynal MXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)10 min10 min，使，使E. coli O157E. coli O157與免疫磁珠充分接觸。與免疫磁珠充分接觸。 4. 4.捕獲捕獲: :將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3 min3 min內(nèi)不斷內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時(shí)，在收集起來，此時(shí)，在EppendorffEppendorff管壁中間明顯可

12、見圓形或管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。橢圓形棕色聚集物。 5.5.吸取上清液吸取上清液: :取取1 1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁側(cè)深人液面，輕輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到EppendorffEppendorff管中，并重復(fù)管中，并重復(fù)4步驟。每個(gè)樣品換用步驟。每個(gè)樣品換用1 1支無(wú)菌加支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管。長(zhǎng)吸管?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)

13、的是第十三頁(yè)，共37頁(yè) 6. 6.洗滌洗滌: :洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟洗滌免疫磁珠混合物。重復(fù)上述步驟 4 6 4 6 。 7. 7.重復(fù)上述步驟重復(fù)上述步驟4 5 4 5 。 8. 8.免疫磁珠懸浮免疫磁珠懸浮: :將免疫磁珠重新懸浮在將免疫磁珠重新懸浮在100 L PBS-100 L PBS-Tween 20Tween 20洗液中。洗液中。 9.9.涂布平板涂布平板: :用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取各取50 L50 L免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMACCT-SMAC平板和改平板和改良良CHROMagar O1

14、57CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用無(wú)弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，然后用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于，于3636士士1 01 0培養(yǎng)培養(yǎng)18 h-24 h 18 h-24 h ?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁(yè)，共37頁(yè)菌落識(shí)別菌落識(shí)別 在在CT-SMACCT-SMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無(wú)色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色的無(wú)色菌落，中心呈

15、現(xiàn)較暗的灰褐色; ;發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色; ;在改在改CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無(wú)色或淺灰色。紫色一紫紅色，邊緣無(wú)色或淺灰色。初步生化試驗(yàn)初步生化試驗(yàn): : 在在CT-SMACCT-SMAC和改良和改良CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上挑弧菌顯色瓊脂平板上挑取取5 5個(gè)個(gè)1010個(gè)典型或可疑菌落，分別接種個(gè)典型或可疑菌落，分別接種TSITSI瓊脂，同時(shí)接種瓊脂，同時(shí)接種MUG-MUG-LSTLST肉湯

16、，于肉湯，于3636士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在革蘭氏染色。在TSITSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)(H2S)。置。置MUG-LSTMUG-LST肉湯管肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，無(wú)熒光產(chǎn)生者為陽(yáng)性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，無(wú)熒光產(chǎn)生者為陽(yáng)性結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果果; ;對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純，于對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分純

17、，于3636士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h，并進(jìn)行鑒定。，并進(jìn)行鑒定。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁(yè)，共37頁(yè)大腸桿菌大腸桿菌O157O157的檢測(cè)的檢測(cè)Fratamico等將兔抗E.coli O157 H7多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離O157H7菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的O157H7抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂質(zhì)體（IMB/IL）熒光試驗(yàn)方法，可在8h內(nèi)快速檢測(cè)出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至1cfu/mL的E. coli O157 H7，而

18、傳統(tǒng)微生物學(xué)方法不能從陰性樣本中區(qū)分出E. coli O157 H7感染樣本。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁(yè)，共37頁(yè)2.1.2 2.1.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè) 傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約514d，步驟繁瑣且靈敏度低，而IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度時(shí)也可以通過免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測(cè)限。 2008年，我國(guó)將免疫磁珠檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T 0184.3-2008)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁(yè)，共37頁(yè) 檢樣25g(mL)對(duì)225mLFB1増菌液（30 士1

19、，24h士1h） 1mL轉(zhuǎn)種10mL FB2増菌液（ 35 ，24h士1h）通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar 顯色培養(yǎng)基，OXA/PALCAM瓊脂平板（35 +1 ,24h28h) 各挑選5個(gè)典型菌落接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養(yǎng) 鑒定和確認(rèn)試驗(yàn) 單增李斯特菌的檢測(cè)方法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁(yè)，共37頁(yè) 1 1樣品制備樣品制備 2 2增菌增菌 3 3免疫磁珠分離免疫磁珠分離(IMS(IMS） 1)1)免疫捕獲免疫捕獲混增菌培養(yǎng)液混增菌培養(yǎng)液. .沉淀所有的粗糙食物殘?jiān)恋硭械拇植谑澄餁堅(jiān)? .

20、從增菌培養(yǎng)液從增菌培養(yǎng)液中移取中移取1mL1mL上層液體上層液體( (要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒顆粒) )加人加人EppendorfEppendorf管中管中. .加加20L20L準(zhǔn)備好的免疫磁珠。在旋準(zhǔn)備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液渦混合器上混合該懸液?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁(yè)，共37頁(yè) 2 2）分離）分離將將EppendorfEppendorf管固定在磁架的管孔中。管固定在磁架的管孔中。1801800 0輕緩擺動(dòng)磁架輕緩擺動(dòng)磁架5 5次次-6-6次次, ,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的Eppe

21、ndorfEppendorf管管蓋管管蓋, ,從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體，注意不要從磁極對(duì)面一側(cè)慢慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭; ;加加1mI1mI滅菌的滅菌的PBSPBS，并重新蓋好蓋子，并重新蓋好蓋子. .將磁極從支架上移走，將磁極從支架上移走，1801800 0輕緩擺輕緩擺動(dòng)磁架動(dòng)磁架5 5次一次一6 6次次, ,使管內(nèi)各成分混合使管內(nèi)各成分混合, ,后重新將磁極放回到支后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開架上。重復(fù)該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開. .并加并加100L100

22、L滅菌的滅菌的PBSPBS到管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有到管中，重懸磁珠。如果實(shí)驗(yàn)室沒有磁性分離器磁性分離器. .，可以用手搖代替，可以用手搖代替. . 4.4.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 1 1）分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁(yè)，共37頁(yè) 吸取吸取50L50L免疫磁珠懸液免疫磁珠懸液. .加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基性培養(yǎng)基OXAOXA、PALCAMPALCAM瓊脂平板上瓊脂平板上. .用無(wú)菌接種環(huán)劃用無(wú)菌接種環(huán)劃線線.35.35士士1 1培養(yǎng)培養(yǎng)22h-48h22h-48h。 2 2）篩選）篩選李斯特氏菌在李斯特氏菌在CHROMagarCHROMagar顯色培養(yǎng)基

23、上菌落為藍(lán)色顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色. .且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在且在其周圍形成一個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在OXAOXA瓊脂平板上生瓊脂平板上生長(zhǎng)長(zhǎng)22h22h后菌落呈現(xiàn)黑色后菌落呈現(xiàn)黑色. .直徑為直徑為1mm.1mm.在其周圍形成一個(gè)在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)。培養(yǎng)黑色環(huán)。培養(yǎng)48h48h，菌落仍呈黑色，菌落仍呈黑色. .直徑直徑2mm-3mm.2mm-3mm.除除在菌落周圍有一環(huán)外在菌落周圍有一環(huán)外. .在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特氏菌在。李斯特氏菌在PALCAMPALCAM瓊脂平板上與在瓊脂平板上與在()XA()XA瓊脂平板瓊脂平板上菌落相似。在

24、上菌落相似。在CHROMagarCHROMagar顯色培養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基及OXAOXA或或PALCAMPALCAM瓊脂平板上挑取瓊脂平板上挑取5 5個(gè)或更多可疑菌落個(gè)或更多可疑菌落. .接種于接種于TSA-YETSA-YE瓊脂平板上瓊脂平板上. .純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。 5.5.鑒定和確認(rèn)鑒定和確認(rèn)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁(yè)，共37頁(yè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè) Skjerve等通過包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌株鑒定，此法的敏感性為102104cfu/mL樣品。Hudson等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)

25、與PCR結(jié)合，24h內(nèi)即可檢出火腿中的單增李斯特菌。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁(yè)，共37頁(yè)2.1.3 2.1.3 沙門氏菌的檢測(cè)沙門氏菌的檢測(cè)例1：Notzon等用IMB-熒光PCR檢測(cè)肉類中的沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴(kuò)增，1213h即可完成檢測(cè)過程，IMB-熒光PCR在檢測(cè)自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。例2：Blackburn 等將用生物素標(biāo)記的抗沙門菌多價(jià)多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測(cè)從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)105cfu/g 食物，總的檢測(cè)時(shí)間從5d減少至12d。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁(yè)，共3

26、7頁(yè)IMBIMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)IMB技術(shù)適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測(cè)，能快速有效富集食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原菌，且有良好的靈敏度和特異性，檢測(cè)限可達(dá)到110cfu/25g;在檢測(cè)時(shí)間方面可將常規(guī)檢測(cè)方法中的72小時(shí)檢測(cè)周期縮短至40小時(shí)，而且能有效減輕過程交叉污染;篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測(cè)和鑒定提供了有效的快速篩選技術(shù)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁(yè)，共37頁(yè)2.1.4 2.1.4 金黃色葡萄球菌的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)例1：陳伶俐等將人IgG結(jié)合到磁珠上，用該磁珠對(duì)樣品中的金黃葡

27、萄球菌進(jìn)行了快速分離檢驗(yàn)。取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁場(chǎng)下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對(duì)照。結(jié)果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。對(duì)磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。例2：劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內(nèi)富集檢測(cè)金黃色葡萄球菌且檢測(cè)低限可達(dá)100 CFU，同時(shí)磁珠可保持活性達(dá)3周以上。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁(yè)，共37頁(yè)2.1.5 2.1.5 副溶血性弧菌的檢測(cè)副溶血性弧菌的檢測(cè)Hara-Kudo等利用IMS和顯

28、色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對(duì)極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測(cè)從環(huán)境來源的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌，分別從1份海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象陽(yáng)性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為03:K6?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁(yè)，共37頁(yè)IMBIMB技術(shù)優(yōu)點(diǎn)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比,極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMS可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物, IMS為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問

29、題提供一種有效手段。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁(yè)，共37頁(yè)2.1.6 2.1.6 其他致病菌的檢測(cè)其他致病菌的檢測(cè)志賀氏菌例：Islam等應(yīng)用O抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠，快速檢測(cè)糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯(lián)合法檢測(cè)志賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7 h)。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌例：Kapperud等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開來。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁(yè)，共37頁(yè)2.22.2免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用免疫磁珠與其它

30、檢測(cè)手段的聯(lián)用2.2.1 2.2.1 免疫磁珠與免疫磁珠與PCRPCR的聯(lián)用的聯(lián)用 鑒于鑒于PCR PCR 技術(shù)靈敏度較低這一缺點(diǎn)，將免疫磁珠技術(shù)技術(shù)靈敏度較低這一缺點(diǎn)，將免疫磁珠技術(shù)和和PCR PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立了新的檢測(cè)系統(tǒng)技術(shù)相結(jié)合，建立了新的檢測(cè)系統(tǒng) 磁免疫磁免疫PCRPCR。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對(duì)樣品進(jìn)行前。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將菌進(jìn)行富集裂解，再以處理，將菌進(jìn)行富集裂解，再以iap iap 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行引物進(jìn)行PCRPCR結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，而且結(jié)果顯示該方法具有良好的特異性，而且十分靈

31、敏。十分靈敏。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁(yè)，共37頁(yè)2.2.2 2.2.2 免疫磁珠與免疫磁珠與ELISAELISA的聯(lián)用的聯(lián)用 利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgGIgG抗體致敏，制備抗體致敏，制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記抗體為示蹤抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)親和素建立抗體為示蹤抗體，結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)親和素建立ELISAELISA檢測(cè)系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草檢測(cè)系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結(jié)果蛋白的分析。結(jié)果 用該方法對(duì)甘草藥材和中成藥中甘用該方法對(duì)甘草

32、藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度草蛋白抗原檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度10ng10ngmLmL。免疫磁性捕獲。免疫磁性捕獲ELISAELISA檢測(cè)技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)確，為生藥的品種鑒定及檢測(cè)技術(shù)方便、快速、準(zhǔn)確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁(yè)，共37頁(yè)2.2.3 2.2.3 免疫磁珠與發(fā)光檢測(cè)手段的聯(lián)用免疫磁珠與發(fā)光檢測(cè)手段的聯(lián)用 發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析等。發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學(xué)發(fā)光分析等。 免疫磁珠熒光微球現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十一頁(yè)，共37頁(yè)2.3 IMB2.3 IMB技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

33、技術(shù)在其他領(lǐng)域中的應(yīng)用2.3.12.3.1免疫檢測(cè)免疫檢測(cè) IMB IMB技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測(cè)，它在醫(yī)學(xué)技術(shù)不僅應(yīng)用于食品中有害微生物的檢測(cè)，它在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，它可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，如骨髓領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景，它可以檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，如骨髓中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。另外這種中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。另外這種技術(shù)還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向治療和免疫磁性凈化治療。技術(shù)還可以對(duì)腫瘤進(jìn)行磁導(dǎo)向治療和免疫磁性凈化治療。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁(yè)，共37頁(yè)2.3.2 2.3.2 細(xì)胞分離細(xì)胞分離細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個(gè)方面，傳細(xì)胞分離是免疫磁珠目前應(yīng)用最主要的一個(gè)方面，傳統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時(shí)，有的十分昂貴，由于統(tǒng)細(xì)胞分離技術(shù)有的比較費(fèi)時(shí)，有的十分昂貴，由于免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)只需要抗體和磁鐵，既簡(jiǎn)便免疫磁珠技術(shù)分離細(xì)胞時(shí)只需要抗體和磁鐵，既簡(jiǎn)便靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。靈敏又經(jīng)濟(jì)快捷。分離細(xì)胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液中分離細(xì)胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合液中分離靶細(xì)胞的方法稱為分離靶細(xì)胞的方法稱為陽(yáng)性分離陽(yáng)性分離，用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離陰性分離。馬東初用馬東初用GPG