第二章DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制

1、核酸的結(jié)構(gòu)與功能核酸的結(jié)構(gòu)與功能 DNA-DNA-遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，基因是具有特定生遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，基因是具有特定生物學(xué)功能的核苷酸序列，基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻物學(xué)功能的核苷酸序列，基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯能夠使親代的性狀準(zhǔn)確地在子代表現(xiàn)出來(lái)。譯能夠使親代的性狀準(zhǔn)確地在子代表現(xiàn)出來(lái)。DNADNA結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)的。結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)的。 Erwin Chargaff用紙層析技術(shù)分析用紙層析技術(shù)分析DNA的核苷酸組分：的核苷酸組分：(1)腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩爾數(shù)相等，即 A=T；(2)鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的摩爾數(shù)也相等，即 G=C；(3)含氨基的腺嘌

2、呤和胞嘧啶總數(shù)等于含酮基的鳥(niǎo)嘌呤和胸腺含氨基的腺嘌呤和胞嘧啶總數(shù)等于含酮基的鳥(niǎo)嘌呤和胸腺 嘧啶總數(shù)，即嘧啶總數(shù)，即 A+C=T+G；(4)嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即嘌呤的總數(shù)等于嘧啶的總數(shù)，即 A+G=C+T； 所有所有DNA中堿基組成必定是中堿基組成必定是A=T，G=C，這一規(guī)律暗示，這一規(guī)律暗示A與與T，C與與G相互配對(duì)的可能性，為相互配對(duì)的可能性，為Watson和和Crick提出提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)。雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了重要依據(jù)。 該模型揭示了該模型揭示了DNADNA作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，作為遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性特征，最有價(jià)值的是最有價(jià)值的是確認(rèn)了堿基配對(duì)原則，這是確認(rèn)了堿基

3、配對(duì)原則，這是DNADNA復(fù)制、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)，亦是遺傳信息傳遞和表亦是遺傳信息傳遞和表達(dá)的分子基礎(chǔ)。達(dá)的分子基礎(chǔ)。2.3 DNA2.3 DNA的復(fù)制的復(fù)制 生命的遺傳實(shí)際上是DNA自我復(fù)制的結(jié)果。而DNA自我復(fù)制主要是通過(guò)半保留復(fù)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的，是一個(gè)以親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過(guò)程。即細(xì)胞分裂時(shí)，通過(guò)DNA自我復(fù)制將親代細(xì)胞所含有遺傳信息傳遞到子代細(xì)胞。 雙鏈DNA的復(fù)制包括 復(fù)制的起始、延伸和終止三個(gè)階段，并需要拓?fù)洚悩?gòu)酶、解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及DNA連接酶等酶和蛋白質(zhì)的參與。 Watson和Crick提出DNA雙螺

4、旋結(jié)構(gòu)模型的同時(shí)對(duì)其復(fù)制過(guò)程進(jìn)行了探討。 DNA在復(fù)制過(guò)程中堿基間的氫鍵首先斷開(kāi)，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。 新合成2條DNA鏈的核苷酸序列和親代DNA鏈完全相同。因此，每子代分子的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，DNA這種復(fù)制方式叫做DNA的半保留復(fù)制。氯化銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法： 由于15N-DNA分子的密度比普通DNA的密度大，在氯化銫密度梯度離心時(shí)，這兩種DNA分子形成位置不同的區(qū)帶。結(jié)果證實(shí)：結(jié)果證實(shí)：無(wú)論原核還是真核生物無(wú)論原核還是真核生物DNA都是以半保留復(fù)制方式遺傳的都是以半保留復(fù)制方式遺傳的 DNA復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開(kāi)成兩股

5、鏈分別進(jìn)行，所以，這個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，被稱(chēng)為復(fù)制叉。DNA的復(fù)制是由固定的起始位點(diǎn)開(kāi)始的。 復(fù) 制 子是生物體DNA復(fù)制的基本單位，一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始沿著DNA鏈連續(xù)移動(dòng)，起始點(diǎn)可以啟動(dòng)單向復(fù)制或者雙向復(fù)制，這主要取決于在復(fù)制起點(diǎn)形成一個(gè)還是兩個(gè)復(fù)制叉。 1.富含AT：測(cè)定細(xì)菌、酵母、線粒體和葉綠體DNA中的復(fù)制起始點(diǎn)核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)復(fù)制起始點(diǎn)富含AT序列，它可能有利于DNA復(fù)制啟動(dòng)時(shí)雙鏈的解開(kāi)。 2. 細(xì)菌、病毒和線粒體DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，即只有一個(gè)復(fù)制子。 3. 真生物基因組DNA有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，

6、其大小為40-100kb/個(gè)。 放射性自顯影法：對(duì)于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來(lái)標(biāo)記復(fù)制的移動(dòng)。如果一個(gè)脈沖比另一個(gè)脈沖強(qiáng)，我們可以用相對(duì)的標(biāo)記強(qiáng)度來(lái)區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復(fù)制：在復(fù)制眼的一端，一種類(lèi)型的標(biāo)記后緊跟著另一種標(biāo)記；雙向復(fù)制：在復(fù)制眼的兩端產(chǎn)生一種（對(duì)稱(chēng)的）模式。在真核生物中普遍存在。 DNA雙鏈的復(fù)制大都是以半保留方式進(jìn)行的；但是不同生物DNA分子存在形式各不相同，如大小，線性分子和環(huán)狀分子，功能差異，因而反映在復(fù)制方式上的差異。絕大多數(shù)DNA復(fù)制是以復(fù)制叉的形式進(jìn)行的。線性線性DNA雙鏈的復(fù)制雙鏈的復(fù)制 研究表明，DNA聚合酶和RNA聚合聚合酶

7、都只從5端向3端移動(dòng)；體內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后RNA引物被切除，使子鏈短于母鏈。切除后的子鏈5端缺口如何合成？這就提出了線性DNA末端復(fù)制的問(wèn)題。壽命縮短？壽命縮短？355 3線性線性DNADNA末端復(fù)制的特殊機(jī)制末端復(fù)制的特殊機(jī)制（1）線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子：T4噬菌體DNA通過(guò)其末端的簡(jiǎn)并性使不同鏈的3端因互補(bǔ)而結(jié)合。DNA聚合酶作用填滿其缺口，再經(jīng)DNA連接酶作用生成二聯(lián)體。（2）DNA末端形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，是該分子沒(méi)有游離的末端。如草履蟲(chóng)線粒體DNA。（1）-復(fù)制（2）滾環(huán)復(fù)制）滾環(huán)復(fù)制（3）D-環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制2.環(huán)狀環(huán)狀DNA的復(fù)制的復(fù)制（1）-復(fù)

8、制復(fù)制 E. coli基因組的復(fù)制原點(diǎn)位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長(zhǎng)為245 bp，稱(chēng)為oriC，其富含AT，并含有多個(gè)短的重復(fù)序列，能夠被復(fù)制起始點(diǎn)結(jié)合蛋白所識(shí)別。復(fù)制的起始： 涉及DNA雙鏈的解旋和松開(kāi)，形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉。前導(dǎo)鏈DNA開(kāi)始復(fù)制前，復(fù)制原點(diǎn)的核酸序列被轉(zhuǎn)錄生成短的RNA鏈，作為起始DNA復(fù)制的引物。（2）滾環(huán)復(fù)制（rolling cirle） 這是單向復(fù)制的一種特殊形式。X174噬菌體由一個(gè)單鏈環(huán)狀DNA組成，這條鏈稱(chēng)為正（+）鏈，而以其模板合成的互補(bǔ)鏈稱(chēng)為負(fù)（-）鏈。雙鏈體的復(fù)制以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。(3)D-環(huán)型（D-loop）： 這也是一種單向復(fù)制的

9、特殊方式。這種方式首先在動(dòng)物線粒體DNA的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)。雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開(kāi)進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱(chēng)的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。 基因組DNA是雙鏈環(huán)狀；復(fù)制起始區(qū)位于其遺傳圖的84min附近；OriC含有3個(gè)13bp直接重復(fù)序列和4個(gè)9bp的兩個(gè)保守序列。復(fù)制起始后形成的兩個(gè)復(fù)制叉沿著整個(gè)基因組雙向等速移動(dòng)，DNA復(fù)制中間產(chǎn)物呈一個(gè)。 研究證實(shí)多種蛋白質(zhì)及酶參與DNA雙鏈的解開(kāi)過(guò)程。如拓?fù)洚悩?gòu)酶I、DNA解鏈酶及SSB蛋白等。 DNA helicase是經(jīng)水解ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈DNA， 大部分DNA helicase沿著隨后鏈模板5

10、3方向及沿著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)。研究證明：Rep蛋白和特定的DNA解鏈酶分別在DNA兩條鏈上協(xié)調(diào)作用，以解開(kāi)雙鏈DNA。 發(fā)現(xiàn)T4的基因32蛋白可以在遠(yuǎn)低于解鏈溫度時(shí)使雙鏈DNA分開(kāi)，并牢牢地結(jié)合在單鏈DNA上，后來(lái)發(fā)現(xiàn)許多生物中都有這類(lèi)蛋白。 原核生物：SSB蛋白與DNA結(jié)合時(shí)還表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，如第1個(gè)SSB蛋白結(jié)合DNA的能力為1，第2個(gè)SSB蛋白的結(jié)合力可達(dá)103。真核生物SSB蛋白與單鏈DNA結(jié)合時(shí)，不表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。 SSB蛋白: 保證被解鏈酶解開(kāi)的ssDNA在復(fù)制完成之前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，SSB蛋白以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，他沒(méi)有解鏈作用。 DNA復(fù)制過(guò)程中，隨著DNA解旋，雙螺旋的盤(pán)

11、繞數(shù)T減少，而超螺旋數(shù)W增加，使正超螺旋增加，未解鏈部分的纏繞更加緊密，形成的壓力使解鏈不能繼續(xù)進(jìn)行。 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶作用 它能夠消除解鏈造成的正超螺旋堆積，消除阻礙解鏈繼續(xù)進(jìn)行的此種壓力，使DNA復(fù)制得以延伸。 研究發(fā)現(xiàn)：所有DNA復(fù)制是由一個(gè)固定的起始位點(diǎn)開(kāi)始；DNA聚合酶都只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈。 問(wèn)題：一個(gè)新鏈DNA的復(fù)制怎樣開(kāi)始的呢？所有DNA聚合酶都從脫氧核苷酸3-OH端起始DNA合成，所以，DNA復(fù)制時(shí)，由引發(fā)酶(RNA聚合酶)在DNA模板上合成一段RNA鏈，它提供引發(fā)末端（引物），接著由DNA聚合酶從RNA引物的3-OH端開(kāi)始合成新的DNA鏈。無(wú)論前

12、導(dǎo)鏈還是后隨鏈開(kāi)始DNA合成時(shí)，都需要RNA引物。參與DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)： 后隨鏈的引發(fā)由引發(fā)體來(lái)完成。引發(fā)體由n，n，n，DnaB、C和I等6種蛋白質(zhì)共同組成，與引發(fā)酶結(jié)合形成引發(fā)體。DnaA：結(jié)合Ori區(qū)，具ATP酶活性，促進(jìn)DnaB形成起始復(fù)合物DnaB：DNA解鏈酶，有解旋和解鏈作用DnaC：形成起始復(fù)合物，運(yùn)輸DnaBDnaG：DNA引發(fā)酶由dnaG基因編碼，在特定環(huán)境下發(fā)揮作用 的RNA聚合酶Hu： 促進(jìn)起始復(fù)合物形成回旋酶：松馳正超螺旋，促進(jìn)單鏈DAN產(chǎn)生SSB： 促進(jìn)DNA解鏈，穩(wěn)定單鏈DNA性性3.岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制 dsDNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模?/p>

13、此在復(fù)制叉附近的DNA鏈一條是53，另一條是3 5，即兩條模板極性不同。 而DNA聚合酶：DNA合成方向是53，而不是3 5。 無(wú)法解釋DNA兩條鏈?zhǔn)侨绾文軌蛲瑫r(shí)進(jìn)行復(fù)制？ 日本科學(xué)家Okazaki通過(guò)含3H-dTTP 培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸菌標(biāo)記其DNA，提出DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型。 原核生物岡崎片段 真核生物岡崎片段 Okazaki fragment：10002000b。 岡崎片段與DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制。4. 復(fù)制的終止復(fù)制的終止 Tus蛋白參與DNA復(fù)制的終止，而不需要太多蛋白質(zhì)的參與。終止子由22個(gè)堿基的重復(fù)序列的Ter組成。當(dāng)復(fù)制叉遷移到Ter時(shí)，Te

14、r-Tus復(fù)合物能使DnaB不能再將DNA解鏈，阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)遷移，而為復(fù)制的50-100bp經(jīng)修復(fù)方式填補(bǔ)。拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。5. DNA聚合酶聚合酶(1) 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶的種類(lèi)及其功能聚合酶的種類(lèi)及其功能DNA聚合酶聚合酶 I和和Klenow 片段片段 This enzyme is purified from E. coli cells in which the 3- end two-thirds of the E. coli DNA polymerase I gene is cloned. Thus, it has 35exonuclea

15、se activity, but not 53exonuclease activity.68 kD35 kDDNA聚合酶聚合酶 其有53聚合酶活性，但活性低，其酶活性是DNA聚合酶的5%。 通過(guò)其3 5 核酸外切酶活性可起校正作用。DNA聚合酶聚合酶 其有53聚合酶活性，3 5 核酸外切酶活性。該酶活性為DNA聚合酶的15倍， DNA聚合酶的300倍。即5萬(wàn)個(gè)核苷酸/min速度合成新DNA鏈。其他其他DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶和分別由dinB和umuD 2C基因編碼，主要在SOS修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用。 2.4.2 真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn) （1）DNA分子上出現(xiàn)多復(fù)制起始位點(diǎn)； （2）真核

16、生物染色體在全部完成復(fù)制前，各個(gè)起始點(diǎn)上 DNA復(fù)制不能再開(kāi)始； （3）真核生物DNA復(fù)制只在其細(xì)胞周期S期進(jìn)行； （4）真核生物復(fù)制子大小約為40100kb。真核生物DNA復(fù)合起始區(qū)特點(diǎn)： 酵母復(fù)制起始區(qū)長(zhǎng)度約為150bp，包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必須的保守區(qū)， 將克隆該DNA片段構(gòu)建環(huán)狀DNA分子，它在酵母中自主復(fù)制的。 酵母復(fù)制起始位點(diǎn)成為自主復(fù)制序列(autonomously replicating sequences, ARS）。不同ARS共同特征是具有一個(gè)11個(gè)A-T堿基對(duì)的保守序列。 ORC（origin recognition complex）識(shí)別并結(jié)合ARS序列，ORC有6種蛋白組成

17、的起動(dòng)復(fù)合物。 人類(lèi)基因組DNA上每隔30000300 000bp序列有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度為50 bp/sec，E.coli的1/20。真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶 哺乳動(dòng)物主要有5種DNA聚合酶，其特性見(jiàn)表2-12.v原核細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長(zhǎng)增殖速度不同的細(xì)胞中DNA鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)量不同。 v細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和RNA。v大腸桿菌染色體DNA復(fù)制調(diào)控 染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細(xì)胞分裂不直接耦聯(lián)。復(fù)

18、制起始不依賴(lài)于細(xì)胞分裂，而復(fù)制的終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。 v復(fù)制子與轉(zhuǎn)錄的操縱子相似，由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部分組成。起始物位點(diǎn)編碼復(fù)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，復(fù)制起點(diǎn)與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用并啟動(dòng)復(fù)制。起始物位點(diǎn)突變使復(fù)制停止并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。v大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)有OriC和OriH兩種，其中OriC是首選的復(fù)制起點(diǎn)，而OriH是在RNaseH缺失突變株中發(fā)現(xiàn)的一系列復(fù)制起點(diǎn)。 調(diào)控主要表現(xiàn)在復(fù)制的起始水平上E.coli 細(xì)胞分裂周期 依營(yíng)養(yǎng)條件變化 DNA復(fù)制周期基本保持30-40min/cycle 37 葡萄糖（C源） 45 min/cell cycle 琥珀酸（C源） 70 min/cell cycle

19、 C starved 10 hrs/cell cycle C suffice 21 min/cell cycle But DNA replication 40min more or less by premature initiation ColE1質(zhì)粒：6646 bp的小質(zhì)粒 拷 貝 數(shù)：2030/cell ColE1質(zhì)粒：不依賴(lài)于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿 主DNA聚合酶I 質(zhì)粒編碼：兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子Rop蛋白和反義RNA（RNA1），Rop蛋白和RNA1控制質(zhì)粒DNA合成所需的引物。 RNA1通過(guò)與引物RNA前體互補(bǔ)作用，阻止RNaseH加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物，而對(duì)

20、DNA復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。 Rop蛋白能提高RNA1與引物前體的互補(bǔ)，增強(qiáng)了RNA1的負(fù)調(diào)控作用。primer（555nts） v真核細(xì)胞的生活周期包括G1、S、G2和M等4個(gè)時(shí)期。vG1:復(fù)制預(yù)備期，S:復(fù)制期，G2:有絲分裂準(zhǔn)備期，M:有絲分裂期。vDNA復(fù)制只發(fā)生在S期。v真核生物DNA復(fù)制有3個(gè)水平的調(diào)控：(1)細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 決定細(xì)胞停留在G1期還是進(jìn)入S期。許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制調(diào)控。 如促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可以誘導(dǎo)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。(2)染色體水平調(diào)控 決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在S期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制機(jī)制還不清楚？(3

21、) 復(fù)制子水平調(diào)控 決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。 此外，真核生物復(fù)制起始還包括轉(zhuǎn)錄活化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段。許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類(lèi)似 。 2.5 DNA的修復(fù)的修復(fù) 一個(gè)物種能夠一代一代地遺傳下去，是因?yàn)镈NA能夠穩(wěn)定復(fù)制。如果DNA不能穩(wěn)定地復(fù)制，那么，物種就不存在了。但，在進(jìn)化過(guò)程中，受到各種因素的影響，導(dǎo)致DNA復(fù)制的差錯(cuò)或堿基突變，使生物具有多樣性。 DNA復(fù)制過(guò)程中，發(fā)生的差錯(cuò)，可以引起突變。同時(shí)，還會(huì)受到一些化學(xué)反應(yīng)、物理反應(yīng)、生物反應(yīng)造成DNA分子損傷，引起DNA突變。DNA突變的主要因素突變的主要因素 堿基脫落: 形成AP位點(diǎn)；堿基的改變; 電離輻射等物理因素；硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯等化學(xué)因素；DNA病毒和RNA病毒感染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、基因重組、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)位等生物因素均能使DNA發(fā)生突變。 1. 錯(cuò)配修復(fù) 經(jīng)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)識(shí)別新合成鏈中的錯(cuò)配并加以校正。 （1）發(fā)現(xiàn)堿基錯(cuò)配; （2）在水解ATP作用下, MutS、MutL與堿