功能基因組-熒光實時定量PCR原理及應(yīng)用

1、熒光實時定量PCR原理及應(yīng)用 l 實時熒光定量PCR檢測技術(shù)的原理 RQPCR技術(shù)是通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。Ct值(cycle threshold，Ct)，即PCR擴增過程中擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)，它與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，模板DNA量越多，熒光達閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 2 實時熒光定量PCR檢測

2、技術(shù)的分類 根據(jù)所使用的熒光化學(xué)物質(zhì)的不同，實時熒光定量PCR主要分為2類，分別是熒光探針和熒光染料。熒光探針又可分為水解探針、雙雜交探針、分子信標和復(fù)合探針。熒光染料目前主要是以SYBR Green I為主的一種擴增序列非特異性的檢測方法。2.1水解探針 以TaqMan探針為代表的水解探針，又叫外切核酸酶探針。其原理是應(yīng)用Taq酶天然的5-3核酸外切酶的活性。如圖所示。能夠使雙鏈DNA的5核苷酸裂解單核苷酸釋放。根據(jù)Taq酶這一特性，依照目的基因設(shè)計一個能與之的異性結(jié)合的探針，探針的5端標記熒光報告基團如FAM，3端標有熒光猝滅基團如BHQ，兩者構(gòu)成能量傳遞。正常情況下兩者距離很近形成能量傳

3、遞，5端發(fā)出的熒光被3端熒光猝滅基團所吸收或者抑制而不出現(xiàn)熒光信號的變化。 PCR擴增時，引物和探針都結(jié)合在模板上，探針在引物的上下游之間。隨著反應(yīng)的進行當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時，利用Taq酶的5到3外切酶活性將探針切斷，破換了2個熒光分子之間的能量傳遞，使3端的猝滅作用解除，5端FAM的熒光信號被釋放出來。PCR每復(fù)制一個特異性核苷酸片段，就會有一個探針被切斷，同時一個5端的報告基團發(fā)出的熒光信號被檢測出。這樣PCR產(chǎn)物與熒光信號之間形成一一對應(yīng)的關(guān)系。因為循環(huán)參數(shù)Ct與起始模板數(shù)的對數(shù)成負相關(guān)，通過制定的標準曲線，再根據(jù)待測樣品的Ct值就能確定起始模板的數(shù)量。因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系的

4、熒光強度就能準確的計算出起始模板的拷貝數(shù)。圖圖2 TaqMan2 TaqMan探針熒光實時定量原理探針熒光實時定量原理 2.2 雙雜交探針 又稱Lightcycler技術(shù)，是Roche公司最近開發(fā)的一種PCR定量技術(shù)。其原理如圖3所示。該技術(shù)需要設(shè)計兩條熒光標記探針，將熒光分子和猝滅分子標記分別標記在兩個探針上。第1條探針的5端標記熒光基團，第2條探針的3端標記猝滅基團并且其3端必須被封閉以阻止DNA聚合酶以第2條探針為引物和成DNA。2條探針在目的基因上的互補序列是鄰近的。2條探針首尾相連且2條探針上熒光基團發(fā)出的熒光波長不同，當(dāng)2條探針都已結(jié)合上目的基因時，探針上的熒光基團被猝滅而猝滅基團

5、被激發(fā)。熒光猝滅的程度與起始模板量成正比，從而進行定量分析。圖圖3 3 雙雜交探針實時定量雙雜交探針實時定量PCRPCR原理原理2.3分子信標 又稱分子燈塔法，是一種根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理建立起來的熒光定量技術(shù)。其原理如圖4所示。分子信標長約25 nt，是一段能夠與靶標核苷酸序列互補的探針。它的空間結(jié)構(gòu)成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，頸長約5-7 nt，由與目標序列無關(guān)的互補序列構(gòu)成，其另一端連有熒光基團另一端連有猝滅基團。環(huán)序列是與靶標序列互補的探針；當(dāng)沒有靶標序列時，分子信標呈現(xiàn)頸環(huán)結(jié)構(gòu)，頸部的熒光基團與猝滅基團十分接近可以發(fā)生RFRET；熒光基團發(fā)出的熒光被猝滅基團所吸收，此時并不能檢測到熒光信號。 當(dāng)靶

6、標序列存在時，環(huán)序列與靶標序列結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)比無靶標序列的頸環(huán)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，這種結(jié)構(gòu)使熒光基團與猝滅基團分開，熒光基團發(fā)出的熒光并不能被猝滅基團所吸收，因此可以檢測到熒光信號。圖圖4 4 分子信標實時熒光定量分子信標實時熒光定量PCRPCR原理原理 2.4 復(fù)合探針 這種探針結(jié)合了雙雜交探針和分子信標的優(yōu)點，同樣需要合成2條探針，第1條探針的5”端連人熒光基團，第2條探針的3端連入一個熒光猝滅基團，第1條探針的熒光基團可以和第2條探針的猝滅基團雜交。其原理如圖5所示。當(dāng)2個探針結(jié)合時熒光基團發(fā)出的熒光信號被猝滅基團所吸收因此不能檢測到熒光信號。當(dāng)2個探針分開時，熒光探針發(fā)出的熒光信號就不能夠被

7、猝滅探針的猝滅基團吸收，因而能夠檢測到熒光信號。當(dāng)反應(yīng)體系中沒有與之結(jié)合的模板時，2個探針發(fā)生雜交，無熒光檢測信號。 當(dāng)PCR反應(yīng)體系中存在模板時，探針與模板結(jié)合而分開，從而有熒光信號產(chǎn)生。熒光信號的強度與模板的數(shù)量成正比，因而可以進行PCR定。 圖圖5 5 復(fù)合探針熒光實時定量復(fù)合探針熒光實時定量PCRPCR原理原理2.5 SYBR熒光染料 SYBR是一種特異的結(jié)合小溝的雙鏈DNA的染料，當(dāng)其與雙鏈DNA結(jié)合后能發(fā)出熒光信號。而不與雙鏈DNA結(jié)合的SYBR GreenI染料不會發(fā)出熒光。使熒光信號的強度與PCR擴增產(chǎn)物的增加同步。其原理如圖6所示。SYBR GreenI在實時定量檢測方面有很

8、多優(yōu)點，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，僅需2個用于擴增的引物，不需設(shè)計探針對其標記。成本更低廉。不必因模板不同而特別定制，設(shè)計的程序通用性比較好。圖圖6 SYBR Green 16 SYBR Green 1熒光實時定量熒光實時定量PCR PCR 原理原理3 應(yīng)用（1）轉(zhuǎn)基因植物的定量檢測 轉(zhuǎn)基因作物中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達水平的一個重要因素，對外源基因拷貝數(shù)的檢測成為轉(zhuǎn)基因檢測的關(guān)鍵。王育花等利用SYBR Green熒光染料對轉(zhuǎn)大麥煙酰胺合成酶基因(NAS 1)水稻中的外源基因拷貝數(shù)進行實時PCR檢測。以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作為水稻的內(nèi)標準基因，分別獲得了外源目的基因和內(nèi)標

9、準基因的標準曲線，標準曲線的相關(guān)性和擴增效率十分理想。陳穎等采用實時熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用特異的引物和探針，對轉(zhuǎn)基因大豆中的外源基因EPSPS和內(nèi)標準基因Lectin進行了定量檢測，建立了商業(yè)化轉(zhuǎn)基因大豆RoundupRead的定量PCR檢測方法。黃文勝等1使用反向PCR的方法克隆了轉(zhuǎn)基因延熟番茄“華番一號”的外源基因和番茄基因組之間的一段邊界序列，并設(shè)計了具有品系特異性的熒光探針和引物，通過實時熒光定量PCR技術(shù)建立了華番一號的品系特異性檢測方法。在檢測華番一號番茄時，相對檢測靈敏度可達到01，絕對靈敏度達到20個拷貝。可見該方法檢測的靈敏度非常高。（2）動物檢疫中常見病原體的檢測 豬瘟是

10、A類傳染病對養(yǎng)豬業(yè)的危害十分嚴重。溫國元等u引應(yīng)用TaqMan探針實時定量PCR法建了快速檢測豬瘟病毒技術(shù)。 沙門氏菌是人畜共患病的病原體，也是食源性疾病最常見的病原體。目前對沙門氏菌的檢測主要常規(guī)微應(yīng)用生物學(xué)方法，但是常規(guī)的檢測比較費時費力?？追钡碌葢?yīng)用TaqMan探針定量PCR檢測方法，建立了快速檢測沙門氏菌的RT-PCR方法，其檢測靈敏度比常規(guī)PCR方法高100倍，為沙門氏菌的檢測提供一種更加快速和靈敏的檢測方法。羊痘也是動物病中最為嚴重的一種，常規(guī)診斷羊痘感染的方法費時又費力并且特異性和敏感性不高。不能滿足快速準確診斷的要求?？滴挠竦葏⒔⒌腡aqManPCR技術(shù)，該法檢測結(jié)果穩(wěn)定、特

11、異性和敏感性較高。（3）基因表達研究中的應(yīng)用 賈聰聰?shù)葹榱私獍唏R魚胚胎發(fā)育過程中FGF-3基因的時空表達情況，探討FGF-3基因?qū)ε咛グl(fā)育的調(diào)控作用。該研究應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測FGF-3基因mRNA表達量，擴增FGF3基因特異性片段，構(gòu)建了基因片段重組質(zhì)粒pGEMTFGF-3。通過實時定量檢測得知FGF-3主要在胚胎發(fā)育早期表達。表達可能與胚胎腦、眼、耳、咽弓及尾部器官的發(fā)育調(diào)控有關(guān)。 總結(jié)總結(jié) 實時定量PCR技術(shù)可以對不同組織、不同處理、不同發(fā)育階段的基因表達差異進行實時檢測，檢測不同基因在細胞表達中的豐度、mRNA分析表達和分析基因的表達等研究。 總之，實時熒光定量PCR技術(shù)，具有特異性強、靈敏度高和快速等特點。這種檢測方法是的計算核酸拷貝數(shù)的有效的方法。雖然定量PCR與傳統(tǒng)PCR相比有很多優(yōu)點，但是也有許多不足之處，如：應(yīng)用封閉的檢測，雖然減少了擴增后電泳的檢測，但是不