無菌檢查法藥檢所文摘

1、無菌檢查法第一講2000版藥典無菌檢查法增修訂內(nèi)容概述無菌檢查法是針對無菌制品的無菌性而建立起來的一套檢查方法，早在19世紀(jì)初就列入了藥品檢查的要求項(xiàng)目，在人們不斷實(shí)踐的過程中，其方法也在不斷地改進(jìn)和提高，檢查的范圍和內(nèi)容也逐步擴(kuò)大。中國藥典2000版就取樣量、培養(yǎng)基質(zhì)量、無菌環(huán)境、無菌操作技術(shù)等方面有大幅度的增訂和修訂，具體概括如下：1擴(kuò)大了檢驗(yàn)范圍：以往的無菌檢查僅適用于藥品及敷料，本次修訂增加了腸線、縫合線及無菌器具，這就使一次性注射器、一次性輸血輸液器等有了切實(shí)可行的檢驗(yàn)方法。2對無菌檢查的操作環(huán)境提出了明確的要求，規(guī)定操作應(yīng)在100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，并且對單向流空氣區(qū)與工作臺面

2、要進(jìn)行驗(yàn)證。3培養(yǎng)基：在提法上將霉菌培養(yǎng)基更名為真菌培養(yǎng)基。因?yàn)槊咕囵B(yǎng)基上常有酵母菌生長，霉菌和酵母菌都不是分類學(xué)上的名詞，而只是一個形態(tài)學(xué)類群，是一種俗稱，被習(xí)慣稱為霉菌和酵母菌的兩大類群微生物屬于真菌門。將霉菌培養(yǎng)基更名為真菌培養(yǎng)基能更確切地反映這一培養(yǎng)基的適用范圍。在制法上提出可按藥典規(guī)定的處方自制，亦可使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。使用脫水培養(yǎng)基（合成培養(yǎng)基）可大大節(jié)省我們的工作量和工作時間，但應(yīng)注意使用應(yīng)嚴(yán)格按說明進(jìn)行，滅菌溫度和時間統(tǒng)一規(guī)定為11530分鐘，同時注意pH值的變化，并逐批對培養(yǎng)基進(jìn)行靈敏度檢查。培養(yǎng)基靈敏度檢查：這是對培養(yǎng)基的質(zhì)量性能進(jìn)行檢驗(yàn)的一個試驗(yàn)。此

3、次修訂增加了制備稀釋菌液的一種方法，即直接稀釋法，新增的第二法直接稀釋法較第一法（比濁法）簡單，人為誤差小。對兩種稀釋法，2000版藥典都規(guī)定了菌液的最終濃度為10100個/ml而放棄了稀釋級的提法，因此培養(yǎng)基接種管數(shù)減少，簡化了工作量，明確了結(jié)果判斷。4對照用菌液:對照用菌液是無菌檢查實(shí)驗(yàn)中''加入陽性對照管的菌液''2000版藥典對此項(xiàng)的改動與靈敏度實(shí)驗(yàn)相一致''也是將菌液的稀釋級10-6改為最終稀釋濃度100個/ml將金黃色葡萄球菌的接種培養(yǎng)基由需厭氣培養(yǎng)菌改為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。5抑細(xì)菌和抑真菌實(shí)驗(yàn)此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)為本次修訂時增設(shè)。在用直接接種法進(jìn)行

4、無菌檢查前，要測定供試品的抑菌性。增設(shè)該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)是適應(yīng)當(dāng)前大量新藥涌入臨床，對這類藥品進(jìn)行無菌檢查時，往往對其是否具有抑菌作用沒有把握，如果其有抑菌性，就會造成我們檢驗(yàn)結(jié)果的假陰性，國外藥典都在無菌檢查中設(shè)有此項(xiàng)內(nèi)容。我國2000版藥典增設(shè)該項(xiàng)內(nèi)容，雖延長了無菌檢查時間，但可以減少方法選擇上的盲目性。因此具有很重要得意義。6檢查法在檢查法的序言中，明確規(guī)定了直接接種法和薄膜過濾法的適用范圍，前者適用于非抗菌作用的供試品，后者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。在進(jìn)行無菌檢查前，提出用適當(dāng)?shù)南疽簩┰嚻啡萜鞅砻婊蛲獍b浸沒或擦拭消毒。2000版藥典把它作為一個實(shí)驗(yàn)步驟提出來，較95版更明確具體。

5、（1）直接接種法：將95版的七大類供試品進(jìn)行了簡并（如23條簡并為一條）；增設(shè)了內(nèi)容（如外科敷料中增設(shè)了腸線、縫合線；又專項(xiàng)增設(shè)了滅菌醫(yī)用器具一條）；調(diào)整了次序（將有抑菌作用和抗生素類藥品從直接接種法中刪除，而其相應(yīng)的內(nèi)容在薄膜過濾法中體現(xiàn)出來）。對青霉素類藥品敘述了兩種方法都可使用，而不是只用酶法；放射性藥品沒有變更。經(jīng)過調(diào)整，最終將供試品歸納為六類，調(diào)整后的款項(xiàng)，內(nèi)容豐富，歸類合理。在直接接種法中，最大的變動是取樣量的增加和培養(yǎng)基管數(shù)的增加，這是本次修訂無菌檢查法的重要改動，并為此專門增設(shè)了表格附后。從理論上講當(dāng)某批產(chǎn)品染菌率一定時''檢出有菌的概率隨樣本數(shù)量的增加而增加&

6、#39;'95版進(jìn)行無菌檢查時''一般取用2個容器''在這種樣本數(shù)下''通過無菌檢查的可能性很大''而這時所下的無菌結(jié)論''其假陰性率比較高''2000版將取樣量增加到11個容器''接種量從全量到5ml不等''對敷料由原兩個包裝增加到4個包裝''原來剪取以面積計(jì)''改為以重量計(jì)或面積計(jì)。培養(yǎng)基接種管數(shù)由原來的共7管調(diào)整到共11管''其中真菌培養(yǎng)管由原來的2管增加到5管''培養(yǎng)時間均設(shè)為7天'

7、;'延長了細(xì)菌原來5天的培養(yǎng)時間''這樣的修訂統(tǒng)一了細(xì)菌和真菌的操作''提高了陽性檢出率。對加入供試品后''培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁這一情況的處理方法''2000版藥典明確規(guī)定經(jīng)7天培養(yǎng)后''可轉(zhuǎn)種或可顯微觀查''而不是兩種方法同時使用。（2）薄膜過濾法:本法將取樣量由2支增加到6支將供試品由抗生素類藥品、抗厭氧菌藥品、抗真菌藥品統(tǒng)一規(guī)定為有抗菌作用的藥品''并統(tǒng)一操作''只是在加入陽性對照菌時根據(jù)供試品的特性加入不同的菌液，在沖洗時''沒有統(tǒng)一規(guī)定沖洗

8、次數(shù)及沖洗劑用量''而以沖洗至陽性對照菌能生長為標(biāo)準(zhǔn)''這就需要依靠經(jīng)驗(yàn)來操作。陽性對照菌生長出來的時間規(guī)定為細(xì)菌2448hr''真菌2472hr。在使用的儀器裝置上''既可使用傳統(tǒng)的裝配式濾器''也可使用封閉式濾器''后者是本次修訂時新出現(xiàn)的儀器''由于推薦使用的JBY-型電腦集菌儀有三組培養(yǎng)基''分別培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和陽性對照''因此相應(yīng)的傳統(tǒng)式濾器操作''取出濾膜后分成三等份''而改變了以往分為四等份。7陰性對照:中

9、國藥典95版的無菌檢查法中規(guī)定取一支需厭氣培養(yǎng)基作為陰性對照即可。這一規(guī)定明顯欠準(zhǔn)確''既不能指示可能存在的細(xì)菌污染''更無法在薄膜過濾法中對濾器、濾膜、溶劑、沖洗劑等起到陰性對照的作用因此2000版對陰性對照做了更為準(zhǔn)確的規(guī)定''即應(yīng)取相應(yīng)溶劑''稀釋劑同時操作陰性對照與樣品的唯一區(qū)別只是它不含供試品。第二講 無菌檢查的慨述一、無菌檢查的定義及范圍:無菌檢查法是指檢查藥品、敷料、縫合線、無菌器具及藥典要求無菌檢查的其它品種是否無菌的一種方法一般來說''凡直接進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)、肌肉、皮下組織、創(chuàng)傷、潰瘍等部位而

10、發(fā)生作用的制品都要進(jìn)行無菌檢查。需要進(jìn)行無菌檢查的藥品、敷料、器具的范圍主要有以下幾類:1各種注射劑:用于肌肉、皮下和靜脈的各種針劑，包括注射用的無菌水、溶媒和溶劑、還有輸液和注射劑原料等。2眼用及外傷用制劑：用于眼科手術(shù)、角膜創(chuàng)傷及一般創(chuàng)傷、潰瘍和燒傷等外科用藥品制劑。許多國家對這類制劑規(guī)定為無菌，我國也基本如此，但中成藥中含有生藥原粉的這類制劑達(dá)不到要求，則以染菌限度要求。3植入劑：即用于包埋于人體內(nèi)的藥物制劑，如不溶于水的激素、避孕藥物、免疫藥物及抗腫瘤藥物等要求無菌的制劑。4可吸收的止血劑：如明膠發(fā)泡劑、凝血酶等用于止血并可被組織吸收的各種藥物制劑。5外科用的敷料、器材等：如外傷用脫脂

11、棉、紗布、結(jié)扎線、縫合線、可被吸收的羊腸線及一次性注射器、一次性無菌手術(shù)刀片、輸血輸液袋、博士倫、心臟瓣膜、以及金屬和有機(jī)器材等。二、無菌檢查的意義：由于微生物形體微小，適應(yīng)能力強(qiáng)，因而它們在自然界廣泛分布，與動植物共生，互惠互利，但也正因?yàn)樗鼈兎植紡V泛，有時也給我們帶來不利影響，就我們醫(yī)藥行業(yè)來說，外科手術(shù)時，如果手術(shù)器械滅菌不徹底，會造成傷口化膿感染；制藥時如果滅菌不徹底，染菌藥品進(jìn)入人體后會引起一系列疾病，臨床上發(fā)生因輸染菌的葡萄糖造成敗血癥死亡的報(bào)道，國內(nèi)外都有，因此人們很早就認(rèn)識了藥品微生物檢驗(yàn)的重要意義，早在本世紀(jì)初就列入了檢驗(yàn)要求項(xiàng)目，現(xiàn)在各國藥典都對無菌檢查范圍、內(nèi)容、方法、抽

12、樣有明文規(guī)定，以保證無菌用藥的安全性。三、無菌檢查的抽樣：（一）抽樣的意義：無菌檢查的抽樣，是指從一批產(chǎn)品中抽取一定數(shù)量單位的樣品，作為檢驗(yàn)樣本的方法，各種要求無菌的藥品在出廠前，應(yīng)通過無菌檢查，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。但由于每批產(chǎn)品的數(shù)量眾多，還由于現(xiàn)有的知識及檢測手段的限制，提供不了非破壞性確認(rèn)批量產(chǎn)品中每一個最終制品的微生物質(zhì)量的方法，因此通常只能從每批產(chǎn)品中隨即抽取一定數(shù)量的單位產(chǎn)品，作為樣本檢驗(yàn)，以此結(jié)果來判斷整批產(chǎn)品的質(zhì)量。從理論上講，無菌產(chǎn)品應(yīng)是沒有微生物污染的產(chǎn)品，但實(shí)際上，被稱為無菌批的產(chǎn)品中，往往不是絕對無菌，而是有可能存在某種程度的污染，建立在概率論基礎(chǔ)上的抽樣方法不管多么完善

13、，均存在風(fēng)險(xiǎn)，而這種風(fēng)險(xiǎn)隨抽樣量的增加而減少，隨著微生物污染程度的降低而增大。假如一個批中有10的產(chǎn)品受到污染，從這個批中取一個成品樣本做無菌檢查，存在兩種可能性，取到無菌樣品或取到染菌樣品，取到無菌樣品的概率（P）為09，取到染菌樣品的概率q為01。則pq0901110如從這個批中取2個成品樣本做無菌檢查''則存在三種可能，2個無菌樣本，2各染菌樣本，1各無菌樣本和1個染菌樣本，以三種可能組合的概率可按下式計(jì)算：（pq）2p22pqq2將p09q01代入即得p2081取得兩個無菌樣本的概率q2001取得兩個染菌樣本的概率2pq018取得1個無菌，1個染菌樣本的概率因此，當(dāng)樣本

14、數(shù)為2時，這個10染菌的批抽不到染菌樣本的概率p2081''抽到染菌樣本的概率q22pq019。在無菌檢查中，一個染菌批，設(shè)樣本數(shù)為n，通過無菌檢查的概率和這個染菌批被檢查出來的概率為：pn（1-q）n通過無菌檢查的概率（合格）1-pn1-（1-q）n檢出批染菌的概率（不合格）q系指批產(chǎn)品的染菌概率，與生產(chǎn)工藝提供無菌保證的能力有關(guān)。例：某產(chǎn)品的染菌率由下降到、，抽樣樣本數(shù)為，根據(jù)無菌檢查判斷批無菌的風(fēng)險(xiǎn)是升高還是降低？當(dāng)時，通過無菌檢查的概率（1-q）n1-03249當(dāng)1時，通過無菌檢查的概率（1-q）n1-01281當(dāng)5時，通過無菌檢查的概率（1-q）n1-0052903結(jié)

15、果，根據(jù)無菌檢查判斷批無菌的風(fēng)險(xiǎn)升高，即誤判為合格的概率由上升到3例2同一個污染水平下，增加無菌檢查的樣本數(shù)，無菌檢查的可信度是升高還是降低，如10污染率，樣本數(shù)為2、5、10。樣本數(shù)通過概率可信度（不合格品檢出率）n2時（1-01）28119n5時（1-01）55941n10時（1-01）103565結(jié)果''可信度提高''即不合格品檢出率提高。表1-1樣本數(shù)、污染率與通過無菌檢查概率的關(guān)系抽樣數(shù)污染率q29998969038172645649597595907759463624162588786028717047×10-21×10-2308

16、670492154207012×10-22×10-3從以上分析看出，無菌檢查是有局限性的，當(dāng)無菌檢查結(jié)果為符合規(guī)定時，其意義是相對的，對于無菌制劑，除加大抽樣以提高無菌檢查的可信度外，最根本的辦法是嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理制度，加強(qiáng)生產(chǎn)環(huán)節(jié)的管理。（二）抽樣的方法與抽樣量：在抽樣時，對產(chǎn)品的分批應(yīng)特別注意。對無菌檢查而言一個批量應(yīng)以同一滅菌器的產(chǎn)品為一批，無菌制劑應(yīng)以無菌灌裝相同的最終容器，在連續(xù)不間斷生產(chǎn)，以不超過24小時的時間周期內(nèi)的產(chǎn)品為一批，在連續(xù)生產(chǎn)過程中產(chǎn)品分別連續(xù)滅菌，如r-射線滅菌應(yīng)以不超過24hr的總產(chǎn)量為一批，不同機(jī)器生產(chǎn)的，以各機(jī)的產(chǎn)品分批，不同班組生產(chǎn)的，

17、應(yīng)按班組分批，這樣分批的意義是使各批號的產(chǎn)品具有均勻性，隨即抽樣時則有代表性。此外尚有其它管理方面的意義。以同一滅菌器中的產(chǎn)品分為一批時，應(yīng)從不同部位抽取單位產(chǎn)品組成樣本。連續(xù)生產(chǎn)過程中，應(yīng)有不同時間抽樣組成樣本。抽樣方法基本上可分為三種類型：1百分?jǐn)?shù)抽樣法：本法抽樣是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)概率的估算，確定隨機(jī)抽樣的數(shù)量，如按WHO于1975年建議的原則，英國藥典1998版的抽樣量（表2-2），按各批單位產(chǎn)品的數(shù)量確定每批的抽樣量，每批的抽樣量為批量5左右，高者不超過20，低者可在2以下。2固定抽樣法：每批樣品皆抽取固定量的代表樣品，而不論每批單位產(chǎn)品量的多少。3綜合抽樣法：很多國家規(guī)定的抽樣法，常用上述

18、兩種綜合形式的方法，即固定抽樣法與百分?jǐn)?shù)抽樣法的綜合抽樣法，固定抽樣法多在每批產(chǎn)品眾多時采用。美國藥典23版的無菌試驗(yàn)抽樣量（表2-3）與前幾版不同，取消了抽樣方法的詳細(xì)規(guī)定和表格，只規(guī)定為每種培養(yǎng)基需用的容器數(shù)，如容器藥液裝量在100ml以下，每種培養(yǎng)基接種自10個容器的規(guī)定藥液，這是固定抽樣法。中國藥典（1995年版）無菌檢查法規(guī)定的抽樣量，采用固定抽樣數(shù)，每批為2支（瓶）以上，但未規(guī)定每批的數(shù)量多少，這一抽樣數(shù)量較其它各國的抽樣量為少，抽樣量少無疑陽性檢出率低，安全性差。2000版藥典無菌檢查的抽樣量有了增加，并對生產(chǎn)廠的出廠產(chǎn)品加大了檢驗(yàn)量，與國際接軌，但藥檢部門監(jiān)督檢查的量仍較少，與

19、國際水平存在一定差距，仍有待提高。表2-2英國藥典（1998版）抽樣量的規(guī)定每批容器數(shù)（個）每種培養(yǎng)基檢查的最小容器數(shù)（）或（個）注射劑100個10最少4100500105002最多30眼用及其它非注射用制劑2005最少220010單劑量容器的制劑按以上注射劑抽取大包裝固體原料4全抽55020最少4502最少10表2-3美國藥典23版抽樣量的規(guī)定容器裝量（ml）每種培養(yǎng)基接種的容器數(shù)量（個）1020105020501002050100（靜脈給藥）101005001050010表2-4中國藥典2000版藥典出廠產(chǎn)品檢驗(yàn)量每批產(chǎn)品數(shù)量/個每種培養(yǎng)基最底檢驗(yàn)量注射劑10010或最少4個1005001

20、0瓶（支）5002或最多30個眼用及其它非注射產(chǎn)品2005或最少2個20010個桶裝固體原料4每個容器55020或最少4個502或最少10個表2-5中國藥典2000版藥典上市抽驗(yàn)樣品檢驗(yàn)量供試品裝量每管接種量/ml直接接種法薄膜過濾法接種取供試品數(shù)瓶培養(yǎng)基量/ml培養(yǎng)基量/ml支1以下或1全量25半量520205050100以下（靜脈）全量100500全量500以上無菌粉針劑無菌粉末原料制劑最大規(guī)格份表2-6中國藥典2000版藥典抗生素類藥上市抽驗(yàn)樣品檢驗(yàn)量供試品裝量薄膜過濾法接種培養(yǎng)基量取供試品數(shù)/支封閉式過濾器/ml薄膜過濾器/ml2ml以下25ml250ml50ml以上無菌粉針劑無菌粉末

21、原料制劑最大規(guī)格量份第三講 培養(yǎng)基及培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)一、無菌檢查用培養(yǎng)基（一）細(xì)菌培養(yǎng)基：中國藥典1995版所規(guī)定的硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，與中國生物制品規(guī)程的規(guī)定一致，與國際上的英、美、日等國的藥典規(guī)定也大致相同。由于細(xì)菌種類繁多，營養(yǎng)要求多樣性，因此，要使單一的培養(yǎng)基適應(yīng)各種細(xì)菌的生長要求是困難的，各國在修訂藥典時，對無菌檢查用培養(yǎng)基也不斷改進(jìn)。現(xiàn)在采用的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，基本上適用于需氣菌與厭氣菌的生長要求，該培養(yǎng)基的特點(diǎn)：提供氮源以及供合成蛋白質(zhì)必須的各種氨基酸和簇維生素；胱氨酸、硫乙醇酸鹽、葡萄糖均有降低氧化還原電位的作用，使深部氧化還原電位適合于厭氧菌的生長，同時硫乙醇酸鹽有鈍化含砷

22、和汞類藥物及防腐劑的有害作用；增添刃天青或美藍(lán)作為氧化還原的指示劑，前者氧化時呈紅色后者氧化時無色；少量瓊脂有助厭氧環(huán)境的形成，防止因液體對流而迅速產(chǎn)生氧化。（二）真菌培養(yǎng)基：中國藥典1995年版規(guī)定的真菌培養(yǎng)基，其處方為改良馬丁培養(yǎng)基與中國藥品生物制品規(guī)程1995版收載的真菌培養(yǎng)基是一致的。關(guān)于真菌用培養(yǎng)基，各國不盡一致。我國和日本國都規(guī)定適用于真菌和酵母菌的培養(yǎng)基，而英、美藥典未明確規(guī)定專用的真菌培養(yǎng)基，僅指出大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基適用于需氣菌和真菌。（三）選擇性培養(yǎng)基：對氨基苯甲酸培養(yǎng)基（用于磺胺類藥物的無菌檢查）吐溫培養(yǎng)基（用于油劑藥品的無菌檢查）照需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基及真菌培

23、養(yǎng)基的處方及制法各加對氨基苯甲酸0125g與吐溫-8010ml''搖勻后分裝滅菌。（四）培養(yǎng)基測試：無菌檢查用培養(yǎng)基無論是市售的脫水培養(yǎng)基或配制的培養(yǎng)基，滅菌后，應(yīng)澄清無沉淀，此外，尚需進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)：靈敏度試驗(yàn)、無菌試驗(yàn)、培養(yǎng)基用前檢查。二、靈敏度試驗(yàn)：（一）菌種各國藥典對無菌檢查用培養(yǎng)基的質(zhì)量，均規(guī)定用已知不同菌株做生長試驗(yàn)來監(jiān)控。根據(jù)加入定量菌的生長結(jié)果評價所用培養(yǎng)基的靈敏度是否符合規(guī)定，合格者方能作無菌檢查用。中國藥典與英、美藥典規(guī)定的菌種（表3-1）需氣菌有藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌；厭氣菌有生孢梭菌；真菌有白色念珠菌和黑曲霉，加菌量皆在1010

24、0個之間。表3-1中、英、美各國藥典培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的對照菌種培養(yǎng)基USP24BP98CP2000需氣菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌藤黃微球菌銅綠假單孢菌銅綠假單孢菌枯草芽孢桿菌厭氣菌生孢梭菌生孢梭菌生孢梭菌真菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉中國藥典規(guī)定的培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)菌種為藤黃微球菌、生孢梭菌、和白色念珠菌。藤黃微球菌是自然環(huán)境中常見的非致病菌，對營養(yǎng)要求較嚴(yán)格，生長較慢，作為需氣菌的代表菌株較金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、具有更多的優(yōu)點(diǎn)。（二）細(xì)菌計(jì)數(shù)方法：（1）細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度比濁法：取藤黃微球菌MicrococcusIuteus28001、白色念珠菌Candidaalbica

25、ns（98001）18小時左右的瓊脂斜面菌苔，刮少許加至無菌生理鹽水或緩沖液管內(nèi)混勻，制成均勻的細(xì)胞懸液，取生孢梭菌不含瓊脂的需氣菌、厭氣菌新鮮培養(yǎng)物，吸至滅菌離心管，離心，棄去上清液，菌體用09無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液，分別取其1ml加在空標(biāo)準(zhǔn)管內(nèi)，與中國細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度比濁管比濁，在細(xì)菌比濁圖片紙上對比觀察各種線條的透黑度，兩者一致時表示濃度相當(dāng)。如待測菌液濃度大（即透黑度低于標(biāo)準(zhǔn)管濁度時），可加無菌生理鹽水調(diào)節(jié)使之最接近，記下所用的生理鹽水總量，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)比濁管所代表的各種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)濃度（請看說明書）的每ml含菌數(shù)計(jì)算，即可得知待測菌液的近似濃度，并將其用無菌鹽水或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋成

26、每ml含菌10億的菌液做為原液備用，臨用前再將原液10倍稀釋至10-7，每ml含菌大約100個（包括死菌在內(nèi)），如欲知其所含活菌數(shù)，須按平板菌落計(jì)數(shù)法，取其1ml菌液加在熔化并冷至45的營養(yǎng)肉湯瓊脂中混勻，傾注平皿，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)菌落即可。按標(biāo)準(zhǔn)管比濁制成的10-7菌液，經(jīng)驗(yàn)表明需氣菌的活菌數(shù)，一般每ml均在50-100個之間。用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌液，于冰箱保存，1周之內(nèi)活菌數(shù)變化較小。（2）原菌培養(yǎng)液直接稀釋法：取藤黃微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物少許，接種在相應(yīng)的10ml液體培養(yǎng)基中，按規(guī)定的最適溫度和時間培養(yǎng)后作為原菌液，然后取原液1ml用09無菌NaCl做10倍稀釋，制成

27、1ml含10100個菌并用平板法計(jì)數(shù)，在相同條件下，經(jīng)多次測定證明后，稀釋液可直接使用，不再測定活菌數(shù)。三）靈敏度檢查將藤黃微球菌上述1或2的稀釋菌液1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基3管，生孢梭菌的上述1或2的稀釋菌液1ml，分別接種至每管裝量為ml的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基3管，白色念珠菌的上述（）或（）稀釋液1ml接種至每管裝量為9ml的真菌培養(yǎng)基3管。以未接種的培養(yǎng)基管作對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)5天并逐日記錄結(jié)果。結(jié)果判定以每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長，即該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合要求。培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)操作示意圖：藤黃微球菌生孢梭菌白色念珠菌取需厭氣培養(yǎng)基的新

28、鮮培養(yǎng)物真菌培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)物1mlml1ml用09滅菌NaCl10倍系列稀釋制成10100個/ml的菌液接種菌液每管1ml空白空白空白需厭氣培養(yǎng)基需厭氣培養(yǎng)基真菌培養(yǎng)基9ml12mlml按規(guī)定的時間培養(yǎng)5天結(jié)果判定：每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長，即該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合要求。三、無菌試驗(yàn)：將配備妥的培養(yǎng)基，按其用途分別置于3035培養(yǎng)48hr''2025培養(yǎng)三天，均應(yīng)無菌生長。如有菌生長需重新制備培養(yǎng)基，否則不能保證無菌檢查結(jié)果的可靠性，BP1998規(guī)定培養(yǎng)14天不得有微生物生長，這一規(guī)定是合理的。四、培養(yǎng)基的用前檢查：需厭氣培養(yǎng)基在臨用前須作檢查，培養(yǎng)基上部約

29、1/101/5處呈現(xiàn)淡紅色時可以使用，若淡紅色部分超過1/高度時，應(yīng)將培養(yǎng)基用水浴煮沸分鐘，冷卻至45以下時再立即接種檢品，但用沸水加熱法去除培養(yǎng)基內(nèi)游離氧時，每批培養(yǎng)基只限加熱一次，否則影響質(zhì)量，全管呈現(xiàn)淡紅色時，不得再用。第四講 陽性對照菌及抑細(xì)菌抑真菌試驗(yàn)一、陽性對照菌液的制備：陽性對照菌液是為供試品做陽性對照試驗(yàn)用，陽性對照試驗(yàn)是檢查供試品對微生物生長有無抑制作用，以此作為評定檢查方法的可行性的重要依據(jù)。因此常根據(jù)供試品的特性是抗需氣菌、厭氣菌或抗真菌選取相應(yīng)的陽性對照菌培養(yǎng)物，制備成菌液。金黃色葡萄球菌：斜面培養(yǎng)物營養(yǎng)肉湯3035培養(yǎng)1618小時生孢梭菌：斜面培養(yǎng)物需厭氣培養(yǎng)基303

30、5培養(yǎng)1624小時白色念珠菌：斜面培養(yǎng)物真菌培養(yǎng)基2025培養(yǎng)24小時分別取1ml菌液用09NaCl10倍系列稀釋至含菌10100個/ml的菌液英國藥典的陽性對照菌與培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)所用的試驗(yàn)菌是相同的，中國藥典規(guī)定的陽性對照菌株：金黃色葡萄球菌StaphylocociusaureusCMCCB26003生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCCB64941白色念珠菌CardidaalbicansCMCCB98001與培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)所用培養(yǎng)基藤黃微球菌MicrococcusluteusCMCCB28001生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCCB64941白

31、色念珠菌CardidaalbicansCMCCB98001除需氣菌菌株不同外，厭氣菌和真菌菌株是相同的，金黃色葡萄球菌Staphylocociusaureus具有對抑菌物質(zhì)較敏感，營養(yǎng)要求不苛刻，生長快的特點(diǎn)，作為抗需氣菌藥物的陽性對照是適宜的。二抑細(xì)菌和抑真菌實(shí)驗(yàn)：在用直接接種法無菌檢查前，須對供試品的抑菌性有所了解。為此，可用如下方法測定供試品是否具有抑細(xì)菌和抑真菌作用。用需厭氣培養(yǎng)基4管及真菌培養(yǎng)基2管，分別接種金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌均10100個菌各兩管，其中1管加規(guī)定量供試品，所有培養(yǎng)基管置規(guī)定的溫度，培養(yǎng)35天，如培養(yǎng)基各管24小時內(nèi)微生物生長良好，則供試品無抑菌作用

32、，如加供試品的管與未加供試品的管對比，微生物生長微弱、緩慢、或不生長，均判為供試品有抑菌作用。該供試品需用稀釋法（種入較大量的培養(yǎng)基中）或中和法、薄膜過濾法處理，消除供試品的抑菌性后，方可接種至培養(yǎng)基。抑細(xì)菌抑真菌試驗(yàn)操作示意圖：金黃色葡萄球菌生孢梭菌白色念珠菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物需厭氣培養(yǎng)基培養(yǎng)物真菌培養(yǎng)基培養(yǎng)物1ml1ml1ml用09滅菌NaCl10系列稀釋制成10100個/ml的菌液接種：接種菌液接種規(guī)定量供試品需厭氣培養(yǎng)基15ml真菌培養(yǎng)基15ml培養(yǎng)：按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天結(jié)果判定：（1）如培養(yǎng)基各管24小時內(nèi)微生物生長良好則供試品無抑菌作用。（2）如加供試品的培養(yǎng)基管與未加供試品的培養(yǎng)基管對照比較，微生物生長微弱、緩慢、或不生長，均判為供試品有抑