DC的制備方法

1、DC的制備方法發(fā)布時(shí)間：2015-12-0715:03點(diǎn)擊次數(shù)：665【背景】Step1Monoeyte7d加入1<1.血細(xì)第分離機(jī)或市訓(xùn)分量外段tlPBMC2.貼壁法歌得單犢鈾的3.加入6耳丈訐門00工000每瓢3d率*:摸液一次,并樸加GM-CSF和114加入腫抗原（50健/e”歲執(zhí)原肽何選步網(wǎng)TNF<iiOng/mOIL-6(1000U/mt)P<3E2(Ipc/mODC是DendriticCells的縮寫，中文全稱為樹突狀細(xì)胞，因其成熟時(shí)伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大籍科學(xué)家RalphM.Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，

2、是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞（AntigenPresentingCells,APC）。已證實(shí)，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細(xì)胞（Na?veTcells）增殖的APC,而其它種類的APC（如單核巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等）僅能刺激已活化的或記憶性的T細(xì)胞，因此DC是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用?！九囵B(yǎng)原理】因?yàn)镈C需從其它種類細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來，且可分為不同的成熟階段，所以通常分為養(yǎng)：2個(gè)步驟進(jìn)行培獲窖DC細(xì)胞Step1：從DC的祖細(xì)胞（如單核細(xì)胞）誘導(dǎo)分化為未成熟DC(immatureDC,iDC);Step2:從iDC誘導(dǎo)分化為成熟DC(matureDC,m

3、DC)Step1:GM-CSF（粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子）：GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落的形成，并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF是最早被鑒定出對(duì)DC培養(yǎng)有作用的細(xì)胞因子之一。GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面MHCII類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF也可促進(jìn)DC的存活。IL-4（白細(xì)胞介素-4）IL-4在由單核細(xì)月誘導(dǎo)成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細(xì)胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4,單核細(xì)胞將分化為巨噬

4、細(xì)胞。同時(shí)，IL-4還有降低細(xì)胞表面表達(dá)CD14分子的能力。CD14表達(dá)水平的降低是單核細(xì)胞分化為DC的重要標(biāo)志。GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟DC,此時(shí)的DC具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá)MHCI類、II類分子和B7家族分子（CD80,CD86等），但不表達(dá)或低表達(dá)CD14oStep2:TNF-a/IL10/IL-6（腫瘤壞死因子-a白細(xì)胞介素-10白細(xì)胞介素-6）TNF-%IL-10和IL-6均為促炎癥因子，在感染局部和腫瘤部位被誘導(dǎo)產(chǎn)生。體外研究表明，這3種細(xì)胞因子均可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)

5、MHCII類分子區(qū)室（classIIcompartment）消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面MHCI類、II類分子和B7家族分子（CD80,CD86等）的表達(dá)，使未成熟DC分化為成熟DC,此時(shí)DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可極強(qiáng)地激活T細(xì)胞。TNF-a/IL10/IL6三因子組合可在無牛血清培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)DC的完全成熟，從而制備出可以應(yīng)用于臨床的DC。PGE2（prostaglandinE2,前列腺素E2）PGE2也是炎性介質(zhì)，可由TNF-a,IL-1和LPS（脂多糖）等炎癥信號(hào)誘導(dǎo)產(chǎn)生。在TNF-a/IL10/IL6成熟誘導(dǎo)組合中添加PGE2,可進(jìn)一步提高DC的產(chǎn)量、成熟

6、度、遷移能力和免疫激活能力?！咀⒁馐马?xiàng)】1. DC的來源：DC有多種來源，包括外周血單核細(xì)胞(Monocyte)、臍帶血CD34+細(xì)胞、骨髓和胎肝等，但因外周血單核細(xì)胞最容易獲取、數(shù)量也最多，所以臨床上被廣泛用作DC的來源細(xì)胞。2. DC的成熟度：我們知道，DC有未成熟和成熟兩種狀態(tài)，即iDC和mDC,而DC的抗原遞呈能力與其成熟狀態(tài)密切相關(guān)。iDC的抗原攝取和加工能力較強(qiáng)，但抗原遞呈能力很弱。在體外培養(yǎng)時(shí)，iDC去除細(xì)胞因子(即GM-CSF和IL-4)后，會(huì)逆轉(zhuǎn)為巨噬細(xì)胞，且即使在細(xì)胞因子的維持下，未成熟DC的功能也不是激活T細(xì)胞，而是抑制T細(xì)胞的增殖。mDC則正好相反，其抗原攝取和加工能力

7、很弱，但具有很強(qiáng)的抗原遞呈能力。因而可以激活T細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)。而且DC成熟后即使在培養(yǎng)體系中去除細(xì)胞因子，仍能保持DC的狀態(tài)和功能，不會(huì)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。因此可以看出，DC必須完全成熟后才能用于免疫治療。3. DC的無牛血清培養(yǎng)：不能將iDC誘導(dǎo)成為mDC,或僅能誘導(dǎo)一小部分iDC成為mDC。aC最初都是在含有小牛血清(FetalCalfSerum,FCS)的培養(yǎng)體系中獲得的，但我們知道，如果想將DC應(yīng)用于臨床治療，則不能使用FCS。然而如果不用FCS,DC則無法培養(yǎng)成功?？茖W(xué)家最先想到的是用10%的人自體血漿來替代10%的FCS,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人單核細(xì)胞在含10%人自體血漿的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用G

8、M-CSF和IL-4誘導(dǎo)7天后，大多數(shù)單核細(xì)胞仍貼壁，半懸浮的iDC數(shù)量非常少。后來經(jīng)過不斷摸索發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中添加1%人自體血清對(duì)于從單核細(xì)胞誘導(dǎo)成為iDC效果最好。更為困難的步驟是如何在無牛血清培養(yǎng)體系中將iDC誘導(dǎo)成為mDCoTNF-a和IL-10在含牛血清培養(yǎng)體系中均是很好的DC成熟誘導(dǎo)劑，而在無牛血清培養(yǎng)體系中，兩者均無效或效果微弱，即在無牛血清清培養(yǎng)體系，TNF-a和IL-1后來的研究表明，用單核細(xì)胞條件培養(yǎng)基(Monocyte-conditionedmedium,MCM),即單核細(xì)胞在包被有免疫球蛋白的細(xì)菌平皿上無牛血清培養(yǎng)24小時(shí)后得到的培養(yǎng)上清，可在無牛血清培養(yǎng)體系中誘

9、導(dǎo)DC的完全成熟。因此認(rèn)為，1%人自體血漿+MCM可能成為臨床上獲得成熟DC的標(biāo)準(zhǔn)方法。但每次制備的MCM的一致性很難保證，導(dǎo)致每批MCM必須經(jīng)過測試后才能確定最適用量，這給臨床應(yīng)用帶來阻力和不穩(wěn)定性。所以，人們一直想尋找到能夠替代MCM的化學(xué)成分明確的成熟誘導(dǎo)組合。1997年，德國美因茨大學(xué)(MainzUniversity)的Jonuleit等取得了突破性進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)TNF-a,IL-10和IL-6三種細(xì)胞因子的組合可完全替代MCM,在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)DC誘導(dǎo)成完全成熟的DC。4. PGE2與DC:德國美因茨大學(xué)的Jonuleit在證明TNF-a,IL-10和IL-6三種促炎癥因

10、子的組合可完全替代MCM,在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)DC完全誘導(dǎo)成熟的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)另一種炎癥介質(zhì)，即PGE2可進(jìn)一步提高DC的產(chǎn)量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力，也就是說在TNF-a,IL-10和IL-6之外添加PGE2可獲得更為成熟和高效的DC,這樣會(huì)提高臨床上DC的治療效果。PGE2常被加入DC成熟誘導(dǎo)組合中最重要的原因是其可提高成熟DC的遷移能力，這樣可使DC更容易到達(dá)淋巴結(jié)，從而引起免疫反應(yīng)、治療腫瘤。但我們也應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：1)PGE2不能添加到DC誘導(dǎo)分化的Step1中，如加入，DC的分化將會(huì)被抑制；2)我們知道，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1反應(yīng)的DC(很多文獻(xiàn)中稱為DC1)有助于多

11、種腫瘤，如黑色瘤和惡性膠質(zhì)瘤等的治療。實(shí)驗(yàn)研究表明，在成熟誘導(dǎo)因子(TNF-a/IL10)中力口入PGE2傾向于將iDC誘導(dǎo)成為成熟的DC2,而非DC1,該DC會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生Th2反應(yīng)。所以很多人在試圖尋找能夠誘導(dǎo)DC1的最佳成熟誘導(dǎo)組合，如TNF-a/IL10/IFN-a/IFN丫/polyI:C,TNF-a/IL10/IFN丫/PGE2低濃度)/R848(TLR7/8激動(dòng)劑)和IFN-丫/LPS序貫組合等，但這些新組合都未得到臨床上的充分驗(yàn)證，也就沒有真正用于臨床級(jí)別DC的制備。3)其實(shí)，各家的研究結(jié)果不盡相同。比如，TNF-a/IL10/IL6/PGE2組合的創(chuàng)立者一德國美因茨大學(xué)的Jonu

12、leit在研究時(shí)就發(fā)現(xiàn)，添加PGE2誘導(dǎo)成熟的DC在刺激T細(xì)胞時(shí)可顯著提高其分泌的IFN-t產(chǎn)量，而對(duì)IL-4和IL-10的分泌無影響，提示添加PGE2誘導(dǎo)成熟的DC具有誘導(dǎo)Th1反應(yīng)的傾向?？傊?，培養(yǎng)體系中是否加入小牛血清，以及所使用的無血清培養(yǎng)基種類不同等諸多因素都可能導(dǎo)致添加PGE2誘導(dǎo)成熟的DC在性質(zhì)上的差異，因此臨床上制備DC時(shí)最好能夠做充分的前期研究，然后確定用于治療某種腫瘤最好的制備方法。DC的制備】1 .外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集1.1 用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞80-100ml;1.2 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)o1.3 無血清

13、培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC,細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到1-3x108。2 .(可選步驟)腫瘤抗原的制備用于負(fù)載DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-SpecificAntigens,TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-AssociatedAntigens,TAA),也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。用TSA或TAA負(fù)載的DC具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全細(xì)胞抗原負(fù)載DC可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r(shí)無需知道哪些抗原是腫瘤細(xì)胞的TSA或TAA,而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同

14、抗原決定簇的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)克隆，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載DC的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC、用凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載DC,用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載DC,和將腫瘤細(xì)胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載DC,因該方法簡單、快速、有效。反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：2.1 手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；2.2 無菌生理鹽水洗3次；2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI1640培養(yǎng)基，充分研磨；2.4 200目無菌網(wǎng)過濾后收集單細(xì)胞懸液；2.5 用R

15、PMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至1-2x107/ml,裝入5ml無菌凍存管中；2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10min后取出，再迅速放入37oC水浴中解凍10min。反復(fù)3-5次；注：也可以-80oC/37oC反復(fù)凍融3-5次。2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm,離心10min;明.8收集上清，0.22m濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體;2.9 -80oC保存?zhèn)溆谩? .DC細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定3.1 步驟1中獲得的PBMC用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2x106/ml,置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；3.2 37C,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h,以使單核細(xì)胞貼壁；3.3 洗去懸浮細(xì)胞，

16、在貼壁細(xì)胞中加入含重組人GM-CSF(500-1,000U/ml)和重組人IL-4(500U/ml)的無血清培養(yǎng)液，37C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化；3.4 每2-3d半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；3.5 (可選步驟)在培養(yǎng)的第5d,加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50vg/mJ對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載；注：若不對(duì)DC進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。3.6 在培養(yǎng)的第6d,加入重組人TNF-a(10ng/ml),IL-1010ng/ml),IL-6(1000U/ml)和PGE2(1gg/ml),誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；6.3.7 在培養(yǎng)的第7d或第8d,收獲DC細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1X10個(gè)以上

17、；3.8 DC的質(zhì)檢：3.8.1 活細(xì)胞比例：臺(tái)盼藍(lán)染色驗(yàn)證活細(xì)胞應(yīng)在90%以上；3.8.2 形態(tài)學(xué)觀察：90%細(xì)胞半懸浮，細(xì)胞有多個(gè)樹突樣突起；3.8.3 細(xì)胞表型分析(見下圖)：流式細(xì)胞術(shù)檢測DC細(xì)胞表面CD14、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等分子的表達(dá)，成熟的DC不表達(dá)CD14,而高表達(dá)其他分子。CD83是成熟DC的特異性標(biāo)志，在單核細(xì)胞和不成熟DC表面不表達(dá)或低表達(dá)。3.8.4 無菌檢測：收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，均應(yīng)為陰性；標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素0.53.8.5 內(nèi)毒素檢測：收獲細(xì)胞前取少量培養(yǎng)物，回輸前，用邕試劑檢測內(nèi)毒素含量,E

18、U/ml。CD14COBOL注f空心*%:型可照，實(shí)心通為相應(yīng)抗體物色.DC培養(yǎng)試劑推薦】生產(chǎn)商產(chǎn)品名稱產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品規(guī)格使用濃度PeproTech重組人GM-CSF(AnimalFree)AF-300-035mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg50-100ng/mlPeproTech重組人IL-4(AnimalFree)AF-200-045mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg100ng/mlPeproTech重組人TNF-a(AnimalFree)AF-300-01A10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg1

19、0ng/mlPeproTech重組人IL1-b(AnimalFree)AF-200-01B2mg/10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg10ng/mlPeproTech重組人IL-6(AnimalFree)AF-200-065mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg100ng/mlPeproTech(BioGems)PGE2（前列腺素E2）363246410mg/50mg1mg/ml注：AnimalFree意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛的病原體和蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任

20、何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體（如瘋牛病，克雅氏病等）的污染及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中最好使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子。DC鑒定試劑推薦】生產(chǎn)商產(chǎn)品名稱產(chǎn)品編號(hào)克隆號(hào)熒光標(biāo)記產(chǎn)品規(guī)格PeproTech(BioGems)抗人CD14熒光標(biāo)記抗體621161D3FITC/PE/APC/PerCP-Cy5.525tests/100test抗人CD40熒光標(biāo)記抗體25115C3FITC/APC25tests/100test抗人CD80熒光標(biāo)記抗體29112D10.4FITC/PE25tests/100test抗人CD83熒光標(biāo)記抗體5911HB15eFI

21、TC/PE25tests/100test抗人CD86熒光標(biāo)記抗體8911IT2.2PE25tests/100test抗人HLA-DR熒光標(biāo)記抗體74111LN3FITC/PE/APC/PerCP-Cy5.525tests/100test注：用于DC鑒定的表面標(biāo)志物的表達(dá)在流式圖上均呈現(xiàn)單個(gè)峰，且多數(shù)情況下不能與陰性峰完全區(qū)分開來。為避免多色分析時(shí)補(bǔ)償調(diào)節(jié)不好導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確性，建議最好用單標(biāo)，最多用雙標(biāo)來做DC表面標(biāo)志的分析，而且必須使用同型對(duì)照，而非空白細(xì)胞對(duì)照來排除背景染色?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 SteinmanRM,CohnZA.Identificationofanovelcelltypeinperipherallymphoidorgansofmice.I.Morphology,quantitation,tissuedistribution.J.Exp.Med.1973;137(5):1142-62.2 BenderA,SappM,et.al.Improvedmethodsforthegenerationofdendriticcellsfromnonproliferatingprogenitorsinhumanblood.JImmunolMeth