人類(lèi)K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

1、人類(lèi)K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR熔解曲線法）說(shuō)明書(shū)【產(chǎn)品名稱(chēng)】通用名：人類(lèi)K-ras基因突變檢測(cè)試劑盒（PCR熔解曲線法）英 文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene （PCR-Melting Curve Analysis） 【包裝規(guī)格】20測(cè)試/盒【預(yù)期用途】K-ras基因位于12號(hào)染色體短臂上，是重要的癌基因之一，編碼一種21kD的kras蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，主要包括PI3K/PTEN/AKT和RAF/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這些轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑是當(dāng)前腫瘤靶向藥物研究的熱點(diǎn)，靶向藥物通過(guò)抑制這些途徑發(fā)生藥理作用。K

2、-ras基因第12和13密碼子發(fā)生突變，將導(dǎo)致 kras蛋白變異并處于持續(xù)激活狀態(tài)，使藥物失效。 據(jù)中國(guó)2010版腫瘤學(xué)臨床實(shí)踐指南，在一項(xiàng)包含 101例肺腺癌亞型細(xì)支氣管肺泡癌患 者的回顧性研究中，所有患者均接受厄洛替尼單藥一線治療。K-ras突變者無(wú)一例緩解（0/18）,而無(wú)K-ras突變者則有20例緩解（20/62, 32%）,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P <0.01）。 因此，指南建議，非小細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌患者使用靶向藥物前應(yīng)進(jìn)行K-ras基因突變狀態(tài)的檢測(cè)。本試劑盒以人非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌腫瘤組織切片提取的基因組DNA為檢測(cè)樣本，用于檢測(cè)腫瘤組織 K-ras基因第12, 13密碼

3、子的12種體細(xì)胞突變（表 1）,提供突變狀態(tài) 的定性結(jié)果。為臨床腫瘤靶向藥物的個(gè)體化用藥提供輔助診斷依據(jù)，本品適用于進(jìn)入個(gè)體化靶向治療療程前的患者使用。表1本品可檢測(cè)的K-r心基因突變K-ras基因12密碼子突變K-ras基因13密碼子突變Glvl2SerGGT > AGTGlvlSSerJGGOAGCGlylZA 里GGT > CGTGlyl3ArgGGOCGCGlyl2CysGGT>TGTGlyl3CysGGOTGCGLyl溫平QGT > GATGlyl3AspQC>GCGlyllAlaGGT>GCTGlylSAlaGGOGCCGWllValGGT>

4、;GTTGlylSValGGOGTC【檢驗(yàn)原理】本試劑盒基于實(shí)時(shí) PCR平臺(tái)，結(jié)合了特異引物、熒光探針和熔解曲線技術(shù)，定性檢測(cè) DNA樣品中K-ras基因12, 13密碼子是否存在突變。用一對(duì) K-ras基因特異引物，該引物可擴(kuò)增12種突變型和野生型的 K-ras目標(biāo)序列，利用標(biāo)記了 FAM熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的雙標(biāo) 記探針一方面抑制野生型基因的擴(kuò)增，提高突變基因的檢測(cè)靈敏度，另一方面在擴(kuò)增后用熔解曲線法實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，熒光探針在未雜交時(shí)因熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互接近而被 淬滅，不發(fā)熒光，雜交狀態(tài)時(shí)， 二者相互離開(kāi)而產(chǎn)生熒光。該熒光探針?lè)謩e與突變基因和野 生型基因的雜交產(chǎn)物在熔解曲線分析時(shí)，

5、表現(xiàn)為熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖中出現(xiàn)不同位置的峰，熔解峰對(duì)應(yīng)的位置即為熔解溫度（Tm值），因野生峰的位置較突變峰位置大3c以上而得到區(qū)分，但各種突變峰因 Tm值相差較小而不能辨別。本品可穩(wěn)定地檢出野生型10ng/ul基因組背景下1%含量的體細(xì)胞突變，其熔解曲線會(huì)出現(xiàn)雙峰，其中突變峰較野生峰Tm值明顯降低（圖1）。圖1系列陽(yáng)柱樣本的檢測(cè)結(jié)果注：左黛為突變峰，右峰為野生峰【主要組成成份】本試劑盒包含 PCR反應(yīng)液I、PCR反應(yīng)液H和野生型對(duì)照品等 3管試劑。PCR反應(yīng)液I 包含相應(yīng)的K-ras基因突變檢測(cè)引物和探針， 探針由FAM熒光指示；PC或應(yīng)液n含有dNTP、 Taq酶和MgCl2等。表2成制盒組成試

6、劑組分體枳主要成分PCR反應(yīng)液135印2多115PM的引物和探針PCR反應(yīng)液II100110 lU lTaq 蜂和 30nMdKTP, 750ilMMg2野生型對(duì)照品:印】10噂翼野生型基因組DNA檢測(cè)必須但試劑盒中不包含的組分：1 .5ml離心管（用于配制 PCR反應(yīng)液和DNA提?。?.2ml PCR管或8聯(lián)PCR管或96孔 PCR板；帶濾塞的吸頭（1ml、200 口和106）；DNA提取試劑盒 ReliaPrep? FFPE gDNA Miniprep System （貨號(hào)：A2352） 【貯存條件及有效期】置于-20C條件下儲(chǔ)存，有效期 6個(gè)月。4-10 C避光條件下儲(chǔ)存或運(yùn)輸不得超過(guò)

7、7天。【適用儀器】適用于 ABI7500、Linegene FQD-96A型號(hào)的 Real-time PCR擴(kuò)增儀。 【樣本要求】2 .適用樣本為非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌石蠟包埋病理組織切片，切片厚度10科m ,數(shù)量1片，所用切片樣品保存不超過(guò)3年。3 .由于腫瘤的復(fù)雜性，所采集的臨床樣品往往會(huì)混有正常組織細(xì)胞，石蠟包埋病理切片樣品腫瘤病變細(xì)胞應(yīng)不低于 ,所取部分應(yīng)盡量在蠟塊中部；4 .使用商業(yè)化的試劑盒來(lái)提取人類(lèi)基因組DNA,推薦使用 Promega公司的ReliaPrep? FFPE gDNAMiniprep System （A2352）提取石蠟包埋組織切片樣品，所提 DNA需用紫外分光光度

8、計(jì) 測(cè)定濃度和純度，其 DNA OD260/OD280的值應(yīng)在1.82.0,濃度應(yīng)在 3300ng/6之間，樣 本DNA質(zhì)量不合格者不得用于檢測(cè)，建議重新取切片進(jìn)行核酸提取，提取完的DNA建議立即進(jìn)行檢測(cè)，否則請(qǐng)于-20C以下保存，保存時(shí)間不要超過(guò)6個(gè)月?！緳z驗(yàn)方法】一、核酸提?。颖咎幚硎遥┦褂肦eliaPrep? FFPE gDNA Miniprep System進(jìn)行核酸提取，提取步驟如下。1 .用礦物油去除石蠟加礦物油500d倒裝有組織切片樣本的1.5ml離心管內(nèi)，80c孵育1min,振蕩混勻；2 .組織樣本裂解，消化組織蛋白質(zhì)1）離心管內(nèi)加入200科裂解液，室溫10,000g離心15s

9、,形成水油兩相溶液，下層為水相， 上層為油相；2）向離心管水相加入 20 d蛋白酶K,用移液槍吸打混勻；3）56C孵育1h； 4） 80c孵育1h； 5）冷卻到室溫，離心 15s； 3.去除RNA向離心管水相加入 10。RNase A吸打混勻。室溫（20-25 C）孵育5min ； 4.用核酸提取柱提取基因組 DNA1）加入220。BL Bufer到含裂解樣品的離心管中，再加入 240口乙醇 （95-100%）,震蕩混勻，室溫10,000g離心15s,形成水油兩相溶液，下層為水相，上層為油相；2）將結(jié)合柱置于收集管內(nèi)， 小心吸取離心管下層水相 （包括可能形成的沉淀）轉(zhuǎn)移到結(jié)合柱內(nèi)，蓋上管蓋，將

10、離心管丟棄。3）收集管室溫10,000g離心30s,棄去管中的濾出液。4）把柱子重新裝入收集管中，加入 500 6 1洗滌液至柱內(nèi)，室溫10,000g離心30 s,棄去濾出的洗滌液。5）重復(fù)步驟4）再洗滌一次；6）打開(kāi)結(jié)合柱蓋子，室溫條件下7）把柱子轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的自備16,000 g 離心 1 min洗脫基因組DNA,丟棄提取柱。16,000g離心3 min以甩干柱內(nèi)殘余的液體；注意事項(xiàng):1.5ml離心管中，向柱內(nèi)加入 506 Elution Buffer ,室溫1 .操作提取柱和收集管時(shí)應(yīng)戴好一次性手套；2 .收集基因組DNA前的16,000g離心3 min操作必須開(kāi)蓋，以除凈乙醇，乙醇?xì)?/p>

11、留過(guò)量將嚴(yán) 重影響基因組的收集質(zhì)量。二、試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備室）將試劑從冰箱取出，室溫融化，混勻， 1000rpm快速離心20秒，備用；三、反應(yīng)體系配制（試劑準(zhǔn)備室）1 .根據(jù)檢測(cè)樣本數(shù)計(jì)算所需反應(yīng)數(shù)，如樣本數(shù)為n,則需做n+2個(gè)反應(yīng)（包含一個(gè)陰性對(duì)照反應(yīng)和一個(gè)無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)）；2 .根據(jù)表3計(jì)算所需各反應(yīng)液的體積，并配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系混勻后3000rpm快速離心30秒，分裝至PCR管中，每管186；表3加樣表1反應(yīng)(pl)N個(gè)反應(yīng)（可）PCR反應(yīng)液I1414XNPCR反應(yīng)液II44XN總體積1818XN四、加樣（樣本處理室）取2 d l提取的樣品DNA加入PCR反應(yīng)管，蓋上管蓋，1000r

12、pm離心或輕甩，排除管 底氣泡；陰性對(duì)照反應(yīng)所用模板為試劑盒中野生型對(duì)照品，空白對(duì)照反應(yīng)所用模板為超純水（自備）。五、上機(jī)檢測(cè)（擴(kuò)增室）1 .將PCR管按順序放入PCR儀，設(shè)置反應(yīng)程序（1） LineGene FQD-96A熒光定量 PCR儀程序設(shè)置r uoSSft!獷增) 熔解幅(XI) 1CX5il)fxi)圖2 LiieGene FQD-96A PCX儀反應(yīng)會(huì)敦設(shè)置圖在52c時(shí)收集熒光，熒光檢測(cè)通道選擇FAM檢測(cè)通道，獲得擴(kuò)增曲線及 Ct值，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。Melt分析時(shí)，目標(biāo)溫度 65 C,起始溫度39C,臺(tái)階溫度1C,臺(tái)階溫度維持 30s,熒光 采集方式為“臺(tái)階”。熒光檢測(cè)通道選擇

13、FAM檢測(cè)通道。(2) ABI7500熒光定量 PCR儀圖3 ABI7500 PCR儀反應(yīng)參數(shù)設(shè)置圖Melt分析時(shí)，選才i StepAndHold模式，溫度3965C,每個(gè)步驟升高0.3C,在每個(gè)溫度 都收集熒光。熒光檢測(cè)通道選擇FAM檢測(cè)通道。2. 運(yùn)行PCR反應(yīng)程序，保存文件。六、結(jié)果獲取熒光定量PCR儀運(yùn)行結(jié)束后，使用配套軟件對(duì)本次試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖（-dF/dT）分析?！緟⒖寂R界值】以野生型對(duì)照品反應(yīng)管為參照，以野生型對(duì)照峰峰高的1/5劃定閾值線?！緳z驗(yàn)結(jié)果的解釋】1 .空白對(duì)照在Linegene FQD-96A中應(yīng)無(wú)明顯熔解峰， 若分析后出現(xiàn)明顯熔解峰，可能為試劑受到污染或

14、操作過(guò)程中的污染，請(qǐng)排除污染源后重新檢測(cè)；在ABI7500中，空白對(duì)照熒光變化曲線（Normalized Reporter）應(yīng)為逐漸上升的一條斜線（如圖 4）,若出現(xiàn)熒光值下降的 熔解特征曲線，可能為試劑受到污染或操作過(guò)程中的污染，請(qǐng)排除污染源后重新檢測(cè)；2 .野生型對(duì)照管在熔解曲線分析后應(yīng)有單獨(dú)熔解峰，若野生型對(duì)照管無(wú)熔解峰，或出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上熔解峰，該批次樣本需重新檢測(cè)。 請(qǐng)確認(rèn)所使用的試劑是否仍在有效期內(nèi)， 確 定操作是否嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3 .若滿足1和2要求，表明此次實(shí)驗(yàn)成功，對(duì)樣品管進(jìn)行分析：（1）樣品管只出現(xiàn)單才熔解峰，且 Tm值在野生型對(duì)照管熔解曲線峰Tm±1范圍

15、內(nèi)，該樣本判定為陰性（野生型），如圖 5野生峰；（2）樣品管只出現(xiàn)單獨(dú)熔解峰，且Tm值小于野生型對(duì)照管熔解曲線峰Tm值3c以上，則該樣本判定為陽(yáng)性（突變型），如圖 5突變峰；（3）樣品管出現(xiàn)兩個(gè)熔解峰，且兩個(gè)熔解峰分別符合（1）和（2）的要求（如圖 6A）,或樣品管出現(xiàn)一個(gè)寬峰（左右各有一個(gè)高點(diǎn)，可以判為峰值，但兩峰間平緩過(guò)渡，凹陷不明顯，見(jiàn)圖6B、C和D）,則該樣本判定為陽(yáng)性（突變型）；（4） 一般情況下不會(huì)出現(xiàn)突變峰與野生峰位置相差3c以?xún)?nèi)或單一突變峰與野生型對(duì)照管的野生峰位置相差13c的情況，如確實(shí)發(fā)生此種情況，考慮儀器溫度控制和傳感系統(tǒng)是否發(fā)生故障；（5）樣品管在熔解曲線分析中無(wú)明顯熔

16、解曲線峰，可能為DNA樣本中存在PCR抑制劑或DNA量不夠，請(qǐng)確認(rèn)樣本質(zhì)量以及前處理過(guò)程是否規(guī)范，必要時(shí)再行檢測(cè)?？?AB17500粒測(cè)空白對(duì)照示意圖國(guó)5單地突變蟀與野生峰圖6榜測(cè)可能出現(xiàn)的雙峰及寬峰炮解曲線圖A：雙喳 R. C、E；寬嶗【檢驗(yàn)方法的局限性】本試劑盒僅適用于規(guī)定的儀器和檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診治 的唯一依據(jù)?！井a(chǎn)品性能指標(biāo)】1 .本試劑盒能檢出在野生型背景下 1%的Kras基因12、13密碼子各種突變，經(jīng) 1050例非小 細(xì)胞肺癌和結(jié)直腸癌腫瘤組織樣本臨床試驗(yàn)，本品與測(cè)序法作對(duì)照，陽(yáng)性符合率為99.1%,陰性符合率為95.7%,總符合率為97.2%。2 .

17、試劑盒應(yīng)外觀清潔、無(wú)泄漏、無(wú)破損，標(biāo)志、標(biāo)簽字跡清楚；各組分融化后應(yīng)澄清透明， 無(wú)色，無(wú)沉淀。3 .檢測(cè)分別12份陽(yáng)性參考品，陽(yáng)性參考品符合率應(yīng)為100%。4.檢測(cè)10份陰性參考品，陰性參考品符合率應(yīng)為 100%。5 .可以檢出10ng野生型基因組 DNA背景下，含量低至 1%的K-ras基因突變。6 .用2份企業(yè)內(nèi)部精密性參考品分別作10次平行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性且Ct值變異系數(shù)CV<8%或Tm值極差 w 1C。 【注意事項(xiàng)】1 .本試劑盒僅用于體外研究。實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。2. PCR檢測(cè)應(yīng)在有資質(zhì)的臨床 PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照衛(wèi)生部 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基 因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)2010194號(hào)文件規(guī)定進(jìn)行資質(zhì)認(rèn)定和管理。3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程