細(xì)胞培養(yǎng)升級篇

1、細(xì)胞培養(yǎng)升級篇細(xì)胞培養(yǎng)中的注意事項1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后，須立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。 2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。 3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？不能。每一細(xì)胞株均有其特

2、定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。 4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。 5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum)

3、 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。 6 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5 %或10% CO2？或根本沒有影響？一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時，則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。7 何時須更換培養(yǎng)基？視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)

4、添加任何抗生素。9 附著性細(xì)胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應(yīng)如何處理？一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于20 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。11 欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心

5、速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？ 欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。 12 細(xì)胞之接種密度為何？ 依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。 13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？ 動物細(xì)胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。14 DMSO之等級

6、和無菌過濾之方式為何？ 冷凍保存使用之DMSO等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4 C，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜。15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一：冷凍管置于4 C 3060分鐘 (-20 C 30分鐘) -80 C 1618小時(或隔夜) 液氮槽vapor phase長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 C 至80

7、 C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 C 不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。16 細(xì)胞欲冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？ 細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好

8、方法。 18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？ 加入相應(yīng)抗生素，直接滅菌后丟棄之。19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株，無法以其外觀分辨之。 20 支原體污染會對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？ 支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實驗前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 21 偵測出細(xì)胞株有支原體污染時， 該如何處理？ 直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌

9、去離子水更換之。23 為何培養(yǎng)基保存于4 C 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于4 C 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH 值。24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？不同廠牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之

10、生長差異。25 購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？ 研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心，應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。26 購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于80 C太久。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋

11、，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？ 培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)最好首選AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？ L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是

12、重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。 30 GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？ GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎

13、完全降解。31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 33 目錄上說，Hanks 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hanks

14、平衡鹽溶液(HBS)和Earles平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。34 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和

15、鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。35 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。37 大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶

16、在4就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的原因及對策：1. 培養(yǎng)液pH值變化太快：CO2張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。NaHCO3緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細(xì)菌、酵母或真菌污染。按培養(yǎng)液中NaHCO3濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度，2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應(yīng)CO2濃度為5到10。（2）改用不依賴CO2培養(yǎng)液。松開瓶蓋1/4圈。加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度。在CO2培養(yǎng)環(huán)境中改用基于Earles鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用Hanks鹽配制的培養(yǎng)液。丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。2. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀

17、，但pH值不變：用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌。將培養(yǎng)液加熱到37，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。 3. 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時pH 發(fā)生變化：細(xì)菌或真菌污染。丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。4. 培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁：胰蛋白酶消化過度；支原體污染；培養(yǎng)液中無貼壁因子?？s短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。 5. 懸浮細(xì)胞成簇：培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放DNA。用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞

18、獲得單細(xì)胞懸液。分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。用DNase I處理細(xì)胞。6. 原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染：原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。7. 培養(yǎng)細(xì)胞死亡：培養(yǎng)箱內(nèi)無CO2。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。培養(yǎng)液滲透壓不正確。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。檢測培養(yǎng)箱內(nèi)CO2檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度取新的保存細(xì)胞種檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為260350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。換入新鮮培養(yǎng)液8. 培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢：由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液中一些細(xì)

19、胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。試劑保存不當(dāng)。比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實驗。增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度。讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。換入新鮮配制培養(yǎng)液。補加谷氨酰胺或生長因子。用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?。血清需保存在-5 到-20。培養(yǎng)液需在28避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在28保存，并在2周內(nèi)用完。接種細(xì)胞起始濃度太低，細(xì)胞已老化，支原體污染。增加接種細(xì)胞起始濃度。換用新的保種細(xì)胞。分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。血清1. 保存血清最好的方法?

20、建議血清應(yīng)保存在-5至-2O。然而，若存放于4時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。2. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分

21、裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。4. 為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。5. 有必要做熱滅活嗎?實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴增。 6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀?GIBICO的胎牛血清沒有預(yù)老化，儲存在28時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在20儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。7.