限制性內(nèi)切核酸酶

1、第三章 限制性內(nèi)切核酸酶一、填空題1. 嚴(yán)格地說限制性內(nèi)切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被證明是的酶。基因工程中把那些具有識(shí)別的內(nèi)切核酸酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切核酸酶。2.年Luria和Human在T偶數(shù)噬菌體對(duì)大腸桿菌感染實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的現(xiàn)象。3.1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種限制酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶后來被命名為，這是第一個(gè)分離到的類限制性內(nèi)切核酸酶。4.通過比較用不同組合的限制性內(nèi)切核酸酶處理某一特定基因區(qū)域所得到的不同大小的片段，可以構(gòu)建顯示該區(qū)域各限制性內(nèi)切核酸酶切點(diǎn)相互位置的。5.類限制性內(nèi)切核酸酶分子量

2、較小一般在2040kDa，通常由亞基所組成。它們的作用底物為雙鏈DNA，極少數(shù)類酶也可作用于單鏈DNA，或DNARNA雜合雙鏈；這類酶的專一性強(qiáng)，它不僅對(duì)酶切點(diǎn)鄰近的兩個(gè)堿基有嚴(yán)格要求，而且對(duì)更遠(yuǎn)的堿基也有要求，因此，類酶既具有專一性，也具有專一性，一般在識(shí)別序列內(nèi)切割。切割的方式有，產(chǎn)生末端的DNA片段或的DNA片段。作用時(shí)需要作輔助因子，但不需要和6.完全的回文序列具有兩個(gè)基本的特點(diǎn)，就是：和7.類限制性內(nèi)切核酸酶一般識(shí)別個(gè)堿基，也有識(shí)別多序列的限制性內(nèi)切核酸酶；根據(jù)對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列的分析，限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列具有傾向，即它們?cè)谧R(shí)別序列中含量較高。8.EcoK是I類限制性內(nèi)切

3、核酸酶，分子組成是_ 分子量是300kDa.在這些亞基中，亞基具有作用；亞基具有的活性;亞基的作用則是，9.個(gè)體之間DNA限制性片段長(zhǎng)度的差異叫10.限制性內(nèi)切核酸酶是按屬名和種名相結(jié)合的原則命名的，第一個(gè)大寫字母取自，第二、三兩個(gè)字母取自，第四個(gè)字母則用表示。11.限制性內(nèi)切核酸酶AcyI識(shí)別的序列是5-GRCGYG-3，其中R，Y12.在酶切反應(yīng)管加完各種反應(yīng)物后，需要離心2秒鐘，其目的是和13.部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3)等。14.第一個(gè)分離的限制性內(nèi)切核酸酶是；而第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性內(nèi)切核酸酶是15.限制性內(nèi)切核酸酶BsuRI和Hae的來源不同，但識(shí)別的序列都

4、是,它們屬于。16.由于DNA是由4種堿基組成的，所以任何限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率的理淪值應(yīng)該是·17.SalI和NotI都是哺乳動(dòng)物中識(shí)別序列稀有的酶，在哺乳動(dòng)物基因組的5kb片段中，找到NotI切點(diǎn)的概率是。18.部分酶切是指控制反應(yīng)條件，使得酶在DNA序列上的識(shí)別位點(diǎn)只有部分得到切割，它的理論依據(jù)是。19.類限制酶識(shí)別DNA的位點(diǎn)和切割的DNA位點(diǎn)是不同的切割位點(diǎn)的識(shí)別結(jié)合有兩種模型，一種是，另一種是。20.限制性內(nèi)切核酸酶通常保存在濃度的甘油溶液中。二、判斷題1.限制與修飾現(xiàn)象是宿主的一種保護(hù)體系，它足通過對(duì)外源DNA的修飾和對(duì)自身DNA的限制實(shí)現(xiàn)的。2.限制性內(nèi)切核酸酶在

5、DNA中的識(shí)別切割位點(diǎn)的二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)也影響酶切效率, 一般來說，完全切割質(zhì)粒或病毒DNA，要比切割線狀DNA需要更多的酶，最高的需要20倍，3.如果限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影響切割，如HpaII和MboI要求識(shí)別序列之前至少有一個(gè)堿基對(duì)存在才能切割。4.能夠產(chǎn)生防御病毒侵染的限制性內(nèi)切核酸酶的細(xì)菌，其本身的基因組中沒有被該核酸酶識(shí)別的序列。5.限制性圖譜與限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)圖譜的最顯著的區(qū)別在于前者是一個(gè)物理圖譜而后者是個(gè)連鎖圖6.用限制性內(nèi)切核酸酶Hae分別切割載體DNA和供體DNA后，可用E.coli DNA連接酶進(jìn)行連接。7.已知

6、某內(nèi)切核酸酶在一環(huán)狀DNA上有3個(gè)切點(diǎn)，因此，用此酶切割該環(huán)狀DNA,可得到3個(gè)片段。8.迄今所發(fā)現(xiàn)的限制性內(nèi)切核酸酶既能作用于雙鏈DNA，又能作用于單鏈DNA。9.基因工程中使用的類限制性內(nèi)切核酸酶不僅有內(nèi)切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性10.DNA多態(tài)性就是限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。11.用限制性內(nèi)切核酸酶PstI切割質(zhì)粒pBR322后，再用外切核酸酶Exo進(jìn)行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突變體。12.甘油會(huì)使許多限制性內(nèi)切核酸酶的特異性發(fā)生改變，是導(dǎo)致些酶的星活性的主要原因之一，防止的辦法是在酶切反應(yīng)體系中，將甘油的濃度控制在5以下。13.具有EcoR末端的外源片段只能以一個(gè)方向

7、插入到EcoRlI末端的載體中。14.從Esherichia coliK中分離的限制性內(nèi)切核酸酶命名為EcoK。15.同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的兩個(gè)末端都是相同的，16.在限制與修飾系統(tǒng)中，修飾主要是甲基化作用，一旦位點(diǎn)被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。17.稀有酶是指那些識(shí)別序列很長(zhǎng)又不常用的限制性內(nèi)切核酸酶。三、選擇題(單選或多選)1.關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有( )不太恰當(dāng)。 (a)由作用于同一DNA序列的兩種酶構(gòu)成 (b)這系統(tǒng)中的核酸酶都是n類限制性內(nèi)切核酸酶 (c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾 (d)不同的

8、宿主系統(tǒng)具有不同的限制修飾系統(tǒng)2 .RFLP產(chǎn)生自( ) (a)使用不同的限制性內(nèi)切核酸酶 (b)每種類型的染色體有兩條(二倍體) (c)染色體中堿基的隨機(jī)變化 (d)Southern印跡 (e)不同探針的使用3.型限制性內(nèi)切核酸酶:( ) (a)有內(nèi)切核酸酶和甲基化酶活性且經(jīng)常識(shí)別回文序列 (b)僅有內(nèi)切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供 (c)限制性識(shí)別非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)僅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一種酶提供4.型限制性內(nèi)切核酸酶： ( ) (a)由兩個(gè)亞基組成，僅識(shí)別半甲基化位點(diǎn)。甲基化位點(diǎn)相對(duì)于限制位點(diǎn)的位置(上游或下游)決定了

9、DNA是被甲基化還是被限制 (b)不同亞基的識(shí)別位點(diǎn)甲基化和限制活性相互排斥：MS亞基促使甲基化，R亞基促使限制 (c)由兩個(gè)亞基組成，在識(shí)別位點(diǎn)附近識(shí)別并進(jìn)行甲基化或限制 (d)在錯(cuò)配修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因?yàn)槊附Y(jié)合到DNA上是以結(jié)構(gòu)扭曲為基礎(chǔ)而不是序列錯(cuò)誤識(shí)別 (e)是光依賴型酶，是嘧啶二聚體進(jìn)行“光反應(yīng)”的關(guān)鍵酶，它們能使胸腺嘧啶二聚體間的共價(jià)鍵斷裂5.分析限制性內(nèi)切核酸酶切割雙鏈DNA所得到的DNA片段的長(zhǎng)度有助于物理作圖。這是因?yàn)椋? ) (a)即使只用一種限制酶，因?yàn)镈NA是線性的，所以也可以迅速確定限制性片段序列(b)內(nèi)切酶在等距離位點(diǎn)切割DNA，同時(shí)對(duì)于每個(gè)生物體的長(zhǎng)度是特異的(c

10、)DNA的線性意味著單限制性酶切片段的長(zhǎng)度之和等于DNA的總長(zhǎng),而雙酶切產(chǎn)生的重疊片段則產(chǎn)生模糊的圖譜(d)這些內(nèi)切酶的消化活性是物種特異的(e)這技術(shù)同時(shí)為核苷酸序列提供了廣泛信息6.通過限制性片段分析，可以對(duì)等位基因進(jìn)行精確的分析比較，其原因是：( )(a)限制性內(nèi)切核酸酶只切割兩個(gè)變異等位基因中的個(gè)(b)它利用限制性位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記(c)一個(gè)特定細(xì)胞中等位基因的核苷酸序列不會(huì)是相同的(d)它不依賴于變異等位基因產(chǎn)物的功能。(e)限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)被限制在DNA的編碼區(qū)域內(nèi)7.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)是：( )(a)用于遺傳的“指紋結(jié)構(gòu)”模式分析的技術(shù)(b)二倍體細(xì)胞中的兩個(gè)等

11、位基因限制性圖譜的差別(c)物種中的兩個(gè)個(gè)體限制性圖譜間的差別(d)兩種物種個(gè)體間的限制性圖譜差別(e)兩種酶在單個(gè)染色體上限制性圖譜的差別 8.為了正確地構(gòu)建一個(gè)真核基因組的物理圖譜：( )。(a)必須有可能清晰地分離各個(gè)染色體(通過脈沖場(chǎng)凝膠電泳) (b)必須從單倍體細(xì)胞(配子)中分離DNA，這樣避免了由二倍體細(xì)胞中同源染色體的存在而產(chǎn)生的干擾信息 (c)必須進(jìn)行單個(gè)染色體分析，這只能在細(xì)胞分裂后期進(jìn)行 (d)必須找到對(duì)于每個(gè)染色體只切割一次的限制酶 (e)必須首先分離核DNA和細(xì)胞器DNA，然后對(duì)它們分別作圖9.下面有關(guān)限制酶的敘述哪些是正確的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是內(nèi)切酶

12、(b)限制酶在特異序列(識(shí)別位點(diǎn))對(duì)DNA進(jìn)行切割 (c)同一種限制酶切割DNA時(shí)留下的末端序列總是相同的 (d)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)稍有不同的點(diǎn)切割雙鏈DNA，產(chǎn)生黏末端 (e)一些限制酶在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)相同的位置切割雙鏈DNA，產(chǎn)生平末端10.因研究入噬菌體的限制與修飾現(xiàn)象的本質(zhì)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家是：( )(a)J.Lederberg (b)WArber (c)H.Smith (d)FSanger11.第一個(gè)被分離的類酶是： ( ) (a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB12.雙鏈DNA中一段自我互補(bǔ)的序列被稱為回文序列，這種序列一般具有下列特征：（ ） (a)有

13、對(duì)稱軸 (b)兩條鏈的5'-3'方向的序列相同 (c)是類酶的識(shí)別序列 (d)可增強(qiáng)基因的表達(dá)13 在下列進(jìn)行DNA部分酶切的條件中，控制那一項(xiàng)最好？ (a)反應(yīng)時(shí)間 (b)酶量 (c)反應(yīng)體積 (d)酶反應(yīng)的溫度14 在下列試劑中，那種可以螯合Ca2+離子?( ) (a)EDTA (b)檸檬酸鈉 (c)SDS (d)EGTA15 在下列工具酶中，那一種可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1單鏈核酸酶 (b)末端轉(zhuǎn)移酶 (c)堿性磷酸酶 (d)Bal31核酸酶16 限制性內(nèi)切核酸酶可以特異性地識(shí)別： ( ) (a)雙鏈DNA的特定堿基對(duì) (b)雙鏈DNA的特定堿基序列 (c

14、)特定的三聯(lián)密碼 (d)以上都正確17 在下列酶中，催化反應(yīng)不需要ATP的是( ) (a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA連接酶 (d)BamHI18 下列關(guān)于限制性內(nèi)切核酸酶的表示方法中，正確一項(xiàng)的是( (a)Sau 3A I (b)EcoR I (c)hind (d)Sau 3A 119 限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性是指：( ) (a)在非常規(guī)條件下，識(shí)別和切割序列發(fā)生變化的活性 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快 (d)識(shí)別序列與原來的完全不同20 下面哪種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因?( ) (a)甘油含量過高 (b)反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑 (c)含有非Mg2+的二價(jià)陽離

15、子 (d)酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過低21 DNA被某種酶切割后，電泳得到的電泳帶有些擴(kuò)散，下列原因哪一項(xiàng)不太可能?( ) (a)酶失活 (b)蛋白質(zhì)(如BSA)同DNA結(jié)合 (c)酶切條件不合適 (d)有外切核酸酶污染22 關(guān)于回文序列，下列各項(xiàng)中，( )是不正確的 (a)是限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列 (b)是某些蛋白的識(shí)別序列 (c)是基因的旁側(cè)序列 (d)是高度重復(fù)序列23 關(guān)于宿主控制的限制修飾現(xiàn)象的本質(zhì)，下列描述中只有( )不太恰當(dāng) (a)由作用于同DNA序列的兩種酶構(gòu)成 (b)這一系統(tǒng)中的核酸酶都是類限制性內(nèi)切核酸酶 (c)這一系統(tǒng)中的修飾酶主要是通過甲基化作用對(duì)DNA進(jìn)行修飾 (d)不同

16、的宿主系統(tǒng)具有不同的限制-修飾系統(tǒng)四、簡(jiǎn)答題1 現(xiàn)分離到X82噬菌體的一個(gè)突變型，它同野生型的噬菌斑相當(dāng)不同，并已分離到這兩種噬菌體的DNA，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)個(gè)實(shí)驗(yàn)，初步鑒定是點(diǎn)突變、插入突變還是缺失突變?2 說明SangerDNA測(cè)序法的原理。3 在酶切反應(yīng)緩沖液中加入BSA的目的是什么?機(jī)理是什么?4 Fredfick和McClarin等用一個(gè)由13個(gè)堿基對(duì)的DNA片段與EcoRl反應(yīng)，然后分離到酶和DNA共結(jié)晶的復(fù)合物，通過X射線分析發(fā)現(xiàn)了什么?5 有些噬菌體和質(zhì)粒常常編碼一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系統(tǒng)。你認(rèn)為噬菌體和質(zhì)粒還有哪些可能的方式避免宿主的限制作用?6 某學(xué)生在用EcoRI切割

17、外源DNA片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因?7 在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一個(gè)6bp的類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么?8 下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)(哪些)最有可能是類酶的識(shí)別序列： GAATCG，AAATYr，GATATC，ACGGCA?為什么?9 用連接酶將Sau 3Al(GATC)切割的DNA與經(jīng)BamHl(Gq,GATCO切割的DNA連接起來后，能夠被BamHI切割的機(jī)率有多大(用百分比表示)10 用Klenow酶填補(bǔ)的辦法可使5黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端 這種方法常使DNA上的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問，對(duì)于下列限制酶，用這種方法處理

18、會(huì)不會(huì)使它們的識(shí)別序列都消失?BamH 1(G GATCC)； Taq I(T CGA)，BssH II(G CGCGC)、11 請(qǐng)推測(cè)細(xì)菌的染色體上是否會(huì)有編碼識(shí)別8個(gè)堿基的內(nèi)切酶？怎樣驗(yàn)證?12 當(dāng)兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時(shí)，若要進(jìn)行雙酶切，應(yīng)采取什么措施?五、問答題1 什么是細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)(restriction-modificationsystem，R-M system)2 細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)有什么意義?3 說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。4 I類限制酶具有哪些特點(diǎn)?在基因工程中有什么作用?5 類限制酶有哪些特點(diǎn)?6 何謂限制性內(nèi)切核酸酶的切割頻率?'7 什么

19、是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性，受哪些因素影響？8 雙酶消化法(doubledigests)繪制限制性內(nèi)切核酸酶酶譜的原理。9 什么是DNA多態(tài)性(DNApolymorphism)?10 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。11 計(jì)算下列三種酶各自在某染色體DNA序列上識(shí)別位點(diǎn)間的平均距離：Alu I： 5' AGCT 3 EcoR 1： 5'GAATrC 3'3 'TCGA 53'CTTAGG 5Acy： 5' GPuCGPyC 3' 3'CPyGCPuG 5' (注：Py=任何一種嘧啶；Pu=任何一種嘌呤）12 在細(xì)菌質(zhì)粒pBPI的四環(huán)素抗性基因tetR的中間有一個(gè)H