葉綠素方法選擇

1、方法選擇 1、分光光度計(jì)法>熒光光度法>SPAD速測(cè)法浸提比色法>萃取比色法常溫浸提比色測(cè)定>高溫速浸提比色法如果時(shí)間條件允許建議選擇常溫浸提比色法。 2、藥品的選擇常用有機(jī)浸提葉綠素的試劑由甲醇、乙醇、丙酮乙醇對(duì)身體的傷害最小丙酮最厲害如果通風(fēng)條件不是太好建議選擇乙醇有機(jī)試劑混合液提取具有協(xié)同優(yōu)勢(shì)乙醇與丙酮的混合液比甲醇與丙酮的混合液甲醇乙醇混合很少浸提的要完全而且穩(wěn)定乙醇、丙酮、水的浸提效果次之差異不顯著綜上如果能買到丙酮的話乙醇、丙酮以1:3的比例混合液提取最好其次是乙醇、丙酮、水以4.5:4.5:1的比例混合液如果不想用丙酮可以用95%的乙醇代替但是與混合液比提

2、取效率不高。 3、稱樣量0.2g樣品選用20ml浸提液浸提0.5g樣品選用50ml浸提液浸提。 二、 實(shí)驗(yàn)原理 分光光度法測(cè)定葉綠素(包括ab類胡蘿卜素總量) 含量的原理是以有機(jī)溶劑在常溫暗室直接提取樣品中的葉綠素測(cè)定其吸光度根據(jù)葉綠素(包括ab類胡蘿卜素總量)在特定波長(zhǎng)的吸收用公式計(jì)算其含量。 三、 器材 棕色容量瓶、721型分光光度計(jì)751型分光光度計(jì)更好越精確越好 四、 步驟 1、 將葉片洗凈選取中間部分稱0.200克左右并剪成2mm左右碎條 2、 將樣品放入容量瓶中加入浸提液定容放在暗處26h左右 3、 比色如果僅僅測(cè)定葉綠素AB總量測(cè)定波長(zhǎng)在665nm、649nm、652nm處吸光度

3、即可如果還測(cè)定類胡蘿卜素含量再測(cè)定處波長(zhǎng)在470nm處的吸光度即可。目前不同的浸提液提取方法都是在這些波長(zhǎng)下測(cè)定的。 4、 每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品重復(fù)三次空白兩次重復(fù)即可本實(shí)驗(yàn)中空白意義不大 五、 計(jì)算 Ca=13.95*A665-6.88*A649 Cb= 24.96* A649-7.32* A665 C類胡蘿卜素= (1000*A470-2.05* Ca -114.8* Cb)/245 C總= A652*50/(34.5*m) Ca 為葉綠素a的濃度 M 為稱樣量 一、 葉綠素的測(cè)定：乙醇提取比色法，參考陳建勛、王曉峰等方法，有改動(dòng)。 將實(shí)驗(yàn)材料去除大主脈，在0.0001的天平上稱取0.5

4、g左右的葉片至于50ml離心管中，依次加入25ml95%的乙醇密封，在黑暗條件下室溫提取24-36h，將提取液稀釋一定的倍數(shù)（根據(jù)具體情況而定），隨后在UV754N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，波長(zhǎng)665、649、470nm下分別進(jìn)行比色。根據(jù)各波長(zhǎng)的 OD 值按照李合生的方法計(jì)算葉綠素 a、b 和類胡蘿卜素的濃度（mg·L-1），根據(jù)求得的濃度計(jì)算出各色素含量（mg·g-1鮮重表示）。Ca=13.95D6656.88D649Cb=24.96D6497.32D665 Cx.c=(1000D4702.05Ca114.8Cb)/245&#

5、160; 色素在葉片中的含量(mg /g)=色素濃度(mg /L)×提取液總體積(m l)×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量(g)。摘要: 葉綠體色素溶液各組成成分在可見(jiàn)光譜中具有不同的特征吸收峰。因此，應(yīng)用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下所測(cè)定的吸光度。葉綠體色素的提取常用丙酮和乙醇有機(jī)溶劑。葉綠體色素95 乙醇提取液中葉綠素 a 和 b 及類胡蘿卜素分別在 665nm ,649nm 和 470nm 波長(zhǎng)下具有最大吸收峰，據(jù)此所測(cè)得的吸光度值代

6、人不同的經(jīng)驗(yàn)公式（見(jiàn)結(jié)果計(jì)算），計(jì)算出葉綠體色素乙醇提取液中葉綠素 a 和 b 的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的總濃度，并依據(jù)所使用的單位植物組織（鮮重、干重或面積），求算出色素的含量。 一、 實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)?zāi)康?#160;實(shí)驗(yàn)原理： 利用95%乙醇提取葉綠體色素，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素最大吸收峰的波長(zhǎng)分別是665nm、649nm和470nm。     根據(jù)分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度值，可以計(jì)算出乙醇提取液中葉綠體色素含量。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?#160;掌握分光光

7、度法對(duì)葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總濃度和類胡蘿卜素總濃度測(cè)定和計(jì)算的方法。二、 實(shí)驗(yàn)材料和方法 植物材料：菠菜葉片 、番茄幼苗葉片 實(shí)驗(yàn)用具：分光光度計(jì)、天平、研缽、漏斗、剪刀、容量瓶、燒杯、濾紙、滴管等  實(shí)驗(yàn)試劑：95%乙醇、石英砂和碳酸鈣 試驗(yàn)方法：分光光度法 三、 實(shí)驗(yàn)步驟 1、 葉綠體色素的提取 取新鮮菠菜葉片（或番茄幼苗葉片）0.5克,擦干,去中脈,剪碎放入研缽;加入少許石英砂和CaCO3,再加入95%乙醇3ml,研磨成勻漿,再加95%乙醇10ml,靜置10分鐘;

8、用漏斗濾去殘?jiān)?用丙酮反復(fù)沖洗研缽、殘?jiān)翢o(wú)色;用容量瓶定容至50ml 。2、吸光度的測(cè)定 取光徑1cm比色杯，注入上述葉綠素提取液,以95%乙醇注入另一同樣的比色杯內(nèi)作為空白對(duì)照,在波長(zhǎng)665、649和470nm下測(cè)定吸光度。 3、結(jié)果計(jì)算依據(jù)下列丙酮提取液中色素濃度計(jì)算公式,分別計(jì)算出葉綠素a、b的濃度及其葉綠素總濃度和類胡蘿卜素的濃度。 附錄：722分光光度計(jì)的使用 1、 選擇靈敏度旋紐至3；將波長(zhǎng)調(diào)節(jié)到600nm，打開(kāi)樣品室蓋，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)預(yù)熱20min。2、打開(kāi)樣品室蓋，將測(cè)定旋紐調(diào)至T（透光度），用調(diào)節(jié)旋紐0調(diào)0；蓋上樣品室蓋，用調(diào)

9、節(jié)旋紐100調(diào)100。  3、將空白樣品放入樣品槽，按上述方法調(diào)0和調(diào)100。  4、將測(cè)定旋紐調(diào)至A（吸光度），用Abs旋紐調(diào)0，測(cè)定待測(cè)樣品的光密度。 計(jì)算公式 ： 5 95%乙醇提取液中色素濃度的計(jì)算  Ca（葉綠素a）=13.95A665  6.8A649  Cb（葉綠素b）=24.96A649  7.32A665  CT（葉綠素）=Ca+Cb=18.16A649 + 6.63A665 &

10、#160;Cx.c（類胡蘿卜素）=(1000A470  2.05Ca-114.8Cb)/248葉綠體色素含量=   四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 1、菠菜葉片不同波長(zhǎng)下的吸光度(0.42g) 波長(zhǎng)（nm） 吸光度 平均值 665 0.702 0.683 0.755 0.7133 649 0.328 0.326 0.340 0.3313 470 0.823 0.827 

11、;0.861 0.8370  Ca（葉綠素a）=13.95*0.7133  6.8*0.3313= 7.6977mg/L Cb（葉綠素b）=24.96*0.3313 7.32*0.7133=3.0479mg/L CT（葉綠素）=Ca+Cb=18.16*0.3313 + 6.63*0.7133= 10.7456mg/L Cx.c（類胡蘿卜素）=(1000A470 2.05Ca-114.8Cb)/248=1.8995mg/L  ）或積，樣品

12、鮮重（或干重、面稀釋倍數(shù)）提取液體積（）色素濃度（21.mgLLCa（葉綠素a）含量=7.6977mg/L*0.05L*1/0.42g=91.64mg/g Cb（葉綠素b）含量= 3.0479mg/L*0.05L*1/0.42g=36.28mg/g Cx.c（類胡蘿卜素）含量=1.8995mg/L*0.05L*1/0.42g=22.61mg/g 葉綠素含量測(cè)定方法-丙酮法  由于微藻的生長(zhǎng)周期比較復(fù)雜，包括無(wú)性繁殖階段和有性繁殖階段，其在不同階段的生理形態(tài)不同，有時(shí)藻細(xì)胞會(huì)聚集在一起，以片狀或團(tuán)狀形式存在，在顯微鏡下難以確定其所包含的

13、細(xì)胞數(shù)量。 藻細(xì)胞中葉綠素的含量（特別是葉綠素a的含量）通常隨與細(xì)胞的生長(zhǎng)呈較好的線性關(guān)系，因此可通過(guò)測(cè)定藻細(xì)胞中葉綠素含量變化來(lái)反映微藻的生長(zhǎng)情況。 葉綠素測(cè)定采用丙酮研磨提取法。 取適量藻液于10 mL離心管中在4000 rpm轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上清液，藻泥中加入適量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法時(shí)在試管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm離心后，上清液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中。按上述方法對(duì)藻體沉淀進(jìn)行萃取，直至藻體沉淀呈白色為止。定容后，采用722S型可見(jiàn)分光光度計(jì)分別

14、測(cè)定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，葉綠素含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算（Amon,1949）： 葉綠素a含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算：Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm2.69×A645 nm)×稀釋倍數(shù)  葉綠素b含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm4.64×A663 

15、;nm)×稀釋倍數(shù)  葉綠素總含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算： Chlorophyll ab (mg/L) = (20.2×A645 nm8.02×A663 nm)×稀釋倍數(shù) 由于丙酮的沸點(diǎn)較低，較高溫度下?lián)]發(fā)很快。此外，葉綠素穩(wěn)定性較差，見(jiàn)光易分解，因此，本實(shí)驗(yàn)中葉綠素的提取和測(cè)定均在低溫黑暗條件下進(jìn)行，以減少提取過(guò)程中的損失。Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm2.

16、69×A645 nm)×稀釋倍數(shù)  葉綠素b含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm4.64×A663 nm)×稀釋倍數(shù)  葉綠素總含量用以下公式進(jìn)行計(jì)算： Chlorophyll ab (mg/L) = (20.2×A645 nm8.02×A663 nm)×稀釋倍數(shù)&#

17、160;由于丙酮的沸點(diǎn)較低，較高溫度下?lián)]發(fā)很快。此外，葉綠素穩(wěn)定性較差，見(jiàn)光易分解，因此，本實(shí)驗(yàn)中葉綠素的提取和測(cè)定均在低溫黑暗條件下進(jìn)行，以減少提取過(guò)程中的損失。一、 實(shí)驗(yàn)原理和目的    根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比 。 葉綠素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 葉綠素(95%乙醇)在665nm、649nm，類胡蘿卜素在470nm有最大吸收峰，根據(jù)在分光光度計(jì)下測(cè)定的吸光度，求得葉綠素的含量 二、 實(shí)驗(yàn)器具和步驟&#

18、160; 植物材料： 女貞 實(shí)驗(yàn)器具： 分光光度計(jì)；電子天平； 研缽； 試管；  小漏斗；濾紙； 吸水紙； 移液管 ；量筒； 剪刀 試劑： 95乙醇（或80丙酮）；石英砂；碳酸鈣粉 步驟：1.稱取剪碎的新鮮樣品0.1g 左右，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及35ml 95乙醇，研成均漿，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置35min 2. 取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過(guò)濾到10ml試

19、管中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?#160; 3.用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入漏斗中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。最后用乙醇定容至10 ml ，搖勻 4. 把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)。以95乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nm、649nm、470nm下測(cè)定吸光度 5. 計(jì)算公式：  葉綠素的含量（mg/g）= (濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮重。 一、 實(shí)驗(yàn)原理和目的    根據(jù)朗伯比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比 。 葉綠素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 葉綠素(95%乙醇)在665nm、649nm，類胡蘿卜素在470nm有最大吸收峰，根據(jù)在分光光度計(jì)下測(cè)定的吸光度，求得葉綠素的含量 二、 實(shí)驗(yàn)器具和步驟  植物材料： 女貞 實(shí)驗(yàn)器具：