第十章 轉化及篩選

1、重組重組DNADNA導入宿主細導入宿主細 胞與轉化子的篩選胞與轉化子的篩選 第一節(jié)重組DNA向宿主細胞的導入 第二節(jié)轉化子的篩選與鑒定 第三節(jié)目的基因序列測定第一節(jié)重組DNA向宿主細胞的導入一、轉化二、通過接合作用傳遞質粒DNA三、通過轉染/轉導作用傳遞遺傳物質一、轉化:以質粒作為克隆載體將目的基因導入宿主細胞1928年,美國的Oswald,Avery首次開展了肺炎球菌的轉化試驗感受態(tài)細菌是指細菌處于容易接受外源DNA的狀態(tài)。有的細菌在生長周期任何時候自動產生如枯草、嗜血桿菌。有的在對數(shù)生長期發(fā)生，如E.coli。產生機制不明。一是原生質體假說，另一是酶受體假說。轉化作用就是一種基因型細胞（感

2、受態(tài)細菌）從周圍介質中吸收來自另一種基因型細胞的DNA,進而使原來細胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生相應變化的現(xiàn)象。常見轉化方法有 原生質體轉化法；原生質體轉化法； 化學轉化法；化學轉化法； 電穿孔法。 原生質體轉化法原生質體轉化法:除去細胞壁后加外源DNA，經吸收恢復再生培養(yǎng)，如枯草桿菌。 化學轉化法化學轉化法: 1970年Mandel和Higa首先用CaCl2經短暫的熱休克后，可使外源DNA轉入E.coli。1.原理：將對數(shù)生長期的細菌在0下,用預冷的CaCl2溶液低滲處理,以使菌體的細胞壁和細胞膜通透性增加,菌體膨脹成球形。DNA易于進入細菌的細胞內。用冷CaCl2低滲處理E.coli使菌體成球

3、形，外源DNA可形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物而被吸附，經短暫42熱休克，易于進入胞內而不被降解，轉化效率達105-106，它與菌株（hsdR-).2.方法:（1）感受態(tài)細菌的制備（2）轉化（1）感受態(tài)細菌的制備接種一環(huán)DH5于2mlLB中37，振蕩過夜以約1%的接種量接入20mlLB中振蕩培養(yǎng)約90至OD6000.2離心（5K，5）收集菌體加入預冷CaCl2（10ml100mM）冰浴20離心收集菌體加入100ul100mM預冷CaCl2混勻轉化項目CaCl2受體菌DNA液體LB皿a陽性對照10ulPBR322DNAlng100ulb陰性對照10ul2ul連接液100ulc陰性對照10u

4、l100uld連接液轉化組60ul6ul連接液600ul（2）轉化：0，在1.5ml離心管中按下表加入CaCl2、受體菌及DNA進行轉化實驗冰浴30422（熱休克）冰浴，2加37預熱LB培養(yǎng)45表中a、b、c各取100ul/皿涂布（連接液轉化組d梯度涂布I50ul2皿；II.500ul濃縮后2皿）37倒置培養(yǎng)過夜檢查細菌生長情況電穿孔法原理：利用高壓脈沖電場,在宿主細胞表面形成暫時性的微孔,質粒DNA可乘隙而入,在脈沖過后,微孔復原。它比CaCl2法操作更簡單，轉化效率高（一般可達1091010個轉化子gDNA）,不僅無需制備感受態(tài)細胞,而且適用于任何菌株。二、通過接合作用傳遞質粒DNAF質粒

5、（F因子）又稱性質粒,除了含有自我復制基因外,還帶有一套接合轉移的基因,凡攜有F質粒的細菌稱F+菌株。不帶有F質粒的細菌稱F菌株。F+菌株（供體菌）一旦與F菌株（受體菌）發(fā)生接觸，F(xiàn)+菌株可通過性菌毛將F質粒轉給F菌株，使F-菌株轉變成F+菌株。質粒由F+向F菌的轉移過程叫接合作用傳遞質粒,又稱質粒的接合傳遞。凡帶有在染色體上整合F質粒的細菌又稱高頻重組株系（Hfr株系）。Hfr株系不穩(wěn)定，F(xiàn)質?？砂l(fā)生接合傳遞質粒DNA,F+菌株可失去F質粒,F菌也可獲得F質粒,其轉移難以人為控制,又不穩(wěn)定，通常不用作克隆載體。接合- F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient三、通過

6、轉染/轉導作用傳遞遺傳物質 轉染轉染病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導入宿主細胞（或細菌）的過程稱轉染。 轉導轉導以噬菌體為媒介，將外源DNA導入細菌的過程稱轉導。原理：1.重組外源基因的噬菌體DNA,體外包裝成噬菌體，感染宿主菌，同時導入外源基因。2.噬菌體的主動感染將含有外源DNA片段的重組噬菌體DNA導入宿主菌體內第二節(jié)轉化子的篩選與鑒定一、利用遺傳標志的表型特征篩選二、根據(jù)重組子的結構特征篩選一、利用遺傳標志的表型特征篩選由載體提供的性狀進行篩選 1.抗菌素抗性標記篩選 2.抗性基因的插入失活篩選 3.-半乳糖苷酶（LacZ）基因失活篩選法及其-互補的原理根據(jù)插入基因的遺傳性狀進

7、行篩選亮氨酸（Leu)缺陷菌在無Leu培養(yǎng)基中不生長，當含Leu外源基因在此缺陷菌中表達時可生長，以此來篩選陽性克隆。Ampicillin 抗性? yes yesTetracycline 抗性? No yesB X BBBXAmproriAmprTcroriAmprTcroripBR322Bbacktransfer of colonies+ampicillin+ ampicillin+ tetracycline這些克隆是有重組質粒的細菌編碼編碼b-半乳糖苷酶 IPTGX-gal(酶的底物酶的底物)lac promoter藍色菌落IPTG可誘導lacZ形成肽鏈,該產物能與有缺陷的宿主細胞所編碼的

8、N-末端發(fā)生基因內互補，形成有活性的-半乳糖苷酶，分解底物X-gal使菌落呈現(xiàn)藍色。當外源基因DNA片段插入多克隆位點后, 使其編碼的肽鏈失去活性, 使其不能形成-互補, 因此帶有外源基因重組子的細菌形成白色菌落。 非重組質粒非重組質粒: 不含有插入的 DNA藍色菌落 重組質粒重組質粒: 含有插入的 DNA: 白色菌落back非重組質粒非重組質粒重組質粒重組質粒-互補的原理所謂基因內互補作用，在LacZ體系中,是指二個彼此互補的突變基因（突變體1缺失LacZ近操作基因區(qū)段LacI；突變體2帶有完整的近操縱基因而無-半乳糖苷酶活性），它們編碼產生的無活性的多肽產物，但由于二個突變體之間通過肽互補

9、作用可呈現(xiàn)有功能的-半乳糖苷酶活性,進而可分解底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）而產生半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-氯-青定藍,使菌落呈現(xiàn)出藍色反應。然而，當外源基因DNA片段插入載體中LacZ肽區(qū)段的多克隆位點后,就會阻斷序列的讀碼結構,使其編碼的肽失去活性,使重組子所在的細菌不能完成-互補,因此帶有外源基因重組子的細菌形成白色菌落。根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應，可以檢測和篩選出攜有外源基因重組子克隆。此法又稱藍白篩選法。如圖5-1二、根據(jù)重組子的結構特征篩選 1.重組子大小鑒別篩選菌落提取質粒單酶切電泳原質粒 2.酶切鑒定菌落提取質粒雙酶切電泳原質粒 3.PCR篩

10、選法能與插入基因片斷兩端互補的特異引物,以少量抽提的重組子DNA為模板,進行PCR分析 4.原位雜交圖5-3、5-4該法是從基因組文庫中篩選目的基因的首選方法。 5.斑點雜交1)重組體DNA或RNA抽提出來,點膜，然后雜交。2)經提取純化后,雜質少,所以能得到更為確切的結果,既可用于定性,也可通過內參照進行相對定量。 6.Southernblot雜交法原位雜交與斑點雜交都只能鑒定整個重組子中是否會有與探針互補的同源片段,而Southernblot雜交能將同源片斷定位于基因鑒別法比較：同尾酶BamHI和BglIIAGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglBamHIAGATCCTCTA

11、GT4連接酶GAGATCCTCTAGG肺炎雙球菌轉化實驗第三節(jié)目的基因序列測定一、目的基因序列測定的意義 美國聯(lián)邦國家人類基因組研究項目負責人弗朗西斯柯林斯博士在華盛頓隆重宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。由美、英、日、法、德和中國科學家經過13年努力共同繪制完成了人類基因組序列圖，在人類揭示生命奧秘、認識自我的漫漫長路上又邁出了重要的一步。 二、目的基因測序方法 酶法酶法雙脫氧鏈的末端終止法雙脫氧鏈的末端終止法 化學（裂解）法化學（裂解）法酶法酶法雙脫氧鏈的末端終止法雙脫氧鏈的末端終止法1.Sanger雙脫氧末端終止法：因摻入dd-NTP的鏈不能再延長而形成不

12、同長度的末端為A、G、C、T的片段。圖5-52.Sanger雙脫氧-M13體系測序法：采用M13噬菌體組裝基因后，再由引物合成不同長度末端為A、G、C、T的片段圖5-63.Sanger雙脫氧-PUC體系測序法：類似M13體系，只是由PUC體系替代M13噬菌體，再由引物合成不同長度末端為A、G、C、T的片段。圖5-7雙脫氧M13體系DNA序列分析法M13含單鏈DNA，在細菌內形成雙鏈環(huán)狀DNA（RF）。成熟的噬菌體含單鏈DNA分泌到培養(yǎng)液中。雙鏈DNA（RF）：克隆載體，按提取質粒方法從細菌中制備單鏈DNA：測序模板，從培養(yǎng)基的上清中提取目前常用的M13mp18圖5-6 化學（裂解）法化學（裂解）法(如圖如圖)在無NaCl下，用聯(lián)氨（肼）可打開C、T堿基，在C、T堿基發(fā)生斷裂，形成T+C組。加入NaCl，肼切割C形成C組。在中性條件下，硫酸二甲酯可在G處斷開形成G組。加入甲酸可在A、G處斷開，形成G+A組，最后電泳經感光讀片，自動分析得到測序結果。如、圖5-95-10全自動DNA測序儀末端終止法，采用4種熒光染料標記ddNTP，在同一泳道測序，為人類基因