細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

1、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。 凍存和復(fù)蘇的原則凍存細(xì)胞的理論基礎(chǔ)當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細(xì) 胞 凍 存 方 法預(yù)先配制凍存液： 20%血清培養(yǎng)基 10%DMSO （二甲基亞砜）取對數(shù)生長期細(xì)胞1ml于凍存管中，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制

2、成細(xì)胞懸液（1×1065×106細(xì)胞/ml)，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。慢 凍 程 序標(biāo)準(zhǔn)程序（放哪里？）當(dāng)溫度在-25 以上時，1-2 /min當(dāng)溫度達(dá)-25 以下時，5-10/min當(dāng)溫度達(dá)-100時，可迅速放入液氮中簡易程序 將凍存管于4放置1小時，于-20放置1小時，通過線繩將裝有冷凍管的紗布袋固定于液氮罐罐口（-70），放置1小時，后直接投入液氮中（-196）細(xì) 胞 復(fù) 蘇 方 法從液氮中取出凍存管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分鐘左右） 注意防護(hù)（凍存管爆炸）！5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上低速離心10分鐘去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)

3、胞低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。注意事項： 在使用DMSO前，不要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時最好帶手套。 在將細(xì)胞凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對皮膚造成凍傷。操作過程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。 應(yīng)注

4、意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價值。另外，在每批細(xì)胞凍存一段時間后，要復(fù)蘇12管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。 凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復(fù)蘇時，需要從-196 的液氮中取出凍存管，立即投入37溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險。 污染的類型 細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì)，包括生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞（非同一種的其他細(xì)胞）。微生物污染的途徑空氣：微生物傳播的最主要途徑。器材：清洗消毒不徹底

5、。操作：無菌觀念不強(qiáng)，操作不規(guī)范。血清：支原體或病毒污染。組織樣本：造成原代培養(yǎng)污染。微生物污染對細(xì)胞的影響體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力；培養(yǎng)基中加入的抗生素的抗污染能力有限；培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染，多數(shù)將無法挽救；污染早期或污染程度較輕時，及時處理，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)。污染物持續(xù)存在對細(xì)胞的影響：輕者細(xì)胞生長緩慢，分裂相對減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中出現(xiàn)較多的顆粒狀物質(zhì)；重者細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。微生物污染的檢測 真菌污染 真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌

6、、孢子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。 培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個體細(xì)小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。 細(xì)菌污染 細(xì)菌污染是實驗室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如

7、枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細(xì)胞株(系)丟失。 支原體污染 支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除干凈，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.68.0)下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密

8、集顆?；蚪z狀的中心囊。 培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。 病毒污染 采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。 非同種細(xì)胞污染 由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時各細(xì)胞株所

9、需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實驗宣告無效。 化學(xué)成分的污染 非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。污染的鑒別 1、細(xì)菌、真菌污染的檢測 （1）肉眼觀察 細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。 （2）鏡下觀察 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即

10、為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。 （3）接種觀察 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。 支原體污染的檢測 （1）相差顯微鏡觀察 將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的支持物(一般用長形蓋玻片)，24小時后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別 （2）低滲溶漲處理地衣紅染色觀察 固定染色法，

11、通過對細(xì)胞低滲處理，使細(xì)胞體積擴(kuò)張，細(xì)胞膜表面的褶皺和結(jié)構(gòu)減少，使附在細(xì)胞表面的支原體容易被識別。 取已在培養(yǎng)瓶中的支持物蓋片或培養(yǎng)液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細(xì)胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養(yǎng)液時，先吸取1mL，500800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成23張涂片。然后用2%醋酸地衣紅(地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL)染5分鐘。純酒精過三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹膠中。若染色過深，可先用

12、75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見支原體呈暗紫色小點，位于細(xì)胞外或細(xì)胞之間。 （3）熒光染色法觀察 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50g/mL的Hoechst33258(生理鹽水配制)中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗12分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，

13、離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加35滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈亮綠色小點，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。 （4）電鏡檢測 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)4872小時，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法。（5）培養(yǎng)檢測 將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Si

14、gma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。 污染的清除和預(yù)防污染的清除 培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價值不大，宜棄之；有細(xì)胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞，再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。 1、使用抗生素 抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100g/mL)，污染后清除用藥需

15、采用大于常用量510倍的沖擊處理，于加藥后作用2448小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外，還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400800g/mL卡那霉素或200g/mL四環(huán)素處理，每隔23日換液1次，傳12代進(jìn)行治療。 2、加溫處理 將污染的組織培養(yǎng)物放在41培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗，摸索能最大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響最小的加熱時間。此法有時不可靠。若先用藥物處理后，再以41加溫處理效果更佳。 3、使用支原體特異性血清 用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑

16、制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。 4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等，但均較麻煩，且效果不確定。所以一旦支原體污染，除非有特別重要價值，一般均棄之重新培養(yǎng)。污染的預(yù)防 預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手： 1、從物品、用品消毒滅菌著手 細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的

17、無菌器材要定期清潔消毒滅菌。 2、從操作者做起 （1）操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。 （2）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。 （3）操作時要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢及時收拾，保持實驗室

18、清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。 3、防止細(xì)胞交叉污染在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時易發(fā)生混亂。在進(jìn)行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （一） 1. 注意事項： 1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài)，約為80 90 致密度。 1.2. 冷凍前檢測細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保

19、存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。 1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510 ml 小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用，因長期儲存后對細(xì)胞會有毒性。 1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度： . normal human fibroblast: 13 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybr

20、idoma 會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后死去。 1.4.3. adherent tumor lines: 57 x 106，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。 1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。 1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應(yīng)作一個backup culture，以防止冷凍失敗。 1.6. 冷凍方法： . 傳統(tǒng)方

21、法: 4 10 分鐘-> -20 30 分鐘-> -80 16 - 18 小時(或隔夜) -> 液氮槽vapor phase 長期儲存。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以1 - -3/分鐘之速度由室溫降至120，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。 基礎(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存 （二） 2. 材料： 2.1. 生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 w/v trypan blue (Gi

22、bcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II) 3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-10，混合均勻，置于室溫下待用。 3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。 3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并

23、取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 10 分鐘 -20 30 分鐘 -80 16-18 小時(或隔夜) 液氮槽vapor phase 長期儲存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL 基礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化 1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。 3. 材料 37 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)

24、瓶，液氮或干冰容器。 4. 步驟： 4.1 操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。 4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.4 取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化，以70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。 4.5 取出0.9 ml 解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例1:101:15)，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱

25、培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細(xì)胞懸浮液作存活測試。 4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO 或glycerol)，依細(xì)胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑。惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000 rpm, 5 分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 4.7 若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基?；A(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式 (一)1. 收到細(xì)胞株包裹時，請檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細(xì)胞株請盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于70°C，隔夜后，移到液氮)。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序: 2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒炐枰?，必須有所不同時，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實驗。 2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細(xì)胞而言差異極大，