第4章基因組測(cè)序與序列組裝3+1陳竺

1、（一）（一）DNADNA的酶法測(cè)序（雙脫氧終止法）的酶法測(cè)序（雙脫氧終止法）1955 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，確定牛胰島素結(jié)構(gòu)， 1958 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1975 1975 設(shè)計(jì)出設(shè)計(jì)出DNADNA測(cè)序法，測(cè)序法， 1980 1980 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Sanger合成一段與待測(cè)合成一段與待測(cè)DNADNA序列互補(bǔ)的序列互補(bǔ)的DNADNA片段群片段群吳瑞（吳瑞（1928-2008）吳瑞在分子生物學(xué)和植物生物學(xué)等領(lǐng)域有重要貢獻(xiàn)。吳瑞在分子生物學(xué)和植物生物學(xué)等領(lǐng)域有重要貢獻(xiàn)。A 克隆于質(zhì)粒中DNA用堿或熱變性B M13克隆單鏈DNAC 噬?？寺NAD PCR產(chǎn)

2、生單鏈DNAA 高酶活性B 無(wú)53外切酶活性C 無(wú)35外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基A 高酶活性： 聚合酶在終止合成前，多聚核苷酸分子可延伸的有效長(zhǎng)度聚合酶在終止合成前，多聚核苷酸分子可延伸的有效長(zhǎng)度B 無(wú)53外切酶活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性C C 無(wú)35外切酶活性 較讀功能較讀功能 KlenowKlenow酶酶 250bp250bp測(cè)序酶測(cè)序酶 sequenasesequenase 蛋白水解酶水解有限產(chǎn)物,68000和35000的片段， 用途：雙鏈DNA 5突出(5overhang)末端的補(bǔ)平(fill-in)；雙鏈DNA

3、 3突出(3overhang)的打平(也稱削平)；5突出末端的標(biāo)記；隨機(jī)引物法進(jìn)行DNA標(biāo)記；Sanger雙脫氧法進(jìn)行DNA測(cè)序；cDNA第二鏈的合成或定點(diǎn)突變反應(yīng)第二鏈的合成。 35外切酶活性外切酶活性校對(duì)作用校對(duì)作用這種酶活性的主要功能是從這種酶活性的主要功能是從35方向識(shí)別和切除方向識(shí)別和切除不配對(duì)的不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸。 53外切酶活性外切酶活性切除修復(fù)作用切除修復(fù)作用從從53方向水解方向水解DNA生長(zhǎng)鏈前方的生長(zhǎng)鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)鏈，主要產(chǎn)生生5-脫氧核苷酸。脫氧核苷酸。A 克隆于質(zhì)粒中DNA小于3kb的可以進(jìn)行，是包裝在噬菌體中的單鏈DNA，容

4、易丟失和重排。用堿或熱變性，可能有未純化的DNA沾染，干擾測(cè)序反應(yīng)，但是最常用方法。B M13克隆單鏈DNA C 噬?？寺NA10kb，質(zhì)粒自身的復(fù)制起點(diǎn)，還有一個(gè)M13或者其他的單鏈DNA噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，大腸桿菌中含有噬粒和輔助噬菌體時(shí)，因攜帶噬菌體復(fù)制酶和外殼蛋白的基因，所以激活噬菌體DNA復(fù)制，產(chǎn)生單鏈?zhǔn)闪Ｊ删w，比M13穩(wěn)定。用標(biāo)記了金屬粒子的引物，磁性裝置純化后使用。D PCR產(chǎn)生單鏈DNA哌啶硫酸二甲酯DNA序列分析儀：序列分析儀：四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的dNTP120臺(tái)毛細(xì)管電泳裝置24小時(shí)連續(xù)作業(yè)，一天工作量是1億億個(gè)堿基長(zhǎng)度的DNA，4天就可測(cè)完水稻基因組1 A TACGTTA

5、2 GTTAGA TC3 ACGTTAGA4 CGTTAGA T5 GTTAGA TCDNA 樣品 TA TGCAA TCTAG與基因芯片上 65,000 種可能的八聚體進(jìn)行雜交從而形成特定的結(jié)合圖形計(jì)算機(jī)分析雜交圖象并由探針的重疊情況推導(dǎo)樣品的核酸序列1 A TACGTTA3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T5 GTTAGA TC3 TACGTTAG4 ACGTTAGA2 CGTTAGA T互補(bǔ)序列為：A TACGTTAGA TC樣品序列為：TA TGCAA TCTAG利用基因芯片進(jìn)行雜交測(cè)序的原理利用基因芯片進(jìn)行雜交測(cè)序的原理可測(cè)可測(cè)DNA片段的長(zhǎng)度是芯片上排列的

6、寡聚核苷酸數(shù)目的平方根。片段的長(zhǎng)度是芯片上排列的寡聚核苷酸數(shù)目的平方根。1、堿基組成特殊，著絲粒附近，高度重復(fù)，缺少酶切位點(diǎn)，難已獲得大分子克隆2、高度重復(fù)序列不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中容易丟失3、某些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌有毒性ABCABCABCABC小片段測(cè)序小片段測(cè)序計(jì)算機(jī)拼裝計(jì)算機(jī)拼裝ABC小片段測(cè)序小片段測(cè)序計(jì)算機(jī)拼裝計(jì)算機(jī)拼裝鳥(niǎo)槍法鳥(niǎo)槍法(Shotgun)測(cè)序的問(wèn)題測(cè)序的問(wèn)題 CAATGCATTAGCAGCCAATGCGAP錯(cuò)裝錯(cuò)裝解決辦法:通過(guò)相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫(kù)解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫(kù) 先將染色體打成比較大的片段先將染色體打成比較大的片段(幾十幾十-

7、幾百幾百Kb), 利用利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig), 分別分別測(cè)序后拼裝測(cè)序后拼裝. 這種策略叫這種策略叫基于克隆群基于克隆群(contig-based)的策的策略略.ABCABC大片段大片段contig小片段測(cè)序拼裝小片段測(cè)序拼裝隨機(jī)測(cè)序與序列組裝方法和指導(dǎo)測(cè)序與序列組裝方法相結(jié)合進(jìn)行序列組裝19號(hào)染色體號(hào)染色體是是含基因最豐富含基因最豐富的染色的染色體，而體，而13號(hào)染色體號(hào)染色體含基因量最少含基因量最少目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個(gè)多個(gè)功能基因，其中尚有功能基因，其中尚有42%的基因尚的基因尚不知道功能不知道功能人類基因組中存在人類基因組中存在“熱點(diǎn)熱點(diǎn)”和大片和大片“荒漠荒漠”。在染色體上有基因成簇密集。在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有分布的區(qū)域，也有大片的區(qū)域只有“無(wú)無(wú)用用DNA” 不包含或含有極少基因的不包含或含有極少基因的成分。成分?；蚪M上大約有基因組上大約有14的區(qū)域沒(méi)有的區(qū)域沒(méi)有基因的片段基因的片