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文檔簡介
1、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識按生長方式按生長方式粘附型細(xì)胞上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型 多型細(xì)胞型各種實(shí)體瘤細(xì)胞懸浮型細(xì)胞造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞成纖維細(xì)胞:梭形、三角形、成纖維細(xì)胞:梭形、三角形、2-3個(gè)突起個(gè)突起上皮細(xì)胞:扁平、多角形、圓核上皮細(xì)胞:扁平、多角形、圓核可連成單層可連成單層(1)(1)上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞(2)(2)成纖維型細(xì)胞成纖維型細(xì)胞( (3)3)游走型細(xì)胞游走型細(xì)胞(4)(4)多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞1234+ + + + + + + + + + +細(xì)胞的貼附過程細(xì)胞的貼附過程貼附物質(zhì)帶正電荷貼附物質(zhì)帶正電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷細(xì)胞帶負(fù)電荷細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多
2、角形,中央有圓形核,細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動,處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,很少單獨(dú)行動。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 來源:來源于外胚層,內(nèi)胚層細(xì)胞 如:皮膚及其衍生物,乳腺外胚層 消化道,呼吸道上皮內(nèi)胚層 內(nèi)皮 中胚層 上皮性腫瘤形態(tài):類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞,但不完全相同上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型生長特點(diǎn)生長特點(diǎn)成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型生長特點(diǎn)生長特點(diǎn)體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞多形型細(xì)胞 注意:注意:培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程二、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過
3、程分裂增殖和生長發(fā)育是體外培養(yǎng)細(xì)胞的兩大生命特征增殖能力一般與該種細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力相仿(一)組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期一)組織培養(yǎng)細(xì)胞生命期 (Life Span of Culture Cells)在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。 原代培養(yǎng)期、 傳代培養(yǎng)期、 衰退期。1、原代培養(yǎng)期、原代培養(yǎng)期 (Primary Culture stage)也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1-4周。特點(diǎn)特點(diǎn):細(xì)胞呈活躍移動,可見細(xì)胞分裂,但不旺盛。與 體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。2、傳代期、傳代期 (passage stage)特點(diǎn)特點(diǎn):在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長,細(xì)
4、胞增殖旺 盛,并能維持二倍體核型。傳代傳代:體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液,否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代。 初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系(Cell Line)。鏡下觀察鏡下觀察選取生長良好的細(xì)胞選取生長良好的細(xì)胞加入胰蛋白酶消化液加入胰蛋白酶消化液倒去酶液,加入培養(yǎng)液倒去酶液,加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液按比例分裝后培養(yǎng)按比例分裝后培養(yǎng)體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期潛伏期潛伏期指數(shù)增生期指數(shù)增生期停滯期停滯
5、期所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。a. 貼附b. 接觸抑制c. 密度抑制培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)3、衰退期、衰退期特點(diǎn)特點(diǎn):此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖, 最后衰退凋亡。細(xì)胞周期M期(期(有絲分裂期)間期間期G1期( DNA合成前期)S期( DNA合成期 )G2期( DNA合成后期)(二)單個(gè)細(xì)胞的生長過程(二)單個(gè)細(xì)胞的生長過程三、培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件三、培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)瓶 溫度、濕溫度、濕度和氣體度和氣體由CO2恒溫孵育箱提供 生長生長培養(yǎng)液培養(yǎng)液1020的血清 維持維持培養(yǎng)液培養(yǎng)液25的血清 營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)糖、氨基酸
6、、維生素、無機(jī)離子、微量元素等 基本營養(yǎng)物質(zhì):基本營養(yǎng)物質(zhì):氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無氨基酸、維生素、碳水化合物及一些無機(jī)離子機(jī)離子促生長因子、激素、血清等物質(zhì)促生長因子、激素、血清等物質(zhì)滲透壓:滲透壓:因細(xì)胞的類型及種族而異。人血漿滲透壓約為因細(xì)胞的類型及種族而異。人血漿滲透壓約為290 mmol/L,可視為體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。鼠,可視為體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓。鼠細(xì)胞滲透壓在細(xì)胞滲透壓在320 mM左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞,滲左右。對于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞,滲透壓在透壓在260-320 mM。pH:大多數(shù)細(xì)胞的適宜大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為為7.2-7.4.無毒、無污染
7、無毒、無污染天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基:血清血清合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基:主要是牛血清主要是牛血清 胎牛血清:胎牛血清:取自破腹產(chǎn)的胎牛 新生牛血清:新生牛血清:取自出生24 h的新生牛 小牛血清:小牛血清:取自出生10-30 d的小牛主要成分主要成分 血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、 生長因子、激素、無機(jī)物等血清:血清:主要作用主要作用 1)提供基本營養(yǎng)物質(zhì)2)提供貼壁和擴(kuò)展因子3)提供激素及各種生長因子4)提供結(jié)合蛋白5)對培養(yǎng)中的細(xì)胞提供某些保護(hù)作用血清:血清:主要缺點(diǎn)主要缺點(diǎn) 1)改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)2)血清中含有的某些物質(zhì)對細(xì)胞有毒害作用3)每個(gè)批次血清的成分不能保持一致4)取材過程
8、中可能污染支原體、病毒等,對培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生潛在影響血清:血清:使用前處理使用前處理 56 oC滅活30 min。儲存條件儲存條件一般儲存于-20 oC,避免反復(fù)凍融,購買大包裝后,先滅活,然后分裝凍存,使用前4 oC融化。使用濃度使用濃度一般為5-20%,最常用為10%。血清:血清:低限量Eagle培養(yǎng)基,僅含有12種2必需氨基酸、谷氨酰胺,8種維生素及必要的無機(jī)鹽。成分簡單,易于添加某種特殊成分適應(yīng)某些特殊細(xì)胞的培養(yǎng)。MEM (minimum essential medium):由Dulbecco等人研制,在MEM基礎(chǔ)上增加了各成分的用量,分為高糖型(葡萄糖4500g/L)和低糖型 (葡萄糖1
9、000g/L),高糖型有利于細(xì)胞停泊在一個(gè)位置生長,適合于生長較快。附著較困難的腫瘤細(xì)胞。DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium):由Iscove等人在DMEM基礎(chǔ)上增加了許多非必需氨基酸及一些維生素,增加了HEPES,葡萄糖含量為高糖型。適合于細(xì)胞密度較低,細(xì)胞生長較困難的情況,如雜交瘤細(xì)胞的篩選培養(yǎng),DNA轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的培養(yǎng)。IMDM (Iscoves modified Dulbeccos medium):由Moor等人為培養(yǎng)小鼠的白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì),特別適合懸浮細(xì)胞,尤其是淋巴細(xì)胞的培養(yǎng),組分較簡單,目前配方適合多種細(xì)胞的生長。RPMI1640:由Morg
10、an等人為培養(yǎng)雞胚組織而設(shè)計(jì),幾乎含有所有氨基酸、維生素、生長激素、核酸衍生物等。109比199效果更好。199、109 medium:由Ham針對小鼠二倍體細(xì)胞克隆化培養(yǎng)而設(shè)計(jì),并逐步改良后也適合人二倍體細(xì)胞的培養(yǎng),F(xiàn)12在F10配方基礎(chǔ)上增加了一些微量元素和無機(jī)離子,特別適合進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)。HamF10、HamF12 medium:由MeCoy 等人專為肉瘤細(xì)胞研制的培養(yǎng)液,后發(fā)現(xiàn)特別適合原代細(xì)胞培養(yǎng),尤其是較難培養(yǎng)的細(xì)胞生長。MeCoys 5A medium:一般以HamF12和DMEM按1:1混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液;在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加促貼壁物質(zhì)、促生長因子及激素、酶抑制劑、結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)
11、運(yùn)蛋白、微量元素等。無血清培養(yǎng)基:無血清培養(yǎng)基:均不含有動物蛋白;CDM培養(yǎng)基中添加了一些已知結(jié)構(gòu)和功能的小分子化合物,如短肽、植物激素等。無蛋白培養(yǎng)基無蛋白培養(yǎng)基 (protein free medium, PFM)限定化學(xué)成分培養(yǎng)基限定化學(xué)成分培養(yǎng)基 (chemical defined medium, CDM):1 1)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是首選,可查閱文)建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是首選,可查閱文獻(xiàn)或向賣家咨詢;獻(xiàn)或向賣家咨詢;2 2)本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基,許多培養(yǎng)基可適合于多種)本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基,許多培養(yǎng)基可適合于多種細(xì)胞;細(xì)胞;3 3)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要選擇培
12、養(yǎng)基;)根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要選擇培養(yǎng)基; 如小鼠細(xì)胞株多選如小鼠細(xì)胞株多選RPMI1640RPMI1640,進(jìn)行細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)染可選,進(jìn)行細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)染可選IMDMIMDM4 4)用多種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)目的細(xì)胞,根據(jù)其生長狀態(tài))用多種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)目的細(xì)胞,根據(jù)其生長狀態(tài)選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。1 1)認(rèn)真閱讀說明書;說明書中注明干粉中不包含的成分,)認(rèn)真閱讀說明書;說明書中注明干粉中不包含的成分,如如NaHCONaHCO3 3,谷氨酰胺、丙酮酸鈉、,谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPESHEPES等等2 2)配制時(shí)要保證充分溶解。)配制時(shí)要保證充分溶解。NaHCONaHCO3 3、谷氨酰胺等物質(zhì)
13、要在、谷氨酰胺等物質(zhì)要在培養(yǎng)基完全溶解后才能添加;培養(yǎng)基完全溶解后才能添加;3 3)配制所用的水為雙蒸水或三蒸水,離子濃度很低;)配制所用的水為雙蒸水或三蒸水,離子濃度很低;4 4)所用器皿應(yīng)潔凈無菌;)所用器皿應(yīng)潔凈無菌;5 5)配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾除菌,存于)配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過濾除菌,存于-20 -20 o oC C或或4 4 o oC C。維持液:維持液: RPMI-1640 95 小牛血清 2 谷氨酸胺(100) 1 雙抗(100) 1 用NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。生長液:生長液: RPMI-1640 88 小牛血清 10 谷氨酸胺(100) 1 雙抗(100) 1
14、用NaHCO3調(diào)pH至7.0-7.2。平衡鹽溶液平衡鹽溶液消化液消化液pHpH調(diào)整液調(diào)整液抗生素液抗生素液谷氨酰胺補(bǔ)充液谷氨酰胺補(bǔ)充液胰酶胰酶 (trypsin)溶液溶液一般濃度為0.1-0.5%,配制時(shí)用平衡鹽溶液,溶解的最佳pH是8-9,充分溶解后過濾除菌,可再調(diào)整pH至7.5或不調(diào)。EDTA溶液溶液一般濃度為0.02%,配制時(shí)加堿助溶,可過濾除菌,也可高壓滅菌。膠原酶溶液膠原酶溶液一般為0.1-0.3 mg/L或20萬U/L,最佳pH為6.5,膠原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制,配制時(shí)可用PBS。消化液胰蛋白酶液配制胰蛋白酶液配制青鏈霉素溶液青鏈霉素溶液 俗稱雙抗溶液,青霉素對G+
15、菌有效,使用終濃度為10萬U/L,鏈霉素對G-菌有效,使用終濃度為0.1g/L。一般配成100倍濃縮液,可用PBS或培養(yǎng)基配制??股匾?使用終濃度為2 mM。一般配成100倍濃縮液,配制時(shí)加溫至30 oC,充分溶解后過濾除菌,分裝后-20 oC儲存。谷氨酰胺補(bǔ)充液緩沖室緩沖室單間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖單間培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖專用培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖專用培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室布局示意圖普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)走廊普通細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)走廊寬敞的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)寬敞的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)常用培養(yǎng)器皿常用培養(yǎng)器皿玻璃培養(yǎng)器皿為主,一次性培養(yǎng)器皿為輔。玻璃器皿玻璃器皿 玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管和吸管、離心管、其它塑料器皿塑料器皿培養(yǎng)瓶、
16、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板、移液管、離心管、注射器、其它超凈工作臺超凈工作臺(clean bench)利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒,使空氣得到凈化。凈化空氣以微流方式徐徐通過工作臺面,使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。注意檢查是否堵塞?。淳凭珶簦┩饬魇?(基本不用)側(cè)流式 直流式 超凈工作臺結(jié)構(gòu)和模式圖超凈工作臺結(jié)構(gòu)和模式圖 生物安全柜生物安全柜nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ,5CO2,85%濕度。濕度。n使用使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題:意的問題:用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),需將瓶蓋微松,以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈,定期消毒(紫外線、酒
17、精)。箱內(nèi)水槽中加滅菌蒸餾水3 L以保持箱內(nèi)濕度,避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。學(xué)生正在進(jìn)行細(xì)胞觀察學(xué)生正在進(jìn)行細(xì)胞觀察倒置顯微鏡倒置顯微鏡 倒置顯微鏡倒置顯微鏡 用于烘干和干熱消毒玻璃器皿(用于烘干和干熱消毒玻璃器皿(160 ,2 h)。)。電熱干燥箱電熱干燥箱Zeiss濾器:過濾除菌,大多數(shù)培養(yǎng)用液,如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌自動雙重純水蒸餾器自動雙重純水蒸餾器 純水儀純水儀紫外線消毒。紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒表面消毒大容量高壓蒸汽滅菌器大容量高壓蒸汽滅菌器 全自動手提式滅菌器全自動手提式滅
18、菌器 移液器移液器細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)板精密精密pHpH計(jì)計(jì) 微孔板震蕩器微孔板震蕩器磁力攪拌器磁力攪拌器高速離心機(jī)高速離心機(jī) 超速離心機(jī)超速離心機(jī) 液氮罐液氮罐凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物,都應(yīng)視為污染。無無 毒毒:無毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。凡與細(xì)胞 直接或間接接觸的東西都必須是無毒的。無污染無污染不同細(xì)胞類型的交叉污染微生物的污染細(xì)菌霉菌支原體等空氣/器材/操作/血清/組織樣本污染途徑污染途徑真菌真菌感染 支原體污染污染 電鏡照片 細(xì)菌污染污染熒光染色法(33258)顯示染色體,細(xì)胞周圍亮點(diǎn)為支原體Giemsa染色法,附于胞質(zhì)上黑點(diǎn)為支原體掃描電鏡法顯示支原體,附
19、于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體重在預(yù)防,排除困難!重在預(yù)防,排除困難!根據(jù)建筑材料的差異選擇合理的消毒方法。每日(使用前)紫外照射(1-2 h),每周甲醛、乳酸或氧乙酸熏蒸(2 h)和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次。防止無菌室的污染。3.1 無菌室無菌室造成污造成污染的可能原因:染的可能原因:送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌進(jìn)入無菌室時(shí)使外界空氣直接對流進(jìn)無菌室的操作間在操作間開啟被污染的培養(yǎng)器皿或?qū)⑽廴疽后w、器物灑落在操作間無菌室有未被消毒的死角等。側(cè)流式、直流式:在凈化氣流與外界氣流的界面處無菌程度較低;外流式:氣流直接流向操作者。3.2 超凈臺超凈臺超凈臺的使用和保養(yǎng)超凈臺的使用和保養(yǎng):安
20、裝在無菌室內(nèi);臺面內(nèi)風(fēng)速不宜過大或過小;使用前開啟紫外燈照射15 min左右,然后讓超凈臺預(yù)工作10-15 min;使用完畢,用70%酒精擦拭臺面和臺內(nèi)四周;定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。1)玻璃器皿的清洗)玻璃器皿的清洗浸泡浸泡:清水浸泡,軟化和溶解附著物。新器皿用自來水簡單刷洗,然后5%鹽酸浸泡過夜;用過的器皿在用后應(yīng)立即浸入清水中;刷洗刷洗:將浸泡后的器皿放入洗滌劑(不能用含砂粒的洗衣粉)水中,用軟毛刷反復(fù)刷洗,然后洗凈洗滌劑,晾干。浸酸浸酸:將晾干的器皿浸泡到酸液中不少于6 h,應(yīng)充滿并完全覆蓋;取出時(shí)應(yīng)瀝干并將器皿放入合適容器運(yùn)輸。清洗清洗:手工清洗浸酸后的每件器皿都至少重復(fù)“灌滿-倒空
21、”15次以上,然后用蒸餾水浸洗2-3次,烘干后包裝。配制時(shí),操作者必須小心認(rèn)真,佩戴耐酸手套和防護(hù)眼鏡,嚴(yán)格按步驟進(jìn)行。1、按配方稱量重鉻酸鉀,完全溶入水中2、按配方把濃硫酸緩慢加入1液中,并邊加邊攪動3、自然冷卻,備用。新配制的酸液呈棕紅色,使用時(shí)間過久則變暗、發(fā)綠或渾濁原則1、酸倒入水中2、慢,有耐心(主要散熱,攪拌)3、沒必要在室外配制,最好附近有水源,萬一酸濺到身上要盡快沖洗。流水充分沖洗晾干浸酸(24 h)流水充分沖洗瀝水蒸餾水漂洗23次晾干備用流水充分沖洗晾干2% NaOH 浸泡過夜流水充分沖洗5%鹽酸溶液浸泡30 min流水充分沖洗瀝水蒸餾水漂洗23次75%酒精浸泡過夜晾干備用對細(xì)胞培養(yǎng)用品進(jìn)行消毒前要進(jìn)行嚴(yán)格包裝。1) 包裝包裝常用的包裝材料:牛皮紙、錫箔紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒
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