貼壁細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染protocol

1、一、 實驗材料1、宿主細胞CHO（貼壁細胞）2、脂質(zhì)體LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司）3、6孔細胞培養(yǎng)版4、無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM（GIBICO）5、轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒二、實驗步驟invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000說明書上列舉了24孔、12孔、6孔.板的實驗體系，因為需要轉(zhuǎn)染的細胞量大，所以一直采用的是6孔版做的轉(zhuǎn)染。以下是以6孔板為例說明一下我的體系和方法吧！1、轉(zhuǎn)染前一天，以合適的細胞密度接種到6孔培養(yǎng)板上。（我的接種密度是34*105/ml.）轉(zhuǎn)染時，細胞要達到9095%的融合。2、溶液1：240ul 無血清培養(yǎng)基 + 10 ul l

2、ipofectamine 2000 per well （總體積250 ul）（溫育5min）3、溶液2：X ul 無血清培養(yǎng)基 + 4 ug 質(zhì)粒 per well（總體積250 ul）4、將溶液1與溶液2混合，室溫下置20min。5、與此同時，將6孔板中的細胞用無血清培養(yǎng)基沖洗細胞兩遍后，加入2ml 無血清培養(yǎng)基。6、將溶液1與溶液2的混合液逐滴加入孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37，5的CO2中保溫56小時。7、6小時后，更換含有血清的全培養(yǎng)基，在37，5的CO2中4872h檢測轉(zhuǎn)染水平。8、如果做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，換全培養(yǎng)基培養(yǎng)后24h，即可以1：10或更高的稀釋比例（根據(jù)細胞的生長情況）接種到

3、新的培養(yǎng)板，加抗生素進行篩選。三、個人經(jīng)驗：我覺得貼壁細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還是很容易的，有了經(jīng)驗之后，現(xiàn)在做轉(zhuǎn)染得心應(yīng)手，轉(zhuǎn)染前后細胞的形態(tài)幾乎不發(fā)生變化，幾乎沒有細胞死亡。轉(zhuǎn)染率很高。以下是個人經(jīng)驗，與大家分享。1.細胞的狀態(tài)。這點非常重要，不要急于求成，一定要讓細胞處于最佳的生長狀態(tài)再做。有文獻說傳代不要超過17代。我總是在細胞復(fù)蘇后的3代左右做，那時細胞狀態(tài)最好，不要用傳了很多代的細胞去做，細胞的形態(tài)都會發(fā)生變化了。2.細胞的融合度。細胞的融合度必須要達到90%才能做，細胞太少，容易死的。3.無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有條件的話，就用它代替PBS洗細胞兩遍（我曾比較

4、過OPTI-MEM與PBS或無血清的DMEM，前者的轉(zhuǎn)染效率確實高）。注意洗的時候要輕，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細胞，而是轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體滾動在細胞表面。如果洗的太厲害，細胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后，細胞受影響就更大了，死亡細胞會增多。4.加入無血清培養(yǎng)基后56小時更換全培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時間過長，對細胞是有毒性的，這里有血的教訓(xùn)！5.轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。低濃度的質(zhì)粒，我做的結(jié)果都不好。6.48小時mRNA表達最高；72h蛋白表達最高。細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)簡介轉(zhuǎn)染，是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入，

5、轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細胞毒性小等優(yōu)點。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。本公司生產(chǎn)

6、的高效轉(zhuǎn)染試劑VigoFect，是一種以陽離子非脂性物質(zhì)為主的配方組分，該類物質(zhì)介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染，是目前非病毒轉(zhuǎn)染方法中轉(zhuǎn)染效率最高的方法。VigoFect使用方便，轉(zhuǎn)染效率高，對細胞毒性小，并有廣譜的轉(zhuǎn)染特性。在許多實驗室長期使用，獲得了優(yōu)異的效果。一些實驗室用VigoFect進行SiRNA的轉(zhuǎn)染，也獲得滿意的結(jié)果。需要指出的一點，無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù)，要獲得最優(yōu)的轉(zhuǎn)染結(jié)果，可能都需要對轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)，到轉(zhuǎn)染方法的操作細節(jié)，都需要考慮。細胞傳代(1) 試驗準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，

7、廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2) 棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3) 用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2 )。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4) 加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5) 用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。(6) 將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。(7) 用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8) 將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。(9) 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培

8、養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細胞轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A. 將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2) 選擇合適的混合比例(1：11：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5) 將混合液在室溫放置1015分鐘。6) 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。7) 加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。8) 到時后，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時。

9、第二次細胞傳代1) 在轉(zhuǎn)染后24小時，觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。2) 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新粉入培養(yǎng)皿中。3) 在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。 轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。一些傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，如DEAE右旋糖苷法，磷酸鈣法，電穿孔法，脂質(zhì)體法各有利弊，其主要原理及應(yīng)用特點見下表：轉(zhuǎn)染方法原理應(yīng)用特點磷酸鈣法磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染不適用于原代細胞操作簡便但重復(fù)性差有些細胞不適用DE

10、AE-右旋糖苷法帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞瞬時性轉(zhuǎn)染相對簡便、結(jié)果可重復(fù)但對細胞有一定的毒副作用轉(zhuǎn)染時需除血清電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導(dǎo)入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細胞適用性廣但細胞致死率高，DNA和細胞用量大， 需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件病毒介導(dǎo)法通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞，體內(nèi)細胞等逆轉(zhuǎn)錄病毒特定宿主細胞但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期需考慮安全因素腺病毒通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉(zhuǎn)染特定宿主細胞可用于難轉(zhuǎn)染的細胞需考慮安全因素陽離

11、子脂質(zhì)體法帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復(fù)合物被細胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染所有細胞適用性廣，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好，但轉(zhuǎn)染時需除血清。轉(zhuǎn)染效果隨細胞類型變化大Biolistic顆粒傳遞法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內(nèi)逐步釋放，表達瞬時性轉(zhuǎn)染可用于：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞顯微注射法用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時性轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染細胞數(shù)有限多用于工程改造或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎細胞;除上述傳統(tǒng)方法外，近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們

12、的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(proton sponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計更復(fù)雜的基因載體時，PEI經(jīng)常做

13、為核心組成成分。    線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。    GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件