東北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課程教學(xué)大綱

1、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課程教學(xué)大綱課程名稱：基礎(chǔ)植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)英文名稱：BasicPlantMolecularBiotechnology一、理論課程（或?qū)嶒?yàn)課程）課號(hào)：01610026x適用專業(yè)：農(nóng)學(xué)，農(nóng)學(xué)（農(nóng)產(chǎn)品），農(nóng)學(xué)（種子）理論課程總學(xué)時(shí)：0實(shí)驗(yàn)總學(xué)時(shí)（周學(xué)時(shí)）：16學(xué)分：0.5開(kāi)出實(shí)驗(yàn)個(gè)數(shù)：（驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一個(gè)；綜合實(shí)驗(yàn)2個(gè);設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)一個(gè)；創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)個(gè)）應(yīng)開(kāi)實(shí)驗(yàn)學(xué)期：第七學(xué)期二、實(shí)驗(yàn)課程簡(jiǎn)介基礎(chǔ)植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容附屬于基礎(chǔ)植物分子生物技術(shù)課程。旨在讓學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)，一方面進(jìn)一步印證、鞏固和豐富課堂的理論教學(xué)內(nèi)容，另一方面加強(qiáng)學(xué)生動(dòng)手操作能力，促進(jìn)理論聯(lián)系實(shí)際，對(duì)生物技術(shù)的應(yīng)用有較深刻的體

2、會(huì)。本實(shí)驗(yàn)課程共安排2次實(shí)驗(yàn)，均為綜合性實(shí)驗(yàn)。三、實(shí)驗(yàn)教學(xué)目標(biāo)及基本要求通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生了解分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本原理，能掌握生物技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)，并完成質(zhì)粒DNA提取，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法等基本實(shí)踐環(huán)節(jié)的工作任務(wù)；能利用相關(guān)知識(shí)解決分子生物學(xué)中出現(xiàn)問(wèn)題，對(duì)植物生理生化的特性有進(jìn)一步的了解。四、教材及主要參考書（2000年后出版的書籍）1教材：肖尊安.植物生物技術(shù).化工出版社，2005.2主要參考書：王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程.科學(xué)出版社，2002.胡松年，薛慶中.基因組數(shù)據(jù)分析手冊(cè).浙江大學(xué)出版社，2003.F.M.奧斯伯等.精編分子生物學(xué)（第四版）.科學(xué)出版社，2005.J

3、oeSambrook,DavidRussell.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（黃培堂等譯）.科學(xué)出版社，2002.享B堯君.蛋白質(zhì)電泳技術(shù)（第二版）.科學(xué)出版社，2005.五、考核辦法完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告程度。大綱主撰人：韓英鵬（一）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目1感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1 .實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)類型：專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)類別：綜合計(jì)劃學(xué)時(shí)：8學(xué)時(shí)每組人數(shù)：5人首開(kāi)日期：2 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求2.1 目的：學(xué)習(xí)感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化的方法。2.2 要求：通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，加深對(duì)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)基礎(chǔ)理論、基本知識(shí)的理解，培養(yǎng)學(xué)生理論與實(shí)踐相結(jié)合的能力，使學(xué)生獲得運(yùn)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)原理進(jìn)行對(duì)植物的基本實(shí)驗(yàn)技能和綜合運(yùn)用所學(xué)

4、知識(shí)分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。3 .主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號(hào)規(guī)格1隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱2分光光度計(jì)2102型3高速冷凍離心機(jī)Backman64R型4常溫圖速離心機(jī):Eppendorf5417C5電熱恒溫水浴鍋6恒溫振蕩器7三洋制冰機(jī)SIM-F124型8超凈工作臺(tái)4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)變效率。目前PUC19對(duì)E.Coli,DH5a或JM109菌株的轉(zhuǎn)化，已達(dá)到105107轉(zhuǎn)化子/mgDNA（最高可達(dá)108轉(zhuǎn)化子）。轉(zhuǎn)化效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)。DNA分子轉(zhuǎn)化的過(guò)程如下：1.1 吸附：完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面。1.2 轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分

5、子解鏈，單鏈DNA進(jìn)入受體菌，另一鏈降解。1.3 自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鑲環(huán)狀DNA。1.4 表達(dá)：供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯。對(duì)DNA分子來(lái)說(shuō)，成功轉(zhuǎn)化的比率極小，僅占DNA分子的0.01%。5 .實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)5.1 全過(guò)程必須無(wú)菌操作5.2 為達(dá)到高效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)務(wù)必少于108個(gè)/ml,這相當(dāng)于OD=0.4。6 .注意事項(xiàng)6.1 連接后的DNA溶液與細(xì)胞混合后，一定要在冰浴條件下操作，如果溫度時(shí)高時(shí)低，轉(zhuǎn)化效率將極差。6.2 DNA連接液的鹽濃度較高，與細(xì)胞混合時(shí)要加以稀釋，因?yàn)楦啕}濃度會(huì)影響轉(zhuǎn)化率。6.3 所有的菌液涂皿操作，只需一根玻璃涂布棒，用95

6、%酒精在火焰下滅菌冷卻后即可用。注意避免反復(fù)來(lái)回涂布，因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)胞的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。(二)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目2蛋白質(zhì)含量測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)G-250法1 .實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)類型：專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)類別：綜合計(jì)劃學(xué)時(shí)：8學(xué)時(shí)每組人數(shù)：5人首開(kāi)日期：2 .實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求2.1 目的：學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2.2 要求：通過(guò)本課程的學(xué)習(xí)，加深基礎(chǔ)理論、基本知識(shí)的理解，培養(yǎng)學(xué)生理論與實(shí)踐相結(jié)合的能力，使學(xué)生獲得運(yùn)用農(nóng)業(yè)生物技術(shù)原理進(jìn)行對(duì)植物的基本實(shí)驗(yàn)技能和綜合運(yùn)用所學(xué)知識(shí)分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。3 .主要儀器設(shè)備廳P主要儀器設(shè)備名稱型號(hào)規(guī)格

7、1分光光度計(jì)2102型2高速冷凍離心機(jī)Backman64R型3常溫圖速離心機(jī)Eppendorf5417C4穩(wěn)壓電泳儀0500V,0300mA5萬(wàn)分之一梅特勒分天平4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容提要考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm,后者在595nm。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)(01000Ng/ml),蛋白質(zhì)一色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。蛋白質(zhì)和考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定；該反應(yīng)非常靈敏，可測(cè)微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。5 .實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)5.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取100ml牛血清白蛋白，溶于100ml蒸儲(chǔ)水中，即為1000Ng/ml的原液。5.2 考馬斯亮蘭G-250蛋白試劑的配制，稱取100mg考馬斯亮蘭G-250,溶于50m