第四章 中藥制劑的含量測(cè)定

1、藥物分析教研室（Analysis of Chinese Preparation）1掌握樣品的處理、分離和凈化掌握樣品的處理、分離和凈化方法方法；滴定分析法、可見(jiàn)滴定分析法、可見(jiàn)-紫紫外分光光度法和外分光光度法和HPLC法的法的含含量計(jì)算方法。量計(jì)算方法。了解常用定量分析方法了解常用定量分析方法學(xué)習(xí)目的：熟悉含量測(cè)定的目的與意義以熟悉含量測(cè)定的目的與意義以及含量測(cè)定方法的效能指標(biāo)及含量測(cè)定方法的效能指標(biāo)2第一節(jié)第一節(jié) 含量測(cè)定的目的與意義含量測(cè)定的目的與意義 中藥制劑質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)中藥制劑質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)鑒別鑒別檢查檢查含量測(cè)定含量測(cè)定中藥制劑的中藥制劑的鑒別鑒別是研究某是研究某種原料藥或成分的存

2、在與種原料藥或成分的存在與否，從而判定藥物的否，從而判定藥物的真?zhèn)握鎮(zhèn)沃兴幹苿┲兴幹苿┖繙y(cè)定含量測(cè)定是研究某是研究某種成分的含量高低是否符合種成分的含量高低是否符合規(guī)定來(lái)判定藥物的規(guī)定來(lái)判定藥物的優(yōu)劣優(yōu)劣，是，是質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。3 通過(guò)測(cè)定制劑中有效成分、毒性通過(guò)測(cè)定制劑中有效成分、毒性成分或某些指標(biāo)性成分的含量來(lái)衡成分或某些指標(biāo)性成分的含量來(lái)衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，以保證中藥制劑的質(zhì)量，質(zhì)量?jī)?yōu)劣，以保證中藥制劑的質(zhì)量，達(dá)到臨床用藥安全、有效和中藥制達(dá)到臨床用藥安全、有效和中藥制劑進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的需要。劑進(jìn)入國(guó)

3、際市場(chǎng)的需要。 中藥制劑含量測(cè)定的意義中藥制劑含量測(cè)定的意義4中藥制劑含量測(cè)定的特點(diǎn)中藥制劑含量測(cè)定的特點(diǎn)含量測(cè)定內(nèi)容含量測(cè)定內(nèi)容中藥制劑中藥制劑化學(xué)藥品化學(xué)藥品對(duì)象不同對(duì)象不同組成及成分復(fù)雜組成及成分復(fù)雜成分單一成分單一供試品溶液制備供試品溶液制備方法繁瑣，大多需方法繁瑣，大多需要凈化分離要凈化分離方法簡(jiǎn)單方法簡(jiǎn)單成分明確成分明確待測(cè)成分確定待測(cè)成分確定先根據(jù)中醫(yī)藥理論先根據(jù)中醫(yī)藥理論選擇藥味，再綜合選擇藥味，再綜合選擇待測(cè)成分選擇待測(cè)成分一般選擇主一般選擇主要成分要成分中藥制劑與化學(xué)藥品含量測(cè)定區(qū)別中藥制劑與化學(xué)藥品含量測(cè)定區(qū)別5樣品處理的主要作用樣品處理的主要作用釋放被測(cè)組分，制成穩(wěn)定試

4、樣釋放被測(cè)組分，制成穩(wěn)定試樣除去雜質(zhì)，純化除去雜質(zhì)，純化濃縮濃縮試樣形式符合測(cè)定的要求試樣形式符合測(cè)定的要求樣品處理的主要步驟樣品處理的主要步驟1. 樣品的粉碎樣品的粉碎2. 樣品的提取樣品的提取3. 樣品的分離純化樣品的分離純化6樣品的粉碎樣品的粉碎目的目的1. 取樣均勻取樣均勻 2. 提取完全提取完全粉碎設(shè)備粉碎設(shè)備粉碎機(jī)、研缽、勻漿機(jī)粉碎機(jī)、研缽、勻漿機(jī) 粒度大小合適粒度大小合適 樣品粉末的分級(jí)（過(guò)篩）樣品粉末的分級(jí)（過(guò)篩） 防止污染或損失防止污染或損失 儀器設(shè)備潔凈儀器設(shè)備潔凈 粉塵和較大顆粒的損失。粉塵和較大顆粒的損失。7樣品的提取樣品的提取 關(guān)鍵關(guān)鍵提取完全提取完全溶劑的選擇溶劑的

5、選擇水、酸水、堿水水、酸水、堿水親水性的有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇、丙酮親水性的有機(jī)溶劑：乙醇、甲醇、丙酮親脂性的有機(jī)溶劑：石油醚、苯、氯仿、親脂性的有機(jī)溶劑：石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷 8常見(jiàn)的提取方法：常見(jiàn)的提取方法： 萃取法萃取法 浸漬法浸漬法 回流提取法回流提取法 連續(xù)回流連續(xù)回流提取法提取法 超聲提取法超聲提取法 水蒸氣蒸餾法水蒸氣蒸餾法 超臨界流體提取法超臨界流體提取法 微波輔助萃取法微波輔助萃取法樣品的提取樣品的提取 9優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，適于熱不穩(wěn)定的樣品，且提優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，適于熱不穩(wěn)定的樣品，且提取雜質(zhì)少取雜

6、質(zhì)少缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)（缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)（12-24 h12-24 h）費(fèi)溶劑（）費(fèi)溶劑（10-5010-50倍）倍）樣品的提取樣品的提取 （一）冷浸法（一）冷浸法操作：操作：樣品樣品精密稱定精密稱定置容器內(nèi)置容器內(nèi)精密加入溶劑精密加入溶劑稱定重量稱定重量浸泡（浸泡（1224h）稱重稱重補(bǔ)足重補(bǔ)足重量量測(cè)定測(cè)定測(cè)定方法：測(cè)定方法：全部測(cè)定法：全部測(cè)定法：過(guò)濾過(guò)濾濾液濾液蒸干蒸干定容定容測(cè)定測(cè)定（殘殘?jiān)柘礈焱耆柘礈焱耆┎糠譁y(cè)定法部分測(cè)定法：過(guò)濾：過(guò)濾濾液濾液取若干體積測(cè)定取若干體積測(cè)定（不適（不適宜揮發(fā)性較大的溶劑）宜揮發(fā)性較大的溶劑）10 采用回流裝置，用單采用回流裝置，用單一溶劑或混合溶劑于水浴一

7、溶劑或混合溶劑于水浴上加熱提取上加熱提取優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：提取效率高，提取時(shí)間短，提取效率高，提取時(shí)間短，為為0.52小時(shí)；提取小時(shí)；提取雜雜質(zhì)較多質(zhì)較多，不適用于熱不穩(wěn)，不適用于熱不穩(wěn)定或具有揮發(fā)性的成分定或具有揮發(fā)性的成分樣品的提取樣品的提取 （二）回流提取法（二）回流提取法（三）連續(xù)回流提取法（三）連續(xù)回流提取法萬(wàn)應(yīng)膠囊（黃連等）中鹽酸小檗堿測(cè)定萬(wàn)應(yīng)膠囊（黃連等）中鹽酸小檗堿測(cè)定+HCl-70%乙醇溶液，加熱回流1h保和丸（陳皮等）中橙皮甙測(cè)定保和丸（陳皮等）中橙皮甙測(cè)定+甲醇，加熱回流至提取液無(wú)色為止 用索氏提取裝置，用索氏提取裝置，利用遇熱易揮發(fā)溶劑利用遇熱易揮發(fā)溶

8、劑反復(fù)提取反復(fù)提取優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：優(yōu)缺點(diǎn)及適用范圍：提取效率高，所需溶提取效率高，所需溶劑少，提取劑少，提取雜質(zhì)較少，雜質(zhì)較少，操作簡(jiǎn)便；受熱易分操作簡(jiǎn)便；受熱易分解的成分不宜使用解的成分不宜使用。11樣品的提取樣品的提取 （四）超聲提取法（四）超聲提取法原理：超聲波的助溶作用原理：超聲波的助溶作用優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，提取速度快優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，提取速度快 超聲波可能引起供試品化學(xué)成分的改變超聲波可能引起供試品化學(xué)成分的改變 需對(duì)超聲頻率、提取時(shí)間、提取溶媒等需對(duì)超聲頻率、提取時(shí)間、提取溶媒等進(jìn)行考察進(jìn)行考察12樣品的提取樣品的提取 （五）超臨界流體提取法（五）超臨界流體提取法（Supercrit

9、ical-fluid extractionSupercritical-fluid extraction，SFESFE）超臨界流體超臨界流體特殊的物質(zhì)狀態(tài)特殊的物質(zhì)狀態(tài)密度密度-d-d液體液體 溶解能力強(qiáng)溶解能力強(qiáng)粘度粘度- -氣體氣體 傳質(zhì)快，有利于待測(cè)組分傳質(zhì)快，有利于待測(cè)組分的擴(kuò)散的擴(kuò)散表面張力幾乎為表面張力幾乎為 0 0 浸潤(rùn)性能好浸潤(rùn)性能好13樣品的提取樣品的提取 超臨界流體提取法超臨界流體提取法密度受壓力、溫度的影響大密度受壓力、溫度的影響大 改變對(duì)溶質(zhì)的溶改變對(duì)溶質(zhì)的溶解能力解能力加入甲醇、氯仿、苯等改變極性加入甲醇、氯仿、苯等改變極性 提取不同極提取不同極性的成分性的成分優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)

10、點(diǎn)：速度快、萃取效率高、方法準(zhǔn)確度高、選速度快、萃取效率高、方法準(zhǔn)確度高、選擇性較高、節(jié)省溶劑、易于自動(dòng)化，而且可避擇性較高、節(jié)省溶劑、易于自動(dòng)化，而且可避免使用易燃，有毒的有機(jī)溶劑，能與色譜和光免使用易燃，有毒的有機(jī)溶劑，能與色譜和光譜等分析儀器直接聯(lián)用譜等分析儀器直接聯(lián)用。14樣品的分離純化樣品的分離純化 （一）沉淀法（一）沉淀法樣品樣品+沉淀劑沉淀劑 雜質(zhì)雜質(zhì)沉淀沉淀過(guò)濾過(guò)濾取濾液測(cè)定取濾液測(cè)定 待測(cè)組分待測(cè)組分沉淀沉淀重量法或溶解后測(cè)定重量法或溶解后測(cè)定蛇膽糖漿口服液蛇膽糖漿口服液含有大量糖，可用無(wú)水乙醇回流樣含有大量糖，可用無(wú)水乙醇回流樣品，冷后過(guò)濾，除糖以消除其干擾。品，冷后過(guò)濾，

11、除糖以消除其干擾。 復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測(cè)定復(fù)方益母草口服液中水蘇堿的含量測(cè)定利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）作沉淀劑，在酸性介質(zhì)利用雷氏鹽（硫氰酸鉻銨）作沉淀劑，在酸性介質(zhì)中可與大部分有機(jī)堿生成難溶于水的配合物與其它中可與大部分有機(jī)堿生成難溶于水的配合物與其它雜質(zhì)分離。雜質(zhì)分離。 15樣品的分離純化樣品的分離純化 （二）蒸餾法（二）蒸餾法適用于具適用于具揮發(fā)性揮發(fā)性的待測(cè)組分，如揮發(fā)油、的待測(cè)組分，如揮發(fā)油、小分子的生物堿、丹皮酚等小分子的生物堿、丹皮酚等最常用水蒸氣蒸餾法最常用水蒸氣蒸餾法共水蒸餾法共水蒸餾法通水蒸氣蒸餾法通水蒸氣蒸餾法水上蒸餾法水上蒸餾法利用鹽析作用，提高蒸餾效果利用鹽

12、析作用，提高蒸餾效果16樣品的分離純化樣品的分離純化 （三）液（三）液- -液萃取法液萃取法直接萃取法直接萃取法萃取劑的選擇萃取劑的選擇 親脂性有機(jī)溶劑：如苯、氯仿或乙醚親脂性有機(jī)溶劑：如苯、氯仿或乙醚弱親脂性的溶劑：如乙酸乙酯、弱親脂性的溶劑：如乙酸乙酯、正正丁醇等丁醇等多次萃?。ǘ啻屋腿。?-43-4次）次）調(diào)整水相酸度，提取有機(jī)酸、有機(jī)堿調(diào)整水相酸度，提取有機(jī)酸、有機(jī)堿利用鹽析作用，提高提取率利用鹽析作用，提高提取率原理：原理：利用試樣中被測(cè)成利用試樣中被測(cè)成分與干擾成分在有機(jī)溶劑分與干擾成分在有機(jī)溶劑（萃取劑）中的（萃取劑）中的溶解度溶解度不不同，通過(guò)多次萃取達(dá)到分同，通過(guò)多次萃取達(dá)到

13、分離凈化的目的。離凈化的目的。17樣品的分離純化樣品的分離純化 （三）（三）液液- -液萃取法液萃取法離子對(duì)萃取法離子對(duì)萃取法 水相酸度的控制水相酸度的控制 離子對(duì)試劑的選擇離子對(duì)試劑的選擇BH+（水相）（水相）+ In-(水相水相) BH+In-（水相）（水相） BH+In-（有機(jī)相）（有機(jī)相） 生物堿生物堿離子對(duì)試劑：酸性染料，如離子對(duì)試劑：酸性染料，如BTB,BCG適合于高度電離的有機(jī)酸、適合于高度電離的有機(jī)酸、堿化合物的萃取堿化合物的萃取18弱極性離子對(duì)弱極性離子對(duì)樣品的分離純化樣品的分離純化 （四）色譜法（層析法）（四）色譜法（層析法）分離原理：吸附色譜、分配色譜、離子交換分離原理：

14、吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、凝膠色譜色譜、凝膠色譜按操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜按操作方式：柱色譜、薄層色譜、紙色譜裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱裝柱方法：濕法裝柱、干法裝柱微柱色譜（固相萃取微柱色譜（固相萃取LSE） 19樣品的分離純化樣品的分離純化 LSE常用凈化劑（填料）常用凈化劑（填料）硅膠硅膠：酸性吸附劑酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層，適用于中性或酸性成分的層析，析，強(qiáng)烈保留堿性化合物。強(qiáng)烈保留堿性化合物。洗脫洗脫順序：順序：極性小極性小大大氧化鋁氧化鋁：帶有堿性，分離一些堿性中草藥成分，：帶有堿性，分離一些堿性中草藥成分，不宜用于醛、酮、內(nèi)酯等類型的化合物分離不宜用

15、于醛、酮、內(nèi)酯等類型的化合物分離 中性、酸性氧化鋁：適用于酸性成分的分離中性、酸性氧化鋁：適用于酸性成分的分離20鍵合相硅膠鍵合相硅膠（C C1818或或ODSODS）: :分分開(kāi)開(kāi)脂溶性和水溶性成分脂溶性和水溶性成分操作程序：操作程序：柱的活化；上樣；清洗；洗脫柱的活化；上樣；清洗；洗脫洗脫洗脫順序：順序：極性極性大大小小大孔樹(shù)脂大孔樹(shù)脂分為極性（分為極性（丙烯酰胺聚合物丙烯酰胺聚合物 ）和非極性（）和非極性（苯苯乙烯和二乙烯苯的共聚物乙烯和二乙烯苯的共聚物）型）型 使用前需要用有機(jī)溶劑除去雜質(zhì)，有時(shí)還需使用前需要用有機(jī)溶劑除去雜質(zhì)，有時(shí)還需用酸、堿清洗用酸、堿清洗 21聚酰胺聚酰胺：與溶質(zhì)

16、形成與溶質(zhì)形成氫鍵氫鍵而產(chǎn)生吸附作用，常用含而產(chǎn)生吸附作用，常用含酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離。酚、酸、醌類藥物樣品液的凈化分離。硅藻土、纖維素硅藻土、纖維素：親水型填料親水型填料，以水基質(zhì)液作為固以水基質(zhì)液作為固定相，與水不混溶的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相定相，與水不混溶的有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的的分配色譜分配色譜離子交換樹(shù)脂離子交換樹(shù)脂：用于除去樣品中的：用于除去樣品中的離子離子及及萃取萃取可離可離解化合物解化合物( (弱酸、弱堿藥物弱酸、弱堿藥物) )活性炭活性炭：非極性吸附劑非極性吸附劑使用前使用前需先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈需先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于，于8080

17、干燥干燥分開(kāi)水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)，單糖與多糖，氨分開(kāi)水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)，單糖與多糖，氨基酸與多肽基酸與多肽22樣品的分離純化樣品的分離純化 （五）固相微萃?。ㄎ澹┕滔辔⑤腿?（SPME） 集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品前處理新方法集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的樣品前處理新方法23樣品的分離純化樣品的分離純化 （六）消化法（六）消化法測(cè)定中藥制劑中的無(wú)機(jī)元素測(cè)定中藥制劑中的無(wú)機(jī)元素濕法消化濕法消化硝酸高氯酸法：適用于血，尿、組織等生物樣適用于血，尿、組織等生物樣品和含動(dòng)植物藥制劑的破壞品和含動(dòng)植物藥制劑的破壞 對(duì)含氮雜環(huán)類有機(jī)物破壞不夠完全對(duì)含氮雜環(huán)類有機(jī)物破壞不夠完全 硝酸硫酸法

18、：與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子的測(cè)定，不宜采有此法。離子的測(cè)定，不宜采有此法。 硫酸硫酸鹽法：常用于：常用于含砷或銻含砷或銻的有機(jī)樣品的的有機(jī)樣品的破壞，破壞后得到三價(jià)砷或銻。破壞，破壞后得到三價(jià)砷或銻。 24樣品的分離純化樣品的分離純化 控制溫度在控制溫度在420420以下以下灰化完全，切勿棄去不易溶灰分灰化完全，切勿棄去不易溶灰分不適用于含易揮發(fā)性金屬不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等，）（如汞、砷等，）有機(jī)樣品的破壞。有機(jī)樣品的破壞。 灼燒灰化(+Na2CO3/MgO)供試品供試品 灰分灰分干法消化干法消化25 重量分析法：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法重量分析法

19、：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法 一、化學(xué)分析法一、化學(xué)分析法適用于適用于含量較高含量較高的成分及的成分及無(wú)機(jī)成分無(wú)機(jī)成分的測(cè)定的測(cè)定滴定分析法滴定分析法 酸堿滴定法酸堿滴定法 沉淀滴定法沉淀滴定法配位滴定法配位滴定法氧化還原滴定法氧化還原滴定法 26重量分析重量分析揮發(fā)法：揮發(fā)法：又叫汽化或干燥法又叫汽化或干燥法如水分測(cè)定及干燥失重測(cè)定如水分測(cè)定及干燥失重測(cè)定萃取法：萃取法：又稱為提取法或抽取法又稱為提取法或抽取法如冰片散中冰片的含量測(cè)定如冰片散中冰片的含量測(cè)定沉淀法沉淀法：如苦參片中苦參總堿的含量測(cè)定：如苦參片中苦參總堿的含量測(cè)定27滴定分析滴定分析酸堿滴定法：酸堿滴定法：測(cè)定生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯

20、類測(cè)定生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯類 沉淀滴定法沉淀滴定法銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機(jī)鹵化物銀量法：生物堿的氫鹵酸鹽及有機(jī)鹵化物四苯硼鈉法：四苯硼鈉法：+生物堿生物堿白色沉淀白色沉淀亞鐵氰化鉀法亞鐵氰化鉀法配位滴定法配位滴定法（EDTA法和硫氰酸銨法）：測(cè)定法和硫氰酸銨法）：測(cè)定鞣質(zhì)、生物堿及含鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等等礦物類制劑礦物類制劑的含量的含量氧化還原滴定法：氧化還原滴定法：酚類、糖類及礦物藥中酚類、糖類及礦物藥中Fe、As等成分的中藥制劑；分為碘量法、高錳酸鉀等成分的中藥制劑；分為碘量法、高錳酸鉀法和亞硝酸鈉法等法和亞硝酸鈉法等28二、紫外可見(jiàn)分光光度法二、

21、紫外可見(jiàn)分光光度法290.575光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測(cè)器檢測(cè)器信號(hào)處理及顯示信號(hào)處理及顯示紫外可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法紫外分光光度計(jì)基本構(gòu)造紫外分光光度計(jì)基本構(gòu)造30紫外可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法（一）單波長(zhǎng)分光光度法（一）單波長(zhǎng)分光光度法吸收系數(shù)法（CHP最為常用）最為常用）A=ECLA=ECL（朗伯朗伯-比爾定律：比爾定律：物質(zhì)對(duì)物質(zhì)對(duì)單色光單色光吸收特吸收特性與性與濃度、液層厚度濃度、液層厚度關(guān)系定律關(guān)系定律 ）對(duì)照品比較法對(duì)照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（對(duì)照品溶液濃度應(yīng)與供試品濃度接近（1001001010）標(biāo)準(zhǔn)曲線法要求：要求： 選擇被測(cè)成分的選擇被測(cè)成

22、分的max為測(cè)定波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，而共存，而共存組分在此波長(zhǎng)處基本無(wú)吸收，并控制供試液的組分在此波長(zhǎng)處基本無(wú)吸收，并控制供試液的吸收度讀數(shù)在吸收度讀數(shù)在0.3-0.7之間之間31吸收系數(shù)法吸收系數(shù)法 測(cè)定供試品溶液在規(guī)定波長(zhǎng)處的吸收度測(cè)定供試品溶液在規(guī)定波長(zhǎng)處的吸收度A A，根據(jù)根據(jù)A=clA=cl，若，若l l和吸光系數(shù)和吸光系數(shù)或或 已知，已知，即可求出被測(cè)物的濃度。即可求出被測(cè)物的濃度。 %11cmElEAClACcm%11或%11cmE例例: :小檗堿溶液在小檗堿溶液在345nm345nm處的處的 為為728728，現(xiàn)，現(xiàn)測(cè)的某小檗堿溶液在測(cè)的某小檗堿溶液在345nm345nm出的吸收度

23、為出的吸收度為0.58240.5824，計(jì)算該小檗堿溶液的濃度。，計(jì)算該小檗堿溶液的濃度。32標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度- -濃度曲線求得樣品溶液的濃度濃度曲線求得樣品溶液的濃度 KCAKCA或?qū)φ掌穼?duì)照法對(duì)照品對(duì)照法在一定線性范圍內(nèi)根據(jù)在一定線性范圍內(nèi)根據(jù)Lambert-Beer Lambert-Beer 定律溶液定律溶液的濃度和吸光度存在以下關(guān)系的濃度和吸光度存在以下關(guān)系樣標(biāo)樣標(biāo)CCAA33紫外可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法（二）計(jì)算分光光度法（二）計(jì)算分光光度法雙波長(zhǎng)分光光度法雙波長(zhǎng)分光光度法（等吸收點(diǎn)法、系數(shù)倍率法）（等吸收點(diǎn)法、系數(shù)倍率法）三波長(zhǎng)法三波長(zhǎng)法導(dǎo)

24、數(shù)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法 一般應(yīng)用于供試品溶液中含有一般應(yīng)用于供試品溶液中含有2 2中或中或2 2種以上種以上的組分的含量測(cè)定。的組分的含量測(cè)定。差示光譜法差示光譜法 利用比樣品濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)品作為利用比樣品濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)品作為空白空白, ,進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算的方法進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算的方法. .34為干擾組分的吸收光譜為待測(cè)組分的吸收光譜為混合組分的吸收光譜關(guān)鍵步驟：選擇1和2的基本條件干擾組分在1 1和2 2處應(yīng)具有相同的吸收度待測(cè)組分在這兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸收光度差值應(yīng)足夠大波長(zhǎng)波長(zhǎng)(1、2)LCAAAbbbbb)(1212雙波長(zhǎng)法等吸收點(diǎn)法雙波長(zhǎng)法等吸收點(diǎn)法a bc計(jì)算分光光度法35分析步驟 選擇雙波長(zhǎng)（1

25、、2） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)濃度作圖（回歸） 樣品測(cè)定 1、2，分別測(cè)定1及2 應(yīng)用條件：吸收曲線有峰和谷雙波長(zhǎng)法等吸收點(diǎn)法雙波長(zhǎng)法等吸收點(diǎn)法a bc計(jì)算分光光度法36紫外可見(jiàn)分光光度法紫外可見(jiàn)分光光度法紫外光譜法中對(duì)儀器和試劑的要求紫外光譜法中對(duì)儀器和試劑的要求（1 1）儀器的校正和檢定：包括波長(zhǎng)精度、吸收度的）儀器的校正和檢定：包括波長(zhǎng)精度、吸收度的準(zhǔn)確性、雜散光等。準(zhǔn)確性、雜散光等。 （2 2）對(duì)溶劑的要求：）對(duì)溶劑的要求：用用1cm1cm石英池盛裝溶劑，以空氣為石英池盛裝溶劑，以空氣為空白，測(cè)定其吸光度，溶劑和吸收池的吸光度在空白，測(cè)定其吸光度，溶劑和吸收池的吸光度在220nm220nm2

26、40nm240nm范圍內(nèi)不得超過(guò)范圍內(nèi)不得超過(guò)0.400.40；在；在241nm250nm241nm250nm范圍內(nèi)不得范圍內(nèi)不得超過(guò)超過(guò)0.200.20；在；在251nm300nm251nm300nm的范圍內(nèi)不得超過(guò)的范圍內(nèi)不得超過(guò)0.100.10；300nm300nm以上不得超過(guò)以上不得超過(guò)0.050.05。37三、薄層掃描法（三、薄層掃描法（TLCSTLCS） 薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長(zhǎng)，斑點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)定色譜掃描是指固定波長(zhǎng)，斑點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)定A-tA-t或或F-lF-l曲曲線。根據(jù)薄層掃描的測(cè)定方式分為線。根據(jù)薄層

27、掃描的測(cè)定方式分為薄層吸收掃描法薄層吸收掃描法和和薄層熒光掃描法薄層熒光掃描法二種方法。二種方法。38薄層掃描法（薄層掃描法（TLCSTLCS）1.1.薄層吸收掃描法薄層吸收掃描法 光源：光源：鎢燈和氘燈；鎢燈和氘燈； 靈敏度：靈敏度：在在200-800nm200-800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇合適波波長(zhǎng)范圍內(nèi)選擇合適波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，其靈敏度可達(dá)長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，其靈敏度可達(dá)ngng級(jí)；級(jí)； 適用范圍：適用范圍：適用于在可見(jiàn)、紫外區(qū)有吸收的物適用于在可見(jiàn)、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過(guò)色譜前或色譜后衍生成上述化合物的質(zhì)，及通過(guò)色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。樣品組分。39薄層掃描法（薄層掃描法（TLC

28、STLCS） 2.2.薄層熒光掃描法薄層熒光掃描法 光源：光源：氖燈或汞燈氖燈或汞燈; ; 靈敏度：靈敏度：最低可測(cè)到最低可測(cè)到10-50pg;10-50pg; 適用范圍：適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過(guò)適當(dāng)適合于本身具有熒光或經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測(cè)定。處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測(cè)定。40四、氣相色譜法（四、氣相色譜法（GCGC） 基本原理基本原理 氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）是將氣化后的試樣由）是將氣化后的試樣由載氣載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱，根據(jù)各組分在流動(dòng)相和（流動(dòng)相）帶入色譜柱，根據(jù)各組分在流動(dòng)相和固定相間作用的不同而分離，并隨載氣依次流出固定相間作用的不同而分離，并隨

29、載氣依次流出色譜柱，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，利用色譜柱，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)，利用保留值保留值進(jìn)行定性，進(jìn)行定性，色譜峰面積或峰高色譜峰面積或峰高進(jìn)行定量的分析方法。進(jìn)行定量的分析方法。 41氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 基本原理基本原理 42氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 基本概念基本概念 色譜峰：由電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所色譜峰：由電信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖所繪制的曲線。（正態(tài)分布曲線）繪制的曲線。（正態(tài)分布曲線） 不正常的色譜峰：前延峰、拖尾峰不正常的色譜峰：前延峰、拖尾峰 常用定量參數(shù)：峰高、峰面積常用定量參數(shù)：峰高、峰面積 常用定性參數(shù)：峰位常用定性參數(shù)：峰位 用于衡量柱效：峰寬用于衡量柱效：峰寬

30、43氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 基本概念基本概念 基線：在操作條件下，沒(méi)有組分流出基線：在操作條件下，沒(méi)有組分流出時(shí)的流出曲線，橫軸直線。時(shí)的流出曲線，橫軸直線。 保留值保留值 保留時(shí)間保留時(shí)間t tR R 保留體積保留體積V VR R 死時(shí)間死時(shí)間t t0 0 死體積死體積V V0 0 調(diào)整保留時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間ttR R 調(diào)整調(diào)整保留體積保留體積VVR R 4445氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 塔板理論塔板理論 塔板理論將色譜柱看作一個(gè)分餾塔板理論將色譜柱看作一個(gè)分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動(dòng)，在每一個(gè)塔板內(nèi)組分分子在移動(dòng)，在每一個(gè)塔板內(nèi)組

31、分分子在固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨固定相和流動(dòng)相之間形成平衡，隨著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從著流動(dòng)相的流動(dòng)，組分分子不斷從一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不一個(gè)塔板移動(dòng)到下一個(gè)塔板，并不斷形成新的平衡。一個(gè)色譜柱的塔斷形成新的平衡。一個(gè)色譜柱的塔板數(shù)越多，則其分離效果就越好板數(shù)越多，則其分離效果就越好 46氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 柱效指標(biāo)柱效指標(biāo)理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)n n及理論塔板高度及理論塔板高度H H 衡量色譜柱分離效果的參數(shù)：衡量色譜柱分離效果的參數(shù)：理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)n n。10105 5-10-106 6 在一定高度內(nèi)，組分可以在兩在一定高度內(nèi)，組分可以在兩項(xiàng)中達(dá)到分

32、配平衡，次高度為理論項(xiàng)中達(dá)到分配平衡，次高度為理論塔板高度。塔板高度。 47氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 柱效指標(biāo)柱效指標(biāo)理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)n n及理論塔板高度及理論塔板高度H H 理理HLn理理或nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理48氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 柱效指標(biāo)柱效指標(biāo) 1b2b1R2R)(2WWttR 指待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定指待測(cè)峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照峰之間的分離情況。的雜質(zhì)對(duì)照峰之間的分離情況。分離度的計(jì)算分離度的計(jì)算完全未分開(kāi)相鄰兩峰完全分離標(biāo)準(zhǔn)基本分離0 . 15 . 10 . 1RRR衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參

33、數(shù)衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)49氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）適用范圍適用范圍 揮發(fā)油及其它揮發(fā)性組分揮發(fā)油及其它揮發(fā)性組分：冰片、桉葉素、樟：冰片、桉葉素、樟腦、丁香酚、龍腦等。腦、丁香酚、龍腦等。 中藥制劑含水量、含醇量中藥制劑含水量、含醇量系統(tǒng)適用性試驗(yàn)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)1.1.理論塔板數(shù)理論塔板數(shù) n5.54(tR/W1/2)2 不得低于最小理論塔板數(shù)；柱長(zhǎng)，柱填充、不得低于最小理論塔板數(shù)；柱長(zhǎng)，柱填充、載體性能等有影響。載體性能等有影響。 50氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)2.2.分離度分離度 R=2(tR1-tR2)/(W1+W2) R1.5 R1.

34、5（兩峰完全分離）（兩峰完全分離）3.3.重復(fù)性重復(fù)性 RSD2.0 RSD2.0 (n=5)(n=5)4.4.拖尾因子拖尾因子 T=W0.05h/2d1(d(d1 1峰極大至峰前沿之間的距離峰極大至峰前沿之間的距離) ) 峰高法定量時(shí)峰高法定量時(shí) 1.05T0.95 1.05T0.95 51氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇一、固定相的選擇一、固定相的選擇氣氣-液分配色譜柱液分配色譜柱固定液的選擇固定液的選擇按相似相溶原則選擇按相似相溶原則選擇按組分性質(zhì)的主要差別選擇按組分性質(zhì)的主要差別選擇 52氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）按相似相溶原則選擇按相似相溶原則

35、選擇 固定液與被測(cè)組分極性固定液與被測(cè)組分極性“相似相溶相似相溶” 非極性組分非極性組分選非極性固定液，選非極性固定液， 按沸點(diǎn)順序出柱，低沸點(diǎn)的先出柱按沸點(diǎn)順序出柱，低沸點(diǎn)的先出柱 中等極性組分中等極性組分選中等極性固定液，選中等極性固定液， 基本按沸點(diǎn)順序出柱基本按沸點(diǎn)順序出柱 強(qiáng)極性組分強(qiáng)極性組分選極性固定液選極性固定液 按極性順序出柱，極性強(qiáng)的后出柱按極性順序出柱，極性強(qiáng)的后出柱53氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）按組分性質(zhì)的主要差別選擇按組分性質(zhì)的主要差別選擇 組分以沸點(diǎn)差別為主組分以沸點(diǎn)差別為主 選非極性固定液選非極性固定液 按沸點(diǎn)順序出柱、沸點(diǎn)低的先出柱按沸點(diǎn)順序出柱、沸點(diǎn)低的

36、先出柱 組分的極性差別為主組分的極性差別為主 選極性固定液選極性固定液 按極性強(qiáng)弱出柱、極性弱的先出柱按極性強(qiáng)弱出柱、極性弱的先出柱例：苯（例：苯（80.10C），環(huán)己烷（），環(huán)己烷（80.70C）選非極性柱選非極性柱 分不開(kāi)；分不開(kāi)；選中強(qiáng)極性柱選中強(qiáng)極性柱 較好分離，環(huán)己烷先出柱較好分離，環(huán)己烷先出柱54氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇一、固定相的選擇一、固定相的選擇2.氣氣-固分配色譜柱固分配色譜柱固定相的選擇固定相的選擇吸附劑：活性炭（非極性）吸附劑：活性炭（非極性） 硅膠，硅膠，AlAl2 2O O3 3（極性，吸附力強(qiáng)）（極性，吸附力強(qiáng)） 分子篩：吸

37、附分子篩：吸附+ +分子篩分子篩高分子多孔微球：高分子多孔微球：GDXGDX有機(jī)合成高分子聚合物、有機(jī)合成高分子聚合物、吸附吸附+ +分配機(jī)制分配機(jī)制 55氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇二、柱溫的選擇二、柱溫的選擇 沸點(diǎn) 固定液配比 %柱溫高（300-400）低 1-5200-250200-3005-10150-180100-20010-15平均 2/3低高 15-2550以下根據(jù)樣品的沸點(diǎn)選擇56氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇三、載氣的選擇三、載氣的選擇柱效、柱壓、靈敏度柱效、柱壓、靈敏度 流速流速20-80mL/min20

38、-80mL/min低流速低流速 氮?dú)獾獨(dú)? *高流速高流速 氫氣氫氣 氦氣氦氣熱導(dǎo)檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器 氫氣氫氣 氦氣氦氣氫焰檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器氫焰檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器 氮?dú)獾獨(dú)?57氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 四、其他條件四、其他條件氣化室（進(jìn)樣口）溫度：氣化室（進(jìn)樣口）溫度： 不超過(guò)沸點(diǎn)不超過(guò)沸點(diǎn)50 50 高于柱溫高于柱溫30-50 30-50 檢測(cè)室溫度：檢測(cè)室溫度： 高于柱溫高于柱溫3030左右左右進(jìn)樣量：進(jìn)樣量： 氣體氣體0.1-1mL 0.1-1mL 液體液體 0.2-1L0.2-1L 58氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

39、實(shí)驗(yàn)條件的選擇 五、檢測(cè)器五、檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器（熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCDTCD）氫焰離子化檢測(cè)器（氫焰離子化檢測(cè)器（FIDFID）氮磷檢測(cè)器（氮磷檢測(cè)器（NPDNPD）電子捕獲檢測(cè)器（電子捕獲檢測(cè)器（ECDECD） 59氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法峰面積的測(cè)量峰面積的測(cè)量正常峰正常峰不對(duì)稱峰不對(duì)稱峰自動(dòng)求和（自動(dòng)積分儀或色譜工作站）：直自動(dòng)求和（自動(dòng)積分儀或色譜工作站）：直接給出接給出A A，h h，W W1/21/2 21605. 1WhA)(21605. 185. 015. 0WWhA60氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 歸一化法歸一化

40、法外標(biāo)法外標(biāo)法 校正因子內(nèi)標(biāo)法校正因子內(nèi)標(biāo)法 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法常用的定量分析方法常用的定量分析方法61氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法定量校正因子定量校正因子 定量）（或不可以直接用同一檢測(cè)器響應(yīng)不同相同量的不同物質(zhì)對(duì)于不同質(zhì)對(duì)于不同檢測(cè)器響應(yīng)前提：相同量的同種物iiiACm62氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法絕對(duì)校正因子絕對(duì)校正因子 iiiiiiAmfAfm關(guān)）分性質(zhì)、儀器靈敏度有絕對(duì)校正因子（與組if的量或質(zhì)量進(jìn)入檢測(cè)器中的物質(zhì)im63氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法相對(duì)校正因子相對(duì)校正因子 s

41、iisssiisimimAmAAmAmfff作條件變化無(wú)關(guān)）相對(duì)校正因子（與操mifsiAAsi和測(cè)混勻進(jìn)樣基準(zhǔn)物純品過(guò)程：精稱siismissiisimmAAfAfAfmm64氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法校正因子內(nèi)標(biāo)法校正因子內(nèi)標(biāo)法校正因子的計(jì)算校正因子的計(jì)算取內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的對(duì)照液進(jìn)樣測(cè)定取內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的對(duì)照液進(jìn)樣測(cè)定A A取含有內(nèi)標(biāo)物的供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定取含有內(nèi)標(biāo)物的供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定A A RRSSSSRRsRCACAAWAWfff/SsXXCAAfC65氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 對(duì)內(nèi)標(biāo)物的基本要求1.1.內(nèi)標(biāo)物

42、是原樣品中不含有的組分內(nèi)標(biāo)物是原樣品中不含有的組分2.2.內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間應(yīng)與待測(cè)組分相近，但彼此內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間應(yīng)與待測(cè)組分相近，但彼此能完全分離能完全分離(R1.5)(R1.5)3.3.內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)內(nèi)標(biāo)物必須是純度合乎要求的純物質(zhì)66氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無(wú)關(guān)定量結(jié)果與進(jìn)樣量的重復(fù)性無(wú)關(guān)與其他組分是否出峰無(wú)關(guān)與其他組分是否出峰無(wú)關(guān)用于測(cè)定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量用于測(cè)定藥物中微量有效成分或雜質(zhì)的含量測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確缺點(diǎn)缺點(diǎn) 操作程序較為麻煩操作程序較為麻煩 尋

43、找合適的內(nèi)標(biāo)物有困難尋找合適的內(nèi)標(biāo)物有困難67氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法歸一化法歸一化法 前提：試樣中所有組分都產(chǎn)生信號(hào)并能檢出色譜前提：試樣中所有組分都產(chǎn)生信號(hào)并能檢出色譜峰峰 依據(jù)：組分含量與峰面積成正比依據(jù)：組分含量與峰面積成正比 %100%100%11nniiiiiiiiifAfAfAfAfAfAC%100%100%1niiiiiAAAAAAC同系物或結(jié)構(gòu)異構(gòu)體68氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法外標(biāo)法外標(biāo)法 以待測(cè)組分純品為對(duì)照物，與試樣中待測(cè)以待測(cè)組分純品為對(duì)照物，與試樣中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法組分的響應(yīng)

44、信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法a a 工作曲線法工作曲線法b b 外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法c c 外標(biāo)兩點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法 69氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法外標(biāo)法外標(biāo)法 b b 外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法 一種濃度對(duì)照物對(duì)比樣品中待測(cè)組分含量 前提：截距為0，對(duì)照品濃度與待測(cè)組分濃度接近 RRAAxCCx70氣相色譜法（氣相色譜法（GC） 定量分析方法定量分析方法外標(biāo)法外標(biāo)法 c c 外標(biāo)兩點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法 前提：選取兩點(diǎn)對(duì)照品的濃度，需涵蓋待前提：選取兩點(diǎn)對(duì)照品的濃度，需涵蓋待測(cè)濃度測(cè)濃度 71氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC） 定量分析方法定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法

45、精密稱量被測(cè)組分的對(duì)照品，配置成適精密稱量被測(cè)組分的對(duì)照品，配置成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液，取一定量，精密加當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法入到供試品溶液中，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測(cè)定含量，再扣除加入對(duì)照品的含量，即測(cè)定含量，再扣除加入對(duì)照品的含量，即得。得。 AxAisCxCxCx72五、高效液相色譜法（五、高效液相色譜法（HPLC） 特點(diǎn)：高柱效、高靈敏度、高選擇性、分析速特點(diǎn)：高柱效、高靈敏度、高選擇性、分析速度快及應(yīng)用范圍廣度快及應(yīng)用范圍廣 適用于測(cè)定適用于測(cè)定 揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差、分子量大的高分子化合物及離子型

46、化合物，如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物合物及離子型化合物，如蛋白質(zhì)、氨基酸、生物堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無(wú)機(jī)鹽類。堿、甾體、類脂、核酸、維生素及無(wú)機(jī)鹽類。 73高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC） 基本原理基本原理 以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法。 1. 1.塔板理論塔板理論 2. 2.速率理論速率理論 理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理74項(xiàng)目項(xiàng)目HPLCHPLCLCLC柱長(zhǎng)柱長(zhǎng)/cm/cm10-2510-25100-200100-200內(nèi)徑內(nèi)徑/

47、mm/mm2-102-1010-2510-25壓力壓力/MP/MP2-202-200.001-0.10.001-0.1柱效柱效/n/m/n/m2 2* *10103 3-5-5* *10103 32-502-50進(jìn)樣量進(jìn)樣量/g/g1010-6-6-10-10-2-21-101-10分離、分析時(shí)間分離、分析時(shí)間/h/h0.05-1.00.05-1.01-201-20裝置裝置自動(dòng)化自動(dòng)化手工手工檢測(cè)方法檢測(cè)方法檢測(cè)器檢測(cè)檢測(cè)器檢測(cè)收集后定性定量收集后定性定量HPLC與與LC的比較：的比較：75項(xiàng)目項(xiàng)目HPLCHPLCGCGC進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式溶液溶液氣化或裂解氣化或裂解流動(dòng)相流動(dòng)相液態(tài)液態(tài)氣態(tài)氣態(tài)

48、壓力壓力/MP/MP2-202-200.1-0.50.1-0.5柱溫柱溫常溫常溫常溫常溫-300-300分離原理分離原理吸附、分配、離子吸附、分配、離子交換、化學(xué)鍵合交換、化學(xué)鍵合吸附、分配吸附、分配應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍大部分物質(zhì)大部分物質(zhì)易揮發(fā)、熱穩(wěn)定易揮發(fā)、熱穩(wěn)定HPLC與與GC的比較：的比較：76高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 色譜柱的選擇色譜柱的選擇 大多數(shù)藥物可用大多數(shù)藥物可用C18反相（反相（ODS）柱）柱加以分加以分離測(cè)定；也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、離測(cè)定；也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；氰基柱）或硅膠吸附色譜

49、柱等； 解離藥物解離藥物可用離子對(duì)色譜、離子抑制色譜或可用離子對(duì)色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測(cè)定；離子交換色譜分離測(cè)定； 脂溶性藥物異構(gòu)體脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測(cè)定可采用硅膠吸的分離測(cè)定可采用硅膠吸附色譜柱。附色譜柱。根據(jù)被分離物質(zhì)的化根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進(jìn)行選擇。度等因素進(jìn)行選擇。77高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜常用流動(dòng)相：常用流動(dòng)相： 流動(dòng)相流動(dòng)相常用溶劑常用溶劑適用范圍適用范圍部分含水溶劑部分含水溶劑甲醇甲醇- -水、乙腈水、乙腈- -水水系

50、統(tǒng)系統(tǒng)用于分離中等極性、用于分離中等極性、弱極性藥物弱極性藥物非水溶劑非水溶劑乙腈乙腈- -二氯甲烷、二氯甲烷、甲醇甲醇- -四氫呋喃等四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可用于可溶于水并具可解離特性的化合物解離特性的化合物78高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 正相鍵合相色譜正相鍵合相色譜： 常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑極性調(diào)節(jié)劑（如異丙

51、醚），（如異丙醚），通過(guò)調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇?qiáng)度；通過(guò)調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇?qiáng)度； 常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。 79高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 洗脫方式洗脫方式 等度洗脫：等度洗脫：同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相的組成保持恒定，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大持恒定，適用于組分?jǐn)?shù)較少、性質(zhì)差別不大的樣品。的樣品。 梯度洗脫：梯度洗脫：在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度和相的組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度和pHpH值等值等），適用于分析組分?jǐn)?shù)

52、多、性質(zhì)相差較大的），適用于分析組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品，使所有組分在適宜條件下復(fù)雜混合物樣品，使所有組分在適宜條件下獲得分離。獲得分離。 80高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 檢測(cè)器檢測(cè)器 UVUV或或UVDUVD：被測(cè)物有紫外吸收，流動(dòng)相的截止：被測(cè)物有紫外吸收，流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。波長(zhǎng)小于檢測(cè)波長(zhǎng)。 FDFD：靈敏度高，熒光物質(zhì)檢測(cè)。：靈敏度高，熒光物質(zhì)檢測(cè)。 ELSDELSD：揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，糖類、高：揮發(fā)性低于流動(dòng)相的組分，糖類、高分子化合物等；不能用含鹽流動(dòng)相。分子化合物等；不能用含鹽流動(dòng)相。 ECDECD、RI

53、DRID、CLDCLD等等 81檢測(cè)器檢測(cè)器特點(diǎn)特點(diǎn)最低檢測(cè)限最低檢測(cè)限適用范圍適用范圍紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器（UVUV或或UVDUVD）: :可變可變波長(zhǎng)型二極波長(zhǎng)型二極管陣列檢測(cè)器管陣列檢測(cè)器 檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì); ; 靈敏度較高靈敏度較高, ,噪音低噪音低, ,線線性范圍寬性范圍寬, ,對(duì)流速和溫度對(duì)流速和溫度波動(dòng)不靈敏波動(dòng)不靈敏, ,可用于梯度可用于梯度洗脫洗脫. .1010-7-7-10-10-12-12g g用于芳烴、稠環(huán)芳用于芳烴、稠環(huán)芳烴、芳香氨基酸、烴、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、核酸、甾體激素、羰基及其化合物等羰基及其化合物等熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器(FD)

54、 (FD) 用于能產(chǎn)生熒光或其衍用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)生物能發(fā)熒光的物質(zhì); ;靈敏度高于紫外檢測(cè)器靈敏度高于紫外檢測(cè)器1 11010-10-10g/mlg/ml用于氨基酸、多環(huán)用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾芳烴、維生素、甾體化合化物及酶等體化合化物及酶等蒸發(fā)光散射檢蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)器(ELSD)(ELSD)屬通用型檢測(cè)器屬通用型檢測(cè)器, ,理論理論上可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)上可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分相的任何樣品組分; ; 檢檢測(cè)靈敏度較低測(cè)靈敏度較低, ,適用于流適用于流動(dòng)相能揮發(fā)的色譜洗脫動(dòng)相能揮發(fā)的色譜洗脫, ,不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相用于檢

55、測(cè)糖、高分用于檢測(cè)糖、高分子化合物、高級(jí)脂子化合物、高級(jí)脂肪酸、磷脂、維生肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油素、氨基酸、甘油三酯及甾體等幾十三酯及甾體等幾十類化合物類化合物82電化學(xué)檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器(ECD)(ECD)用于能氧化、還原的有用于能氧化、還原的有機(jī)物質(zhì)的檢測(cè)，尤其適機(jī)物質(zhì)的檢測(cè)，尤其適用于痕量組分的分析用于痕量組分的分析1 11010-12-12g/mlg/ml適用生物胺、酚、適用生物胺、酚、羰基化合物、巰羰基化合物、巰基化合物等基化合物等示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器(RID)(RID)通用型檢測(cè)器通用型檢測(cè)器, ,利用利用組分與流動(dòng)相折射率之組分與流動(dòng)相折射率之差進(jìn)行檢測(cè)差進(jìn)行檢

56、測(cè). . 穩(wěn)定性穩(wěn)定性好好, ,操作方便操作方便. .靈敏度靈敏度低低, ,受環(huán)境溫度、流動(dòng)受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大相組成等波動(dòng)的影響大, ,不適合梯度洗脫不適合梯度洗脫1010-8-8g/mlg/ml尤其適合于糖類尤其適合于糖類的檢測(cè)的檢測(cè)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CLD)(CLD)高選擇性、高靈敏度高選擇性、高靈敏度的新型檢測(cè)器的新型檢測(cè)器. . 設(shè)備設(shè)備簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單, ,自身發(fā)光自身發(fā)光, ,無(wú)需光無(wú)需光源源, ,價(jià)格便宜價(jià)格便宜PgPg級(jí)級(jí)(10(10-12-12) )用于分析微量脂用于分析微量脂質(zhì)、核酸、生物質(zhì)、核酸、生物胺等胺等83高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPL

57、C）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 HPLCHPLC前處理前處理 流動(dòng)相的處理：流動(dòng)相的處理：溶劑的純化溶劑的純化：色譜純；：色譜純；流動(dòng)相脫氣：流動(dòng)相脫氣：常用超聲波振蕩脫氣；常用超聲波振蕩脫氣； 過(guò)濾：過(guò)濾：防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，采用處的微孔墊片，采用0.45m0.45m以下微孔濾膜過(guò)以下微孔濾膜過(guò)濾，濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種濾，濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種。84 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）實(shí)驗(yàn)條件的選擇實(shí)驗(yàn)條件的選擇 HPLCHPLC前處理前處理 樣品的處理：樣品的處理：待測(cè)組分的提取待測(cè)組分的提取溶劑的揮

58、發(fā)：溶劑的揮發(fā)：自然揮散或在氮?dú)饬飨麓蹈勺匀粨]散或在氮?dú)饬飨麓蹈桑m用于，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；定樣品；冷凍干燥冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。，適用于受熱易分解破壞的樣品。 濾過(guò)濾過(guò)：樣品溶液進(jìn)樣前，需用濾膜抽濾或針頭樣品溶液進(jìn)樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過(guò)濾，以除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子濾器過(guò)濾，以除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。雜質(zhì)。 85高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC）HPLCHPLC法分類及方法法分類及方法l分類分類 一、液固吸附色譜法（一、液固吸附色譜法（LSCLSC

59、） 二、液液分配色譜法（二、液液分配色譜法（LLCLLC） 三、化學(xué)鍵合相色譜法（三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPCBPC） 86高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC） 一、液固吸附色譜法（一、液固吸附色譜法（LSCLSC） 固定相：固定相：硅膠、薄膜型氧化鋁、聚酰胺、高分硅膠、薄膜型氧化鋁、聚酰胺、高分子多孔小球等。子多孔小球等。 流動(dòng)相：流動(dòng)相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、烷烴等。烷烴等。 出柱順序：出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱。出柱。 87高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC） 二、液液分配色譜法（二、液

60、液分配色譜法（LSCLSC） 固定相：載體固定相：載體+ +固定液（物理或機(jī)械涂漬法）固定液（物理或機(jī)械涂漬法）內(nèi)壓大、易流失、不實(shí)用內(nèi)壓大、易流失、不實(shí)用 正相色譜正相色譜固定液極性固定液極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱; ; 適于分離極性組分適于分離極性組分 反相色譜反相色譜固定液極性固定液極性 固定相極性固定相極性出柱順序：出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱后出柱 適用：適用：非極性非極性- -中等極性組分中等極性組分 90 高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLC） 正相鍵