EphA在大腸腺癌中的表達(dá)

1、EphA2在大腸腺癌中的表達(dá)第一部分大腸腺癌中EphA2表達(dá)及其與臨床病理學(xué)因素、DNA倍體、細(xì)胞周期關(guān)系的研究EphA2基因的介紹基因的介紹 EphA2是Lindberg于1990年用簡(jiǎn)并引物從人角化細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到的一個(gè)Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亞家族成員 。 人EphA2基因定位于1p36.1,有17個(gè)外顯子。 Eph受體家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受體激酶和他們EFN配體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)參與神經(jīng)系統(tǒng)的基本

2、發(fā)生過程、神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳 遞，在細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖，組織和器官的形成、血管生成、細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附及腫瘤的發(fā)生和腫瘤的新生血管的形成等過程中發(fā)揮重要的和必不可少的作用。 EphA2與腫瘤的關(guān)系與腫瘤的關(guān)系 EphA2廣泛高表達(dá)于不同的腫瘤組織和細(xì)胞系，如：乳腺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌，腎細(xì)胞癌等，目前認(rèn)為EphA2參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是功能強(qiáng)大的癌基因。 EphA2的高表達(dá)能誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)化乳腺和前列腺上皮細(xì)胞在體內(nèi)、外的惡性轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移 。 應(yīng)用EphA2蛋白的抗體靶向抑制試驗(yàn)，下調(diào)EphA2蛋白表達(dá)的同時(shí)，也抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而降低腫瘤的惡性程度 。154例大

3、腸腺癌組織和相應(yīng)正常大腸粘膜組織均來自鄭州大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院和河例大腸腺癌組織和相應(yīng)正常大腸粘膜組織均來自鄭州大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院南省腫瘤醫(yī)院2001年年1月月2004年年12月月手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊手術(shù)切除標(biāo)本的存檔蠟塊 (其中其中66例為手術(shù)切例為手術(shù)切除新鮮標(biāo)本和蠟塊和除新鮮標(biāo)本和蠟塊和88例存檔蠟塊例存檔蠟塊) 1份置份置4%多聚甲醛中固定存放多聚甲醛中固定存放另另2份置份置-82中存放中存放石蠟包埋、切片、 HE染色石蠟包埋、切片，進(jìn)行免疫組化提取總mRNA、進(jìn)行RT-PCR實(shí) 驗(yàn) 標(biāo) 本FCM檢側(cè)DNA倍體、細(xì)胞周期細(xì)胞增殖率臨床病理資料臨床病理資料 154例（

4、88例存檔石蠟包埋標(biāo)本和66例手術(shù)切除新鮮大腸腺癌標(biāo)本）大腸腺癌患者，術(shù)前均未接受化療、放療及其他治療。其中男性 78例，女性 76例，年齡在 23-85歲之間，平均年齡為 49.7歲。 66例新鮮手術(shù)切除標(biāo)本均為大腸腺癌：分化程度:高分化腺癌30例，中分化腺癌23 例，低分化腺癌13例。浸潤(rùn)深度:粘膜層10例，粘膜下層0例，肌層14例，漿膜層37例，外周組織5例。轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例；有血道轉(zhuǎn)移者1例，無血道轉(zhuǎn)移者65例；無種植性轉(zhuǎn)移。 88例存檔蠟塊全部為腺癌:分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例；浸潤(rùn)深度：粘膜層62例，粘膜

5、下層1例，肌層17例、漿膜層5例，外周組織3例；轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者74例；有血道轉(zhuǎn)移者11例，無血道轉(zhuǎn)移者77例；有種植性轉(zhuǎn)移者10例，無種植性轉(zhuǎn)移者78例 。技 術(shù) 路 線免疫組化（免疫組化（SP法法)FCMRT-PCR技術(shù)技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)154例大腸腺癌組織例大腸腺癌組織和相應(yīng)正常食管組織中和相應(yīng)正常食管組織中EphA2蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)檢測(cè)檢測(cè)66例大腸腺癌手術(shù)切例大腸腺癌手術(shù)切除新除新鮮鮮組織和相應(yīng)正常大組織和相應(yīng)正常大腸粘膜手術(shù)切除新腸粘膜手術(shù)切除新鮮鮮組織組織中中DNA倍體、細(xì)胞周期、倍體、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖率細(xì)胞增殖率探討探討EphA2表達(dá)與大腸腺癌病理臨床因素

6、、表達(dá)與大腸腺癌病理臨床因素、DNA倍體、細(xì)胞周期的關(guān)系倍體、細(xì)胞周期的關(guān)系檢測(cè)檢測(cè)66例大腸腺癌手術(shù)切例大腸腺癌手術(shù)切除新除新鮮鮮組織和相應(yīng)正常大腸組織和相應(yīng)正常大腸粘膜手術(shù)切除新粘膜手術(shù)切除新鮮鮮組織中組織中EphA2mRNA表達(dá)表達(dá)一. 免疫組化v 步驟 （略） v 對(duì)照組設(shè)計(jì)：以已知EphA2陽性食管鱗癌和正常食管粘膜腺體組織切片作為陽性對(duì)照，用正常兔IgG代替一抗作為陰性對(duì)照，用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。v 免疫組化結(jié)果判定及定量分析：EPhA2免疫組化陽性表達(dá)位于細(xì)胞胞漿，呈棕黃色。定量分析采用高清晰圖像處理系統(tǒng)，隨機(jī)取10個(gè)高倍視野進(jìn)行圖像分析，對(duì)免疫組化切片檢測(cè)EphA2陽性

7、細(xì)胞數(shù)，依據(jù)陽性細(xì)胞所占腫瘤細(xì)胞面積的百分比和染色強(qiáng)度判斷結(jié)果。實(shí) 驗(yàn) 方 法二 .組織中總RNA的提取及RT-PCR v步驟 （略）v RNA濃度的測(cè)定 （略）v對(duì)照設(shè)置 ：（1）陰性對(duì)照：以去離子水代替提取 的總RNA，結(jié)果陰性。v（2）內(nèi)參對(duì)照：用-actin作為內(nèi)參引物，與EphA2和KAI1引物分別同管擴(kuò)增，結(jié)果在紫外燈下出現(xiàn)一條330bp的熒光帶v結(jié)果判定v陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：目的EphA2基因RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳后在紫外燈下分別出現(xiàn)一條586bp的熒光帶。實(shí) 驗(yàn) 方 法取大腸腺癌和正常大腸粘膜組織0.5g剪碎100、300目尼龍網(wǎng)上搓收集細(xì)胞液，800prm/min離心2min7

8、0%乙醇(4)中固定1h LPR染液,避光冷藏(4)5min Stain 1ml避光30min.上機(jī)檢測(cè)FCM實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：FCM對(duì)照組設(shè)計(jì)和診斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組設(shè)計(jì)和診斷標(biāo)準(zhǔn)： 設(shè)正常對(duì)照組：用正常人外周血淋巴細(xì)胞，即二倍體細(xì)胞作為DNA含量 和腫瘤細(xì)胞DNA倍體、細(xì)胞周期的參考標(biāo)準(zhǔn) DNA倍體分析:用Partec流式細(xì)胞儀,計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,具有相同DNA含 量的細(xì)胞群表現(xiàn)為直方圖中獨(dú)立的峰,即每個(gè)峰表示一定DNA含量或倍體 的細(xì)胞亞群。在正常對(duì)照組中,第1個(gè)峰代表單倍體(2C)細(xì)胞亞群,在實(shí)驗(yàn) 組中，第1個(gè)峰代表雙倍體(G0/G1 ,2C)細(xì)胞亞群,第3個(gè)峰則代表四倍體 (G2/M

9、，4C)細(xì)胞亞群，兩峰之間代表S期細(xì)胞亞群。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)算出每 個(gè)峰下的面積所表示的該倍體的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。 診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)左連富的標(biāo)準(zhǔn),DNA倍體單倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組 單倍體細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)相比較,在其兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)為正常,否則為異常。 FCM計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)：計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)： DNA指數(shù)(DI)計(jì)算公式：DI=樣品細(xì)胞G1峰道數(shù)均值正常組織細(xì)胞G1峰道數(shù)均值。 DNA含量分析:以DNA指數(shù)(DI)表示細(xì)胞DNA相對(duì)含量，根據(jù)DI值判斷DNA倍體。0.9DI 1. 1 為DNA二倍體;DI 1. 1 為異倍體。 細(xì)胞周期分布的計(jì)算：運(yùn)用DNA細(xì)胞分析軟件，計(jì)算出各時(shí)相的分布百分比，以S期細(xì)胞比

10、率(SPF)和增殖指數(shù)（PI）表示細(xì)胞的增殖活性。 SPF( %) = S ( G0/ G1 + S + G2M) 100 % PI=(S+G2)（G1+S+G2）100%統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料計(jì)算陽性率，計(jì)量資料用采用XS表示；陽性率之間的比較采用2檢驗(yàn)（chi-square）及Fisher確定概率計(jì)算法；兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較用方差分析（ANVOA）和 Spearman等級(jí)相關(guān)分析；兩變量之間的關(guān)系分析采用相關(guān)分析；多變量之間的關(guān)系分析采用秩和Chi-sguare 檢驗(yàn)；行程列表Chi-sguare檢驗(yàn)。顯著

11、性水準(zhǔn)=0.05。EphA2mRNA及蛋白表達(dá)與大腸腺癌的關(guān)系：免疫組化結(jié)果 免疫組化檢測(cè)結(jié)果：免疫組化檢測(cè)結(jié)果： EphA2蛋白定位于癌細(xì)胞、蛋白定位于癌細(xì)胞、粘膜上皮細(xì)胞及癌組織血粘膜上皮細(xì)胞及癌組織血管內(nèi)皮胞漿內(nèi)，管內(nèi)皮胞漿內(nèi)，呈棕黃色。呈棕黃色。 陰性對(duì)照均無陽性顯示。陰性對(duì)照均無陽性顯示。正常粘膜 116(75.3) 6(3.9) 26（16.9） 6（3.9） 1.3690.663 腺 癌 12（7.8）32（20.8）48（22.7） 62（40.3）4.7890.542 組別 EphA2蛋白表達(dá)（例數(shù)%）a 陽性細(xì)胞面積（XS)b 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí)正常粘膜組織中正常

12、粘膜組織中EphA2蛋白表達(dá)蛋白表達(dá) SP法法 200大腸腺癌組織中大腸腺癌組織中EphA2蛋白表達(dá)蛋白表達(dá) SP法法 200二二.EphA2蛋白表達(dá)在大腸腺癌癌細(xì)胞蛋白表達(dá)在大腸腺癌癌細(xì)胞與癌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的比較與癌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的比較 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 組別 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) 腫瘤細(xì)胞 200(11.2) 930(45.6) 700（35.0） 170（8.2） 血管內(nèi)皮細(xì)胞 170（8.3） 940（46.1） 690（34.5） 200（11.2） 注:2=1562.1481，2 =90.272， P70 30 5 (16.7) 8 (26.8) 9(3

13、0.0) 8(26.8) 0.577 性別b 男 78 7(9.0) 21 (26.8) 26(33.3) 2 4(30.9) 女 76 5 (6.6) 11(14.5) 22 (28.9) 38 (50.0) 0.074a: 2=7.580; b:2=6.928臨床病理 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 學(xué)因素 例數(shù) 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) P腫 瘤部 位c 升結(jié)腸 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 橫結(jié)腸 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降結(jié)腸 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0)

14、乙狀結(jié)腸 23 3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 腸 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 結(jié)腸 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大體類型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 潰瘍型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸潤(rùn)型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0

15、.0228c:2=9.8600; d：2=7.5625三、EphA2蛋白表達(dá)與大腸腺癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系 （B)詳細(xì)部位不清EphA2蛋白表達(dá)與大腸腺癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系(C) 臨床病理 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 學(xué)因素 例數(shù) 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) P腫瘤體積(直徑cm) 9.1 7 2(28.6) 2(28.6) 2(28.6) 1(14.2) 0.5332=10.723EphA2蛋白表達(dá)與大腸腺癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)蛋白表達(dá)與大腸腺癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系系(D) 臨床病理 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 學(xué)因素 例數(shù) 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) P分化程度a

16、高分化 51 3(5.0) 7(13.7) 18(35.3) 23(45.1) 中分化 41 1(2.4) 9 (22.0) 18(43.9) 13(2.4) 低分化 42 7 (16.7) 13(31.0) 10(23.8) 12(28.6) 未分化 20 1(5.0) 3（15.0） 2(10.0) 14(70.0) 0.007a 浸潤(rùn)深度b 粘膜層（T0） 72 6(8.3) 21(29.2) 24(33.3) 21(29.1) 粘膜下層(T1) 1 0(0.0) 1(100) 0(0.0) 0(0.0) 肌層(T2) 31 2(6.5) 6 (19.4) 13(41.7) 10(32.

17、3) 漿膜層(T3) 42 4(9.5) 2(4.8) 7 (16.7) 29(69.0) 外周組織(T4) 8 0(0.0) 2(25.0) 4(50.0) 2(25.0) 0.004bA:2=22.730 ； b:2=29.225 EphA2蛋白表達(dá)與大腸腺癌的關(guān)系蛋白表達(dá)與大腸腺癌的關(guān)系 (E)淋巴道轉(zhuǎn)移c 有 30 4 (13.3) 7(23.3) 12(40.0) 7(23.3) 無 124 8(6.5) 25(20.2) 36(29.0) 55(44.3) 0.1207c血道轉(zhuǎn)移d 有 12 0 (0.0) 1(8.3) 7(58.3) 4(33.3) 無 142 12(8.5)

18、31(21.8) 41(28.9) 58(40.8) 0.1348d種植性轉(zhuǎn)移e 有 0 0 (0.0) 0(0.0) 7(70.0) 3(30.0) 無 144 12(8.3) 32(22.2) 41(28.5) 59(41.0) 0.0783e 臨床病理 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 學(xué)因素 例數(shù) 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) Pc:2=5.8205; d：2=5.565；e:2=6.8070 EphA2在大腸腺癌中的表達(dá) SP法200EphA2免疫染色定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿,強(qiáng)度I級(jí)EphA2在大腸腺癌中的表達(dá) SP法200EphA2免疫染色定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿

19、, 強(qiáng)度II級(jí)EphA2在大腸腺癌中的表達(dá) SP法200EphA2免疫染色定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿,強(qiáng)度III級(jí)EphA2在大腸腺癌組織中的表達(dá) SP法200EphA2蛋白陽性染色定位在腫瘤區(qū)域和血管內(nèi)皮細(xì)胞EphA2基因RT-PCR結(jié)果EphA2基因RT-PCR結(jié)果：- 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，目的條帶為586bp。與EphA2引物同管擴(kuò)增的-actin內(nèi)參引物為 330bp的熒光條帶。以去離子水代替提取的總RNA的陰性對(duì)照無任何熒光條帶顯示。 大腸腺癌癌組織和正常粘膜中EphA2mRNA表達(dá) 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 600bp B -actin 200bp 一一.

20、EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系臨床病理臨床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 學(xué)因素學(xué)因素 例數(shù)例數(shù) + P (XS) P 正常組織 66 21 45 0.70750.3576 癌組織 66 22 44 0.26a 0.85010.4610 0.54k 性別 男 33 13 20 0.36210.2314 女 33 9 24 0.296b 0.20280.2996 0.888l 年齡 30 1 0 1 0.35400.446 30-60 40 19 21 0.79210.2364 60 25 3 22 0.006c 0.36

21、910.4328 0.001mEphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系理學(xué)因素的關(guān)系(B)臨床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 學(xué)因素 例數(shù) + P (XS) P分化程度 高分化 30 6 24 0.51620.6321 中分化 23 11 12 0.74210.3261 低分化 13 5 8 0.089d 0.50260.6741 0.499n浸潤(rùn)深度

22、 粘膜層 5 2 3 0.50260.6459 粘膜下層 5 2 3 0.36540.6598 肌層 14 4 10 0.86210.3654 漿膜層 38 11 27 0.30110.3224 外周組織 5 2 3 0.038e 0.71490.1190 0.000od: 2=4.837; e: 2=10.120; n:F=0.474; o: F=48465; EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系理學(xué)因素的關(guān)系(C)臨床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 學(xué)因素 例數(shù) + P (XS) P轉(zhuǎn)移 淋巴道轉(zhuǎn)移 有 16 6 10 0.34620.

23、1791 無 50 16 34 0.685f 0.38960.1779 0.161p 血道轉(zhuǎn)移 有 1 1 0 0.24960.7961 無 65 21 44 0.154g 0.24170.8192 0.953qf: 2=0.165; g: 2=2.031; p: F=2.119; q: F=0.004; EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系系(D)臨床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin學(xué)因素 例數(shù) + P (XS) P部位 升結(jié)腸 9 4 5 0.19850.751 橫結(jié)腸 2 1 1 0.24170.8192 降結(jié)腸 0 0 0

24、 0.00000.0000 乙狀結(jié)腸 16 6 10 0.24130.7231 直 腸 39 11 28 0.720h 0.19510.7950 0.795r 腫瘤大體類型 隆起型 38 17 21 0.24130.7231 潰瘍型 22 4 18 0.24960.7211 浸潤(rùn)型 3 0 3 0.23150.2339 管周型 3 1 2 0.112i 0.23510.2996 0.366s 腫瘤體積(直徑cm) 5 32 14 18 0.43620.665 5 34 8 26 0.082j 0.44610.674 0.060t h: 2=1.337; i: 2=7.081; j: 2=3.0

25、33; r: F=0.342; s: F=1.076 t:F=9.286 1 2 3 4 5 6 M A Epha2 700bp B -actin 300bp M:標(biāo)準(zhǔn)分子量(100bp DNA ladder);A: EphA2 cDNA，片段大小586bp;B：內(nèi)參照-actin, 片段大小330bp; 1: 陽性對(duì)照：2：: 癌浸潤(rùn)漿膜層;3： 癌浸潤(rùn)肌層;4： 癌浸潤(rùn)粘膜下層;5： 對(duì)應(yīng)的正常粘膜6: 陰性對(duì)照EphA2在大腸腺癌組織中的RT-PCR結(jié)果 二二.大腸腺癌中大腸腺癌中EphA2蛋白表達(dá)與蛋白表達(dá)與EphA2 mRNA表達(dá)的表達(dá)的關(guān)系關(guān)系 大腸腺癌中EphA2蛋白表達(dá)與Eph

26、A2 mRNA表達(dá)的關(guān)系 EphA2 mRNA EphA2 protein + 合計(jì) + 17 23 40 5 21 26 合計(jì) 22 44 66 2=0.25 ，P=0.6171不同級(jí)別不同級(jí)別EphA2蛋白表達(dá)的大腸腺癌中的蛋白表達(dá)的大腸腺癌中的EphA2 mRNA表達(dá)表達(dá) EphA2蛋白表達(dá)分級(jí) 例數(shù) EphA2/-actin (XS) 0 5 0.310.22 I 3 1.120.30 II 5 1.600.25 III 9 1.390.31 注: 0:I:II:III F=17.811 P0.01；0:I t=0.601 P0.05；0:II t=0.601 P0.05；0:III

27、t=0.95 P0.05EphA2與DNA倍體、細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖率關(guān)系FCM檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果一一.大腸腺癌和正常組織中大腸腺癌和正常組織中DNA含量和含量和DNA倍體倍體一一.大腸腺癌和正常組織中大腸腺癌和正常組織中DNA含量和含量和DNA倍體的比較倍體的比較病理臨床因素 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P 正常 組織 66 1.00.1 66 0 癌組織 66 1.670.19 0.005 7 59 0.005 a : F=6.086;b：F=3.697; 二二.大腸腺癌大腸腺癌DNA含量和含量和DNA倍體與病理臨床因素的關(guān)系倍體與病理臨床因素的關(guān)系二二.大腸腺癌大腸

28、腺癌DNA含量和含量和DNA倍體倍體與病理臨床因素的關(guān)系與病理臨床因素的關(guān)系(A)病理臨床因素 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P 年齡 30 1 1.100.17 1 0 30-60 40 1.260.21 5 35 60 25 1.110.15 0.215c 1 24 0.086m分化程度 高分化 30 1.160.21 3 27 中分化 23 1.230.16 2 21 低分化 13 1.320.17 0.489d 2 11 0.455nc: F=1.701;d：F=0.770; m:F=2.644;n: F=0.890 大腸腺癌大腸腺癌DNA含量和含量和DNA倍體

29、與病理臨床因倍體與病理臨床因素的關(guān)系（素的關(guān)系（B)病理臨 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 床因素 P 二倍體 異倍體 P 性別 男 33 1.320.12 4 29 女 33 1.280.11 0.056 3 30 0.056F=6.277;F=3.697大腸腺癌大腸腺癌DNA含量和含量和DNA倍體倍體與病理臨床因素的關(guān)系與病理臨床因素的關(guān)系(C)病理臨床因素 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P浸潤(rùn)深度 粘膜層 5 1.270.23 1 4 粘膜下層 5 1.310.21 0 5 肌層 14 1.300.22 2 12 漿膜層 38 1.490.29 2 36 外周組

30、織 5 1.370.15 0.11e 2 3 0.550o淋巴道轉(zhuǎn)移 有 16 1.310.20 2 16 無 50 1.430.16 0.224f 5 45 0.224p血道轉(zhuǎn)移 有 1 1.430.33 0 1 無 65 1.390.20 0.938g 7 58 0.967qe：F=4.016; f：F=1.684; g：F=0.006; o: F=0.363;p: F=1.684;q: F=0.086 大腸腺癌大腸腺癌DNA含量和含量和DNA倍體倍體與病理臨床因素的關(guān)系（與病理臨床因素的關(guān)系（D)病理臨床因素 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P部位 升結(jié)腸 9 1.

31、480.23 1 8 橫結(jié)腸 2 1.390.31 1 1 降結(jié)腸 0 1.100.20 0 0 乙狀結(jié)腸 16 1.460.26 2 14 直 腸 39 1.430.21 0.765h 3 36 0.909r 腫瘤大體類型 隆起型 38 1.430.21 3 35 潰瘍型 22 1.360.20 2 20 浸潤(rùn)型 3 1.390.31 1 2 管周型 3 1.660.23 0.432i 1 2 0.371s腫瘤體積(直徑cm) 5 32 1.490.31 4 28 5 34 1.660.23 0.086 j 3 31 0.761t h：F=0.274; i：F=0.913; j:F=2.64

32、4; r: F=0.097; s:F=0.816;t:F=0.094 正常大腸粘膜組織的細(xì)胞周期分布 和DNA倍體 大腸腺癌的細(xì)胞周期分布， 出現(xiàn)異倍體峰 三三.大腸腺癌組織中大腸腺癌組織中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表達(dá)表達(dá)與與DNA倍體和倍體和DI的的關(guān)系關(guān)系大腸腺癌組織中大腸腺癌組織中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表達(dá)表達(dá)與與DNA倍體和倍體和DI的關(guān)系的關(guān)系EphA2 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P 蛋白表達(dá) 陽性 40 1.760.26 4 36 陰性 26 1.690.32 0.903a 3 23 0.745c mRNA表達(dá) 陽性 2

33、2 1.790.31 4 18 陰性 44 1.870.39 0.273b 3 41 0.518d a: F=0.016;b: F=1.243;c: F=0.413;d: F=0.426四四.大腸腺癌大腸腺癌DNA倍體與倍體與SPF、PI的關(guān)系的關(guān)系 大腸腺癌大腸腺癌DNA倍體與倍體與SPF、PI的關(guān)系的關(guān)系 DNA倍體 例數(shù) SPF( XS) P PI(XS) P 二倍體 7 11.062.52 20.732.52 異倍體 59 13.142.04 0.042a 23.32.66 0.032b 注：a: 2 =1.2; b: 2 =1.1EphA2蛋白的表達(dá)結(jié)果分析蛋白的表達(dá)結(jié)果分析 一一.

34、 EphA2在正常大腸粘膜上皮中的表達(dá)結(jié)果分在正常大腸粘膜上皮中的表達(dá)結(jié)果分析析 1.EphA2 在正常大腸粘膜上皮低表達(dá)，陽性率僅為24.67%（38/154），且陽性細(xì)胞III級(jí)染色僅占3.9%，陽性細(xì)胞大部分定位于大腸粘膜隱窩上皮基底部的胞漿,少量陽性細(xì)胞亦可見于表面粘膜腺體，提示可能EphA2作用于增殖期上皮細(xì)胞，也可能參與細(xì)胞分化。2.本研究發(fā)現(xiàn)的EphA2在正常大腸粘膜上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)和分布模式提示，EphA2可能參與了正常大腸粘膜上皮的增殖過程。 二二. EphA2在大腸腺在大腸腺癌中癌中的表達(dá)結(jié)果分的表達(dá)結(jié)果分析析 (1) EphA2廣泛高表達(dá)于許多人類腫瘤，無論從腫瘤

35、細(xì)胞還是腫瘤組織的檢測(cè)都高表達(dá)，包括：乳腺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、食管癌、肺癌和宮頸癌。本研究發(fā)現(xiàn)，相比正常大腸粘膜上皮，EphA2在腺癌組織中高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有明顯顯著性(P0.001)，表明EphA2高表達(dá)可能與大腸腺粘膜上皮的癌變相關(guān)。 EphA2高表達(dá)與大腸腺癌的生長(zhǎng)方式、癌的組織學(xué)分級(jí)、癌細(xì)胞浸潤(rùn)深度相關(guān)，表明EphA2的高表達(dá)導(dǎo)致癌細(xì)胞惡性程度和侵襲性增加，使其更易發(fā)生浸潤(rùn)。 EphA2高表達(dá)與淋巴道轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移、種植性轉(zhuǎn)移無關(guān)，表明EphA2的高表達(dá)與大腸腺癌癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能無關(guān)。二. EphA2在大腸腺癌中的表達(dá)結(jié)果分析(2) 三三. EphA2蛋白在大腸腺癌組織中

36、血管內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白在大腸腺癌組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的陽性表達(dá)結(jié)果分析陽性表達(dá)結(jié)果分析 本研究發(fā)現(xiàn)在大腸腺癌組織中，EphA2陽性表達(dá)也見于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過大腸腺癌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞EphA2陽性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)比，兩者呈正相關(guān)，表明EphA2參與腫瘤組織中的血管形成，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展。 EphA2mRNA 的結(jié)果分析的結(jié)果分析一、一、EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素關(guān)系的結(jié)果分析臨床病理學(xué)因素關(guān)系的結(jié)果分析 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)在大腸腺癌組織中，EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌患者的發(fā)病年齡相關(guān)，可能隨著腫瘤患者年齡變化，與體細(xì)胞存在基因突變的積累或

37、基因修復(fù)系統(tǒng)功能低下或DNA甲基化相關(guān)。 EphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌的浸潤(rùn)深度相關(guān)，表明：EphA2調(diào)節(jié)大腸腺癌細(xì)胞的遷移和黏附能力，參與大腸腺癌的演進(jìn)過程。二、二、EphA2mRNA表達(dá)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系表達(dá)與其蛋白表達(dá)的關(guān)系 EphA2蛋白0級(jí)表達(dá)的mRNA水平明顯低于蛋白表達(dá)13級(jí)的mRNA，但二者在蛋白表達(dá)13級(jí)的樣本中mRNA水平并無差異，這與前述的報(bào)道類似，提示在大腸腺癌中EphA2蛋白與其mRNA表達(dá)水平不完全一致。這種結(jié)果的確切機(jī)制還不是很清楚，EphA2mRNA的表達(dá)水平高而蛋白水平低，提示二者在大腸腺癌中并不完全在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，某種轉(zhuǎn)錄后翻譯水平的調(diào)控機(jī)制可能存在。F

38、CM的結(jié)果分析的結(jié)果分析一、大腸腺癌組織中一、大腸腺癌組織中DNA倍體、細(xì)胞周期、倍體、細(xì)胞周期、癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系 (1) 大腸腺癌中異倍體細(xì)胞群占83.39%，明顯高于正常大腸粘膜組織。表明大腸腺癌有較高的惡性程度，但異倍體細(xì)胞群增高與臨床病理因素?zé)o關(guān)，可能是取材標(biāo)本組織成份為腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)正常細(xì)胞混合群體，影響檢測(cè)分析。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明癌組織中異倍體癌及明顯高于二倍體癌組織，而我們66例大腸腺癌標(biāo)本中89.39%出現(xiàn)異倍體癌，表明大腸腺癌癌細(xì)胞增殖分裂能力異常強(qiáng)大，具有無限分裂增殖的特性。一、大腸腺癌組織中一、大腸腺癌組織中DNA倍體、細(xì)胞周

39、期、倍體、細(xì)胞周期、癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系 (2)二、二、EphA2表達(dá)與表達(dá)與DNA倍體、細(xì)胞增殖的倍體、細(xì)胞增殖的關(guān)系關(guān)系 大腸腺癌組織中DNA倍體、DI值、及細(xì)胞殖率明顯增高，表明癌細(xì)胞增值能力強(qiáng)，具有無限分裂增殖的特性。但與EphA2基因的表達(dá)無關(guān)，提示EphA2基因的表達(dá)與細(xì)胞的增值速度無關(guān)。1EphA2蛋白的陽性表達(dá)在大腸腺癌組織中明顯高于正常大腸粘膜組織，且EphA2蛋白的高表達(dá)與癌的大體類型、分化程度及浸潤(rùn)深度相關(guān)，提示EphA2的高表達(dá)可能與大腸腺癌的癌變有關(guān)，并提示癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲力。2EphA2蛋白也定位于大腸腺癌的血管內(nèi)皮細(xì)

40、胞，提示EphA2基因表達(dá)參與了大腸腺癌的微血管生成，有望成為大腸腺癌基因治療的新靶點(diǎn)。 4EphA2表達(dá)與KAI1的表達(dá)無相關(guān)性，提示在大腸腺癌中，EphA2和KAI1可能通過不同的調(diào)節(jié)通路參與大腸腺癌的發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。 5大腸腺癌組織中DNA異倍體、DI值及細(xì)胞增殖率明顯增高，表明癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，但與 EphA2基因的表達(dá)無關(guān)，提示EphA2基因的表達(dá)與細(xì)胞的增殖速度無關(guān)。 謝謝！謝謝！陳壬寅：陳壬寅： 88例存檔蠟塊全部為腺癌:分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌18例，低分化29例和未分化20例；浸潤(rùn)深度：粘膜層62例，粘膜下層1例，肌層17例、漿膜層5例，外周組織3例；轉(zhuǎn)移：有淋

41、巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者74例；有血道轉(zhuǎn)移者11例，無血道轉(zhuǎn)移者77例；有種植性轉(zhuǎn)移者10例，無種植性轉(zhuǎn)移者78例 。FCM對(duì)照組設(shè)計(jì)和診斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組設(shè)計(jì)和診斷標(biāo)準(zhǔn)： 設(shè)正常對(duì)照組：用正常人外周血淋巴細(xì)胞，即二倍體細(xì)胞作為DNA含量 和腫瘤細(xì)胞DNA倍體、細(xì)胞周期的參考標(biāo)準(zhǔn) DNA倍體分析:用Partec流式細(xì)胞儀,計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,具有相同DNA含 量的細(xì)胞群表現(xiàn)為直方圖中獨(dú)立的峰,即每個(gè)峰表示一定DNA含量或倍體 的細(xì)胞亞群。在正常對(duì)照組中,第1個(gè)峰代表單倍體(2C)細(xì)胞亞群,在實(shí)驗(yàn) 組中，第1個(gè)峰代表雙倍體(G0/G1 ,2C)細(xì)胞亞群,第3個(gè)峰則代表四倍體 (G2/M，4

42、C)細(xì)胞亞群，兩峰之間代表S期細(xì)胞亞群。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)算出每 個(gè)峰下的面積所表示的該倍體的細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分比。 診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)左連富的標(biāo)準(zhǔn),DNA倍體單倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組 單倍體細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)相比較,在其兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差之內(nèi)為正常,否則為異常。 臨床病理 EphA2蛋白表達(dá)例數(shù)(%) 學(xué)因素 例數(shù) 0級(jí) I級(jí) II級(jí) III級(jí) P腫 瘤部 位c 升結(jié)腸 14 0 (0.0) 1 (7.1) 2 (14.3) 11 (78.6) 橫結(jié)腸 6 1（16.7） 1(16.7) 3(50.0) 1（16.7） 降結(jié)腸 4 0(0.0) 1(25.0) 2(50.0) 1(25.0) 乙狀結(jié)腸 23

43、3(13.0) 3(13.0) 8(34.8) 9(39.1) 直 腸 86 4(4.7) 24(28.0) 28(32.6) 29(33.7) 結(jié)腸 24 4(16.7) 2(8.3) 5(20.8) 11(45.2) 0.0798大體類型d 隆突型 108 6（5.55） 25（23.14）31（28.7） 46（42.59） 潰瘍型 6 0 （0.00） 3（50.0） 3（50.0） 0（0.00） 浸潤(rùn)型 27 3（11.11） 3（11.11）12（44.44） 9（33.33） 管周型 13 3（23.08） 1（7.70） 5（38.46） 7（53.85） 0.0228c:2

44、=9.8600; d：2=7.5625三、EphA2蛋白表達(dá)與大腸腺癌患者臨床病理學(xué)因素的關(guān)系 （B)詳細(xì)部位不清臨床病理臨床病理 Eph2mRNA EphA2/-actin 學(xué)因素學(xué)因素 例數(shù)例數(shù) + P (XS) P 正常組織 66 21 45 0.70750.3576 癌組織 66 22 44 0.26a 0.85010.4610 0.54k 性別 男 33 13 20 0.36210.2314 女 33 9 24 0.296b 0.20280.2996 0.888l 年齡 30 1 0 1 0.35400.446 30-60 40 19 21 0.79210.2364 60 25 3

45、22 0.006c 0.36910.4328 0.001mEphA2mRNA表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)因素的關(guān)系(A)A：2=0.161; b: 2=1.091; c: 2=10.322k: F=6.277;l: F=0.20 ; m: F=11.405 大腸腺癌大腸腺癌DNA含量和含量和DNA倍體倍體與病理臨床因素的關(guān)系（與病理臨床因素的關(guān)系（D)病理臨床因素 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P部位 升結(jié)腸 9 1.480.23 1 8 橫結(jié)腸 2 1.390.31 1 1 降結(jié)腸 0 1.100.20 0 0 乙狀結(jié)腸 16 1.460.26 2 14 直 腸 39 1

46、.430.21 0.765h 3 36 0.909r 腫瘤大體類型 隆起型 38 1.430.21 3 35 潰瘍型 22 1.360.20 2 20 浸潤(rùn)型 3 1.390.31 1 2 管周型 3 1.660.23 0.432i 1 2 0.371s腫瘤體積(直徑cm) 5 32 1.490.31 4 28 5 34 1.660.23 0.086 j 3 31 0.761t h：F=0.274; i：F=0.913; j:F=2.644; r: F=0.097; s:F=0.816;t:F=0.094三三.大腸腺癌組織中大腸腺癌組織中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表達(dá)表達(dá)與與DN

47、A倍體和倍體和DI的的關(guān)系關(guān)系大腸腺癌組織中大腸腺癌組織中EphA2蛋白和蛋白和EphA2mRNA表達(dá)表達(dá)與與DNA倍體和倍體和DI的關(guān)系的關(guān)系EphA2 例數(shù) DI (XS) DNA倍體 P 二倍體 異倍體 P 蛋白表達(dá) 陽性 40 1.760.26 4 36 陰性 26 1.690.32 0.903a 3 23 0.745c mRNA表達(dá) 陽性 22 1.790.31 4 18 陰性 44 1.870.39 0.273b 3 41 0.518d a: F=0.016;b: F=1.243;c: F=0.413;d: F=0.426 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明癌組織中異倍體癌及明顯高于二倍體癌組織，而我

48、們66例大腸腺癌標(biāo)本中89.39%出現(xiàn)異倍體癌，表明大腸腺癌癌細(xì)胞增殖分裂能力異常強(qiáng)大，具有無限分裂增殖的特性。一、大腸腺癌組織中一、大腸腺癌組織中DNA倍體、細(xì)胞周期、倍體、細(xì)胞周期、癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系癌細(xì)胞增殖率與臨床病理因素的關(guān)系 (2)EphA2基因的介紹基因的介紹 EphA2是Lindberg于1990年用簡(jiǎn)并引物從人角化細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到的一個(gè)Eph（Erythropoitin-produceing hepato-cellular,Eph) 亞家族成員 。 人EphA2基因定位于1p36.1,有17個(gè)外顯子。 Eph受體家族是已知最大的酪氨酸蛋白激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)家族最大的家庭。 Eph家族受體激酶和他們EFN配體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳 導(dǎo)參與神經(jīng)系統(tǒng)的基本發(fā)生過程