共聚焦激光掃描熒光顯微鏡優(yōu)秀課件

1、1共聚焦激光掃描熒光顯微鏡共聚焦激光掃描熒光顯微鏡 基本原理、應(yīng)用及樣本制備原則基本原理、應(yīng)用及樣本制備原則宋 健武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中心武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中心Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine2 什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？ 共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） 以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚

2、焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的聚焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)熒光顯微鏡系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng) 細(xì)胞細(xì)胞CT 3熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語(yǔ)熒光物質(zhì)：熒光物質(zhì)： 某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)某些物質(zhì)在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線出波長(zhǎng)比照射光長(zhǎng)的光線 熒光。受激發(fā)后能熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光激發(fā)光( (EXCITATION)EXCITATION)： 能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長(zhǎng)范圍

3、內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)激發(fā)/ /吸收光譜吸收光譜；吸吸收波峰收波峰( (最大吸收波長(zhǎng)最大吸收波長(zhǎng)) )488nm 520nm異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光發(fā)射光( (EMISSIONEMISSION):): 發(fā)射光譜；發(fā)射波峰發(fā)射光譜；發(fā)射波峰( (最大發(fā)射波長(zhǎng)最大發(fā)射波長(zhǎng)) )熒光探針：熒光探針： 能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI, Dapi)PI, Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光自發(fā)熒光( (AUTOFLUORESCENCE):AUTOFL

4、UORESCENCE): 組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光自發(fā)熒光。自發(fā)熒光。 伊文斯藍(lán)、硼化氫鈉處理伊文斯藍(lán)、硼化氫鈉處理漂白漂白( (BLEACH)BLEACH)： 熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失 漂白。漂白。4二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原理熒光顯微鏡激發(fā)濾鏡：激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。從光源中分濾出一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。 帶通濾色鏡帶通濾色鏡( (BP)BP)：有寬、窄帶之分。如：有寬、窄帶之分。如：BP450-490BP450-490 長(zhǎng)、短通濾色鏡

5、組合長(zhǎng)、短通濾色鏡組合（LP LP + + KPKP）：）：LP450 + KP490LP450 + KP490 雙色鏡：雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)。雙色分光鏡；反射短波長(zhǎng)，透過(guò)長(zhǎng)波長(zhǎng)。阻斷濾鏡：阻斷濾鏡：多為長(zhǎng)通濾色鏡；多為長(zhǎng)通濾色鏡；LP490LP490紫外紫外藍(lán)藍(lán)綠綠高高壓壓汞汞燈燈被熒光被熒光探針染探針染色的生色的生物樣本物樣本激發(fā)激發(fā)被標(biāo)記被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的熒光光熒光光學(xué)圖像學(xué)圖像光學(xué)光學(xué)成像成像濾鏡濾鏡分光分光488nm 520nmFITC450nm 490nm5共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置Laserand electronicControl Unit激光光源及

6、激光光源及控制裝置控制裝置Computer計(jì)算機(jī)計(jì)算機(jī)Confocal scan and detector unit 共聚焦掃描及檢測(cè)裝置共聚焦掃描及檢測(cè)裝置Microscope熒光顯微鏡熒光顯微鏡Anti-vibration table防震臺(tái)防震臺(tái)Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System6共聚焦裝置共聚焦裝置光源光源針孔針孔檢測(cè)檢測(cè)針孔針孔熒光顯微鏡熒光顯微鏡光電倍增管光電倍增管步進(jìn)聚焦電機(jī)步進(jìn)聚焦電機(jī)物鏡物鏡Bio-Rad LaserSharp 系統(tǒng)操作，圖像處理系統(tǒng)操作，圖像處理3-D重建重建X/Y掃描掃描裝置裝置7光電倍增管光電倍增管檢測(cè)針孔檢測(cè)針孔

7、光源針孔光源針孔光源光源分色鏡分色鏡物鏡物鏡樣本樣本聚集平面聚集平面共聚焦掃描顯微鏡光學(xué)原理共聚焦掃描顯微鏡光學(xué)原理 檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一檢測(cè)針孔和光源針孔始終聚焦于同一點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)點(diǎn)，使聚焦平面以外被激發(fā)的熒光不能進(jìn)入檢測(cè)針孔入檢測(cè)針孔 高分辨率的光學(xué)切片高分辨率的光學(xué)切片 激光穿透性強(qiáng)激光穿透性強(qiáng)，可可對(duì)樣本進(jìn)行一定深對(duì)樣本進(jìn)行一定深度度光學(xué)光學(xué)斷層，獲得高標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)光學(xué)切片斷層，獲得高標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)光學(xué)切片 實(shí)現(xiàn)三維重建實(shí)現(xiàn)三維重建89三維膠原基三維膠原基質(zhì)培養(yǎng)的血質(zhì)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)管平滑肌細(xì)胞胞10共聚焦激光掃描熒光顯微鏡應(yīng)用領(lǐng)域共聚焦激光掃描熒光顯微

8、鏡應(yīng)用領(lǐng)域 只要目的結(jié)構(gòu)是用熒光探針標(biāo)記的，都可只要目的結(jié)構(gòu)是用熒光探針標(biāo)記的，都可用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡觀察。用共聚焦激光掃描熒光顯微鏡觀察。 形態(tài)學(xué)研究：形態(tài)學(xué)研究：細(xì)胞凋亡、中樞神經(jīng)系的細(xì)胞凋亡、中樞神經(jīng)系的F F聯(lián)聯(lián)系、腫瘤細(xì)胞分類系、腫瘤細(xì)胞分類 分子生物學(xué)：分子生物學(xué)：原位雜交，原位雜交，DNADNA、RNARNA定量，定量，DNADNA損傷修復(fù)、損傷修復(fù)、外源性基因在真核細(xì)胞的表達(dá)、外源性基因在真核細(xì)胞的表達(dá)、定位定位，熒光能量共振轉(zhuǎn)移熒光能量共振轉(zhuǎn)移大分子構(gòu)象的改變大分子構(gòu)象的改變、受體與配體相互作用、受體與配體相互作用 活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量：活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)

9、CaCa+、K K+ +、H H+ +等離子的動(dòng)態(tài)分布及動(dòng)態(tài)定量、等離子的動(dòng)態(tài)分布及動(dòng)態(tài)定量、熒光漂白恢復(fù)熒光漂白恢復(fù)細(xì)胞連接間的信息溝通細(xì)胞連接間的信息溝通 直接對(duì)活組織或整體胚胎觀察：直接對(duì)活組織或整體胚胎觀察：?jiǎn)喂庾庸矄喂庾庸簿劢辜す鈷呙柘到y(tǒng)的局限性：熒光漂白聚焦激光掃描系統(tǒng)的局限性：熒光漂白11IntensityBefore bleach After bleach 90 min after bleach1. 熒光漂白恢復(fù)熒光漂白恢復(fù) (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 檢測(cè)細(xì)胞連接間的信息傳遞122. 熒光能量共振轉(zhuǎn)移熒光

10、能量共振轉(zhuǎn)移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer)I. .熒光能量共振轉(zhuǎn)移熒光能量共振轉(zhuǎn)移: : 受激態(tài)熒光素將其能量向另一個(gè)熒光素傳遞，受激態(tài)熒光素將其能量向另一個(gè)熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過(guò)程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫使后者被激發(fā)，這一過(guò)程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光供體熒光素素，能量的接受者叫，能量的接受者叫受體熒光素受體熒光素。供體熒光素供體熒光素 受體熒光素受體熒光素1.1.供體與受體間的距離供體與受體間的距離 10nm或或=1-7nm2.2.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有實(shí)質(zhì)性的重

11、疊有實(shí)質(zhì)性的重疊II. .熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件488nm 520nm 650nm540nm 650nm488nm 520nm供體熒光素供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素受體熒光素 (Cy3)供體熒光素供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素受體熒光素 (Cy3)13FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFPFluorescence Fluorescence IntensityIntensityTime 檢測(cè)檢測(cè) 以供體的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品以供體的激發(fā)波長(zhǎng)的光照射樣品, ,沒(méi)有共沒(méi)有共振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢測(cè)到供體的熒光，發(fā)生共振振轉(zhuǎn)移時(shí)，只檢測(cè)到供體的熒光，發(fā)生共振轉(zhuǎn)

12、移時(shí)，供體的熒光減弱，受體被激發(fā)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，供體的熒光減弱，受體被激發(fā)出現(xiàn)熒光。熒光。應(yīng)用應(yīng)用 受體與配體的相互作用：亞基的結(jié)合受體與配體的相互作用：亞基的結(jié)合 與分離與分離 大分子構(gòu)象的改變大分子構(gòu)象的改變LigandCy3Cy5Cy5III. 常用熒光共振轉(zhuǎn)移探針對(duì)常用熒光共振轉(zhuǎn)移探針對(duì)143. 綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（GFP） GFP的發(fā)現(xiàn)的發(fā)現(xiàn)：60年代，年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白光蛋白 (aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體提取的顆粒都

13、呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋母整體提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白（白即綠色熒光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。）。GFP, CFP, BFP, YFP商品化質(zhì)粒商品化質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物: Green mouse外源基因的報(bào)告基因外源基因的報(bào)告基因: : 將外源基因與將外源基因與GFP DNA 相連相連, , 可實(shí)時(shí)監(jiān)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá)測(cè)外源基因的表達(dá). .檢測(cè)細(xì)胞能否表達(dá)某一基因檢測(cè)細(xì)胞能否表達(dá)某一基因: : 將待測(cè)基因的啟動(dòng)子與將待測(cè)基因的啟動(dòng)子與GFP DNA 相連相連, , 可

14、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞能否表達(dá)興趣基因可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞能否表達(dá)興趣基因. .1.GFP-蛋白融合技術(shù)蛋白融合技術(shù): 將結(jié)構(gòu)蛋白基因與將結(jié)構(gòu)蛋白基因與GFP DNA 相連相連可實(shí)時(shí)監(jiān)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)的表達(dá)亞細(xì)胞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成結(jié)構(gòu)的形成藍(lán)色熒光藍(lán)色熒光 GFP 綠色熒光綠色熒光 Ca2+ 腸腔素腸腔素Aequoren +15原理原理: 檢測(cè)游離檢測(cè)游離Ca2+變化的熒光探針多為變化的熒光探針多為Ca2+螯合劑，通常不能透過(guò)細(xì)螯合劑，通常不能透過(guò)細(xì) 胞膜，只有與胞膜，只有與乙酰甲酯乙酰甲酯(AM)相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 被細(xì)胞內(nèi)被細(xì)胞內(nèi)酯酶酯酶水解后水解后方能與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合

15、后發(fā)出熒光。方能與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。 Kd值：值：為為CaCa2+2+解離常數(shù)，指示檢測(cè)解離常數(shù)，指示檢測(cè)Ca2+濃度的范圍濃度的范圍: : 0.1xKd-10 xkd 和很多因素有關(guān)（和很多因素有關(guān)（pHpH、 Mg Mg2+2+、溫度、與蛋白的結(jié)合、等）溫度、與蛋白的結(jié)合、等） 細(xì)胞內(nèi)生理細(xì)胞內(nèi)生理CaCa2+2+濃度值：濃度值：10-10010-100nMnM 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)CaCa2+2+超載濃度值：基礎(chǔ)超載濃度值：基礎(chǔ)CaCa2+2+濃度的濃度的1010倍左右倍左右 4. 活細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量活細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量細(xì)胞內(nèi)游離細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量測(cè)量 熒光探針熒光探針 激

16、發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng) KdCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMFLuo3-AM, 464nm 526nm 390nMFura red 420/480nm 637nm 140nM16KCL誘導(dǎo)的細(xì)胞外誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca+內(nèi)流測(cè)量?jī)?nèi)流測(cè)量培養(yǎng)培養(yǎng)/ /分離的細(xì)胞分離的細(xì)胞 20 M Fluo 3-AM負(fù)載液負(fù)載液30-60min 清洗、換液清洗、換液 掃描掃描KCLKCL若須快速測(cè)量若須快速測(cè)量1.改變掃描速度改變掃描速

17、度2.采用雙向掃描采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率）犧牲空間分辨率）4.采用線掃描采用線掃描(xt)KCLKCL17雙光子雙光子激光掃描熒光顯微系統(tǒng)激光掃描熒光顯微系統(tǒng) 照射光波長(zhǎng)大于熒光照射光波長(zhǎng)大于熒光染料吸收峰波長(zhǎng)染料吸收峰波長(zhǎng)2倍倍 高能量高能量(2KW)、超短超短脈沖脈沖(兆分之一秒兆分之一秒)聚焦聚焦, 使聚焦點(diǎn)瞬間產(chǎn)生高密使聚焦點(diǎn)瞬間產(chǎn)生高密度光子度光子, 出現(xiàn)雙光子吸收出現(xiàn)雙光子吸收激發(fā)熒光激發(fā)熒光 雙光子吸收僅發(fā)生在雙光子吸收僅發(fā)生在聚焦點(diǎn)聚焦點(diǎn), 避免了焦點(diǎn)外激避免了焦點(diǎn)外激發(fā)而產(chǎn)生的漂白現(xiàn)象發(fā)而產(chǎn)生的漂白現(xiàn)象高能量、超短脈沖聚焦高能量、超短脈沖聚焦

18、、穿透性更強(qiáng)、穿透性更強(qiáng) 50 m 500 m 488nm 520nmFITC976nm18共聚焦激光掃描熒光顯微鏡術(shù)樣本制備的基本原則共聚焦激光掃描熒光顯微鏡術(shù)樣本制備的基本原則400450500550600650700750800EXCITATION and EMISSION SPECTRAEXCITATIONEMISSION Cy2 Cy3 Texas Red Cy5 Cy5.5INTENSITY arb. unitsWAVELENGTH nmFITCRhodamine1.常用熒光素的特性常用熒光素的特性192. 熒光探針的選擇熒光探針的選擇原則：盡量減小不同熒光物質(zhì)間激發(fā)/發(fā)射光譜的重

19、疊。標(biāo)記要求標(biāo)記要求熒光素選擇熒光素選擇/組合組合核復(fù)染核復(fù)染單標(biāo)單標(biāo) 無(wú)特殊限制。 FITC, Cy2最佳；盡量不選擇Cy5, Cy5.5（紅外) 與自發(fā)熒光自發(fā)熒光沖突時(shí)，采用Texas Red 。Propedium Iodide (PI) / DAPI雙標(biāo)雙標(biāo)FITC/Cy2+TEXAS REDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必須順序掃描)DAPI (必須必須順序掃描順序掃描)三標(biāo)三標(biāo)FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必須順序掃描)活細(xì)胞追蹤活細(xì)胞追蹤 能被細(xì)胞主動(dòng)攝取、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用、能在活細(xì)胞內(nèi)