第四章植物種質(zhì)資源保存

1、第第4 4章章 植物種質(zhì)資源的保存植物種質(zhì)資源的保存一、概念及保存類型 植物種質(zhì)資源保存是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境保存種質(zhì)資源，使個體中所包含的遺傳物質(zhì)保持其遺傳完整性和活力，并能通過繁殖將其遺傳特性傳遞下去。 保存類型有兩種，即原生境保存和非原生境保存。1、原生境保存 將植物的遺傳材料保存在它們的自然環(huán)境中。原生境保存的地方多是植物保護區(qū)，另一種方法為農(nóng)田種植保存。珍寶島國家級自然保護區(qū)美國、馬里蘭、農(nóng)田 2、非原生境保存 將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。 非原生境保存方式有植物園、種子庫、種質(zhì)圃、試管苗庫、超低溫庫等。 具體保存方法有四種：種植保存、貯藏保存、離體保存

2、和基因文庫保存。華南植物園 超低溫庫二、種質(zhì)資源離體保存 離體保存方法： 低溫保存 超低溫保存 生長抑制劑保存（一）低溫保存 一種緩慢生長保存方法，是通過控制培養(yǎng)溫度來限制培養(yǎng)物各種生長因子的作用，使培養(yǎng)物生長減少到最低限度。 低溫保存的基本特征是保存材料的定期繼代培養(yǎng)，不斷繁殖更新； 基本措施是控制保存材料所處的溫度和光照。 延緩保存材料生長速度的另一項措施是改變培養(yǎng)基的成分。 種質(zhì)庫要定期檢查，保持清潔，及時清除污染材料，并注意積累資料。（二）超低溫保存 即冷凍保存，一般以液N2為冷源，使保存溫度維持在-196。1、保存原理 低溫冰凍過程中，如果生物細胞內(nèi)水分結(jié)冰，細胞結(jié)構(gòu)就遭到不可逆的破

3、壞，導致細胞和組織死亡。植物材料在超低溫條件下，冰凍過程中避免了細胞內(nèi)水分結(jié)冰，并且在解凍過程中防止細胞內(nèi)水分次生結(jié)冰而達到植物材料保存目的。 植物細胞含水量大，冰凍保存難度大，投放液N2中易引起組織和細胞死亡，故須借助于冷凍防護劑，防止細胞冰凍或解凍時引起過度脫水而遭到破壞，保護細胞。超低溫冰箱2、基本程序 超低溫保存的基本程序包括預處理、冷凍處理、冷凍貯存、解凍和再培養(yǎng)。（1）預處理 為保證莖尖在液N2處理后具有穩(wěn)定且高的存活率，需進行一定的預處理，或在冷凍防護劑存在下進行預培養(yǎng)，或直接進行低溫（-310）預處理。（2）冷凍處理 冷凍處理的方法有快速冷凍法、慢速冷凍法、預冷凍法和干燥冷凍法

4、。a、快速冷凍法 指將植物材料從0或者其他預處理溫度直接投入液氮中保存的方法，降溫速度為1000/min。 要求細胞體積小、細胞質(zhì)濃厚、含水量低、液泡化程度低的材料。b、慢速冷凍法 將處于0或其他預處理溫度的材料以12/min的降溫速度從起始溫度降到-100，穩(wěn)定1h后，投入到液氮保存或以此降溫速度連續(xù)降溫至-196的方法。 適宜保存的材料有成熟的、含有大液泡和含水量高的細胞，對于保存在懸浮培養(yǎng)中的細胞特別有效。c、預冷凍法 指將植物保存材料放入液氮前，需經(jīng)過短暫時間的低溫鍛煉的方法。可分為兩步冷凍法和逐級冷凍法。 可使保存材料細胞內(nèi)充分脫水，避免因細胞內(nèi)結(jié)冰而導致不可逆?zhèn)Φ某霈F(xiàn)。d、干燥冷

5、凍法 將材料置于2729烘箱內(nèi)降低植物含水量，再投入液氮中保存的方法?？煞乐共牧蟽鏊馈＃?）冷凍貯存 適宜溫度下貯存冷凍材料也很重要。長期內(nèi)貯存在液氮內(nèi)的材料，需合適的液氮容器。冷凍貯存的莖尖隨保存時間的延長，其生活力可能下降。（4）解凍 植物材料在超低溫貯存過程中所發(fā)生的凍害是在冷凍和解凍過程中產(chǎn)生的。 解凍過程中發(fā)生的凍害是由細胞內(nèi)次生結(jié)冰造成的。 解凍過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系造成破壞。a、快速解凍法 是指將液氮中保存的材料直接投入到3740溫水浴中進行解凍的方法。解凍的升溫速度為500750/min，大多數(shù)植物材料可采用此種方法。解凍方法有快速解凍和慢速解凍兩種。b、慢速解凍法 將

6、液氮中保存的材料先置于0低溫下解凍，再逐漸升至室溫下進行解凍的方法。適宜細胞含水量較低的材料。 如木本植物的冬芽。（5）再培養(yǎng) 指將已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復生長的過程。再培養(yǎng)是檢驗冷凍保存效果或確定保存方法是否合適的最根本方法。3、影響因素 預處理 冷凍 解凍方法 植物材料的性質(zhì) 冷凍保護劑的使用 所使用的冷凍保護劑應具有以下特性： 分子質(zhì)量較小 易于與溶劑混合 快速滲入細胞 無毒或毒性小 易洗脫 常用的是DMSO。冷凍保護劑的作用：冷凍保護劑的作用：降低冰點，促進過冷卻和降低冰點，促進過冷卻和“玻璃化玻璃化”狀態(tài)形狀態(tài)形成成提高溶液黏滯性，阻止冰晶形成提高溶液黏滯性，阻止冰晶形成

7、增加細胞膜透性，加速胞內(nèi)水分向外滲出增加細胞膜透性，加速胞內(nèi)水分向外滲出穩(wěn)定細胞內(nèi)大分子正常結(jié)構(gòu)，阻止低溫對膜穩(wěn)定細胞內(nèi)大分子正常結(jié)構(gòu)，阻止低溫對膜的傷害的傷害4、超低溫保存后細胞或組織活力檢測、超低溫保存后細胞或組織活力檢測 根本方法是再培養(yǎng)根本方法是再培養(yǎng) 染色法：染色法：FDA、伊凡藍法、伊凡藍法、TTC等等存活率公式存活率公式存活率（存活率（%）= 100%重新生長的細胞（組織）數(shù)重新生長的細胞（組織）數(shù) 解凍的細胞（組織）數(shù)解凍的細胞（組織）數(shù)（三）生長抑制劑保存 主要包括高滲保存法、生長抑制劑保存法、饑餓法、礦物油覆蓋法、低光照培養(yǎng)法及低壓保存法。1、高滲保存法、高滲保存法 利用培

8、養(yǎng)基的高滲透壓來抑制離體培養(yǎng)材料生長的利用培養(yǎng)基的高滲透壓來抑制離體培養(yǎng)材料生長的種質(zhì)保存方法。種質(zhì)保存方法。 高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、高滲物質(zhì)：甘露醇、蔗糖、PEG等等 高滲保存配合低溫效果更明顯高滲保存配合低溫效果更明顯如：如： 610低溫下，培養(yǎng)基中加低溫下，培養(yǎng)基中加4%甘露醇，可保存馬甘露醇，可保存馬鈴薯鈴薯1 2年，存活率最高可達年，存活率最高可達90%以上。以上。2、生長抑制劑保存法、生長抑制劑保存法 在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的在培養(yǎng)基中加入生長抑制劑以減緩培養(yǎng)材料的生長，達到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。生長，達到長期保存種質(zhì)材料的保存方法。生長調(diào)節(jié)劑：生長調(diào)節(jié)劑： ABA、青鮮素、青鮮素、CCC、多效唑、多效唑、B9等等 使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移使試管苗生長緩慢，生長健壯、葉色濃綠、移栽成活率高。栽成活率高。3、饑餓法、饑餓法 從培養(yǎng)基中減去從培養(yǎng)基中減去12種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相種營養(yǎng)元素，使植株缺乏相關(guān)營養(yǎng)而處于最小生長量關(guān)營養(yǎng)而處于最小生長量4、礦物油覆蓋法、礦物油覆蓋法 使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長使培養(yǎng)材料與空氣隔絕，延緩生長5、低光照培養(yǎng)、低光照培養(yǎng) 適當