2020腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1、2020腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法研究進(jìn)展腫瘤具有高死亡率、高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率,是危害人類健康的重大疾病。診斷腫瘤的傳統(tǒng)方法有病理組織活檢、核磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computedtomography,CT)、B超、X線胸片、內(nèi)鏡檢查等。這些檢查對(duì)于腫瘤早期的檢測(cè)效果十分有限，部分檢測(cè)方法不僅價(jià)格昂貴,且會(huì)給患者帶來痛苦。因此,在腫瘤早期階段開展快速、有效的檢測(cè)十分必要,不僅可以達(dá)到早發(fā)現(xiàn)、早治療的目的,還可以改善患者就醫(yī)體驗(yàn)。腫瘤標(biāo)志物的篩檢對(duì)于腫瘤早期檢測(cè)具有重要意義1。腫瘤標(biāo)志物是指由腫瘤組織或宿主與腫瘤相互作用所產(chǎn)生的一類活

2、性物質(zhì),能夠提示腫瘤存在與生長(zhǎng)變化。腫瘤標(biāo)志物常常存在于血清、細(xì)胞、尿液、體液或組織中,常見的有癌胚蛋白、腫瘤抗原、酶類標(biāo)志物、激素、糖類抗原等。腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有操作便捷、標(biāo)本易獲取、非侵入性、價(jià)格低廉、易于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病等優(yōu)點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的預(yù)防、早期診斷與鑒別診斷、輔助腫瘤分類、疾病監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)治療和預(yù)后判斷有重要作用,可有效彌補(bǔ)其他醫(yī)學(xué)技術(shù)對(duì)腫瘤診斷、治療及預(yù)后判斷的不足2。腫瘤標(biāo)志物種類繁多,檢測(cè)方法也各異,本文將幾種常見腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法的研究進(jìn)展作一綜述。1 放射免疫分析放射免疫分析是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法,是將放射性核素檢測(cè)技術(shù)與抗原抗體結(jié)合特異性的特點(diǎn)相結(jié)合,

3、以定量微量物質(zhì)。放射免疫分析多使用放射性核素1251,因其具有放射性高、易標(biāo)記、衰變過程中釋放的射線易于被檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，逐漸替代了3H和14C而被廣泛使用。放射性核素標(biāo)記具有高靈敏度、易于商品化等優(yōu)勢(shì),曾被廣泛應(yīng)用,但與其他方法3相比,存在試劑盒使用壽命短、有放射性污染風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn),目前已逐漸被其他檢測(cè)方法取代。2 化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析是目前常用和較為成熟的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù),其利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為標(biāo)記物,根據(jù)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度來判斷待測(cè)物質(zhì)的量。自1928年德國(guó)化學(xué)家Albrecht發(fā)現(xiàn)魯米諾的化學(xué)發(fā)光特性后，該檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度高、快速、線性范圍廣、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適合小型化、無(wú)放射性危

4、害等優(yōu)點(diǎn)得到不斷發(fā)展4,5?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析為化學(xué)發(fā)光法,使用直接發(fā)光物質(zhì)（如吖啶酯）標(biāo)記抗體,或使用酶類催化劑（如辣根過氧化物酶）6標(biāo)記抗原抗體。將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與微芯片電泳化學(xué)發(fā)光（microchip-electrophoresischemiluminescenee,MCE-CL）等技術(shù)聯(lián)合使用,具有效率高、分析快、自動(dòng)化程度高、需要更少樣品和試劑的優(yōu)點(diǎn)7,8。傳統(tǒng)化學(xué)免疫分析采用酶標(biāo)技術(shù),用辣根過氧化物酶催化魯米諾的免疫測(cè)定技術(shù)曾被廣泛使用,目前的免疫測(cè)定系統(tǒng)通常使用信號(hào)探針標(biāo)記抗體并進(jìn)一步測(cè)量目標(biāo)分析物濃度。但這類天然酶具有穩(wěn)定性差、來源有限、對(duì)環(huán)境變化敏感、易受環(huán)境影響而變性等缺點(diǎn),且

5、標(biāo)記過程通常會(huì)損害抗體分子的生物活性,因而基于金屬及金屬?gòu)?fù)合物9,10、磁性納米顆粒11、量子點(diǎn)12等催化發(fā)光底物的無(wú)酶免疫系統(tǒng)13不斷發(fā)展,將電化學(xué)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物,兼具了化學(xué)發(fā)光的高靈敏度和電化學(xué)的時(shí)間、空間可控性14,15的優(yōu)點(diǎn)。有研究人員以CuS納米粒子作為過氧化物酶模擬物，設(shè)計(jì)了一種新型的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光(chemiluminescenee,CL)免疫方法測(cè)定甲胎蛋白，與基于酶標(biāo)的CL免疫測(cè)定法相比，提出的無(wú)標(biāo)記測(cè)定模式更簡(jiǎn)單、價(jià)廉、快速。采用無(wú)標(biāo)記的CL免疫測(cè)定法測(cè)定甲胎蛋白的線性范圍為0.160ng/mL,檢出限為0.07ng/mL,且此CL免疫測(cè)定系統(tǒng)顯示出良好

6、的特異性、可接受的重復(fù)性和良好的準(zhǔn)確性16。3 酶聯(lián)免疫吸附試酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一項(xiàng)臨床上已普及的檢測(cè)技術(shù),這一技術(shù)將抗原或抗體包被于固相支持物上,將酶標(biāo)抗原或抗體加入抗原抗體復(fù)合物中,通過底物使酶顯色來達(dá)到檢測(cè)目的。不同的研究人員會(huì)采用不同的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)策略,如使用單克隆多克隆抗體17及嵌合抗體18來開發(fā)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)被開發(fā)后其檢測(cè)系統(tǒng)得到不同的優(yōu)化,如凝集素及生物素-親和素系統(tǒng)19在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中的應(yīng)用大大增強(qiáng)了其檢測(cè)的敏感性,熒光素酶夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)系統(tǒng)20也使檢測(cè)的敏感性不斷增強(qiáng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)不僅適用于對(duì)單一分析物的測(cè)定,在多個(gè)分析物同時(shí)存在時(shí),

7、同樣具有良好的適用性21。除酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)外,越來越多的研究集中于開發(fā)具有酶樣活性的模擬酶22。ZHANG等23以Cu2+作為助催化劑，利用Cu2+/Ag-Agl復(fù)合物作為催化劑具有在可見光下使3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(3,3，5,5-tetramethylbenzidine,TMB)顏色產(chǎn)生變化的特性，構(gòu)建了夾心型比色法,通過監(jiān)測(cè)TMB溶液的顏色變化以定量癌胚抗原的水平，其開發(fā)的比色免疫測(cè)定在血清樣品分析中表現(xiàn)出良好的選擇性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。4 免疫傳感器免疫傳感器一直備受腫瘤研究者關(guān)注和青睞。將特異性免疫反應(yīng)與生物傳感技術(shù)相結(jié)合形成的生物傳感器,其生物識(shí)別部分來自抗原與抗體的特異性識(shí)

8、別和結(jié)合作用,通過理化換能器和信號(hào)放大裝置將生物信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)用于檢測(cè)。與其他幾種檢測(cè)方法相比,免疫傳感器具有靈敏度高、操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。目前,免疫傳感器大部分處于試驗(yàn)階段,正向高通量、商品化發(fā)展,以滿足臨床大樣本檢測(cè)的要求,隨著技術(shù)的不斷成熟,有望成為腫瘤標(biāo)志物的新型檢測(cè)手段。金屬納米材料由于擁有獨(dú)特的光學(xué)、電子和催化特性常被用于構(gòu)建免疫傳感器24,25。LIU等26使用多孔鉑納米顆粒和PdPt納米籠同時(shí)測(cè)定腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原和甲胎蛋白,利用多孔鉑納米顆粒較大的表面積和較強(qiáng)的導(dǎo)電性PdPt納米籠優(yōu)異的催化性能及高負(fù)載能力，增強(qiáng)和放大響應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)雙重

9、分析物的靈敏測(cè)定。另外,使用納米合金材料制作的傳感器,與使用單一金屬材料相比具有更好的生物相容性,金屬之間良好的協(xié)同作用使傳感器催化性能進(jìn)一步被放大。ZHANG等27使用PdPt納米顆粒，以石墨烯片和多壁碳納米管作為傳感平臺(tái),組成納米復(fù)合物修飾電極,來測(cè)定腫瘤標(biāo)志物潛伏膜蛋白-1,比單獨(dú)使用Pd納米粒子具有更高的過氧化物酶活性,PdPt凹面不僅可以提供較大的表面積,還可以提供更豐富的催化反應(yīng)活性位點(diǎn)。碳納米材料,包括單壁碳納米管、多壁碳納米管、石墨烯、碳納米纖維、碳球等,由于其良好的力學(xué)性能、較高的化學(xué)穩(wěn)定性、特殊的電學(xué)性質(zhì)、優(yōu)異的機(jī)械性能和良好的導(dǎo)熱性被廣泛用于免疫傳感器的制造,制造的傳感器

10、具有響應(yīng)速度快、電子傳遞速率高、負(fù)載量大、吸附性好、催化活性等優(yōu)點(diǎn)。LIANG等28研制了以雙層酶修飾碳納米管作為標(biāo)記的夾心型免疫傳感器，利用層層自組裝技術(shù)將辣根過氧化物酶裝配到多壁碳納米管上,實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大,為臨床分析的超靈敏檢測(cè)提供了有力的支持。聚合物復(fù)合材料由于良好的氧化還原性能,被作為免疫傳感器信號(hào)指示劑29,30。TANG等31用聚多巴胺-PB2+(PDA-Pb2+)納米復(fù)合材料作為氧化還原體系,用殼聚糖-金納米復(fù)合材料涂覆電極,對(duì)癌胚抗原進(jìn)行敏感性的電流分析。利用聚合物復(fù)合材料制作的免疫傳感器,因聚合物復(fù)合材料摻雜帶來的半導(dǎo)體或?qū)w性質(zhì),其活性可被調(diào)節(jié),摻雜/去摻雜的可逆過程使其可

11、檢測(cè)不同的分析對(duì)象,擴(kuò)大了檢測(cè)范圍。免疫傳感器的制備除上述幾種材料外,還常引入其他具有不同功能的材料來提高性能。如利用量子點(diǎn)高表面活性、小尺寸及對(duì)光、電、溫度等敏感的特性,構(gòu)建的傳感器靈敏度較高32,33;利用磁性納米粒子的磁效應(yīng)構(gòu)建的傳感器抗干擾性好34;利用介孔材料良好的孔隙結(jié)構(gòu)和界面結(jié)構(gòu)構(gòu)建的傳感器,能夠保持酶良好的活性和功能性;利用水凝膠構(gòu)建的傳感器穩(wěn)定性好,水溶性高,能夠?qū)ν饨绱碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)變化35。此外,利用羥基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)納米顆粒利用HAP-NPs與鉬酸鹽的反應(yīng)檢測(cè)甲胎蛋白,構(gòu)建的傳感器選擇性好、靈敏度高,且成本低36。5 蛋白組學(xué)蛋白組

12、學(xué)是近年來興起的腫瘤研究領(lǐng)域熱點(diǎn)之一,以蛋白質(zhì)為核心,對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式進(jìn)行研究。蛋白組學(xué)技術(shù)具有高通量、微型化、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì),目前被廣泛用于臨床腫瘤學(xué)研究,為腫瘤標(biāo)志物的研究提供了良好的平臺(tái),但同時(shí)具有檢測(cè)成本昂貴、對(duì)技術(shù)人員操作要求高等缺點(diǎn)。5.1 雙向電泳雙向電泳是蛋白組學(xué)的經(jīng)典技術(shù),是利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和不同相對(duì)分子質(zhì)量來分離蛋白質(zhì)的一門技術(shù)。雙向電泳是蛋白組學(xué)的核心技術(shù)之一,能夠通過染色強(qiáng)度得到蛋白質(zhì)翻譯后修飾的信息,能夠同時(shí)分離數(shù)千種蛋白質(zhì)。但其有不能分辨低拷貝數(shù)蛋白、檢測(cè)蛋白比估計(jì)總蛋白數(shù)少、耗時(shí)長(zhǎng)、操作過程繁瑣等缺點(diǎn),不能實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化,研究者常將其與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用以分

13、離、鑒定蛋白質(zhì)37,即將蛋白質(zhì)用雙向電泳分離后,運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行逐一鑒定,這也成為蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)。相差凝膠電泳在雙向電泳的基礎(chǔ)上利用不同的染色對(duì)2個(gè)樣本進(jìn)行標(biāo)記,通量更高,提高了凝膠間的可比性,工作效率得到提升。5.2 質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是將物質(zhì)離子化,根據(jù)不同質(zhì)荷比進(jìn)行時(shí)間和空間的分離,進(jìn)而獲得樣品的相對(duì)分子質(zhì)量、分子結(jié)構(gòu)等多種信息的分析方法。由于其具有高分辨力、高精度等特點(diǎn)被廣泛用于多個(gè)領(lǐng)域。近年來,常用色譜-質(zhì)譜技術(shù),因其兼具了色譜的分離能力和質(zhì)譜的鑒定能力,能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的分析和定量39,40?；|(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜是經(jīng)過改進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù),前者利用

14、基質(zhì)吸收激光的能量,得到肽質(zhì)量指紋譜,通過檢索數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定蛋白質(zhì);后者利用電噴霧法,液相化多肽以鑒定蛋白質(zhì)。這2種方法能保證電離時(shí)樣品分子的完整性,不會(huì)使離子碎片化。5.3 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片是近十年來新興的分析技術(shù),即在支持物表面排列蛋白質(zhì)探針以捕獲目標(biāo)蛋白,再通過檢測(cè)器進(jìn)行定性或定量分析。根據(jù)載體性質(zhì)不同,可分為固相蛋白質(zhì)芯片和液相蛋白質(zhì)芯片,臨床上常用來篩選和尋找腫瘤標(biāo)志物。反相蛋白質(zhì)芯片也是蛋白組學(xué)高通量方法41。蛋白質(zhì)芯片不僅可用來研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用,還可研究蛋白質(zhì)與核苷酸間的相互作用，具有通量高、速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。DUAN等42設(shè)計(jì)了一種蛋白質(zhì)芯片，使用膠體納

15、米金標(biāo)記葡萄球菌屬蛋白A作為指標(biāo)，應(yīng)用免疫金銀染色增強(qiáng)技術(shù)擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào),此蛋白質(zhì)芯片可在不存在交叉反應(yīng)的情況下檢測(cè)乙型肝炎病毒抗體和丙型肝炎病毒抗體，并可在40min內(nèi)提供結(jié)果，速度相對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法更快。YANG等43開發(fā)了一種微陣列芯片，首次使用硅和水凝膠作為微陣列的載體,構(gòu)成的芯片具有二氧化硅和水凝膠兩者的優(yōu)點(diǎn)。5.4 表面增強(qiáng)激光解析及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜表面增強(qiáng)激光解析及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是將質(zhì)譜與蛋白質(zhì)分離技術(shù)相結(jié)合的技術(shù),能夠檢測(cè)到其他傳統(tǒng)方法檢測(cè)不到的蛋白質(zhì),只需少量樣品,檢測(cè)時(shí)間短且重復(fù)性高,可分析復(fù)雜樣品。該技術(shù)基于特殊芯片的表明增強(qiáng)吸附作用,將樣品蛋白質(zhì)吸附到芯片上后,

16、將結(jié)合蛋白質(zhì)解離成核電離子以繪制質(zhì)譜圖。將健康人與腫瘤患者的蛋白圖譜進(jìn)行比較,能夠發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。JIN等44開發(fā)了一種對(duì)糖類抗原19-9正常的胰腺癌患者與健康或良性個(gè)體進(jìn)行診斷和鑒別診斷的方法，使用與CM10芯片聯(lián)合的表面增強(qiáng)激光解吸及電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析相關(guān)樣品,生成了具有不同蛋白質(zhì)的診斷模型。6 分子生物學(xué)方法檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的分子生物學(xué)方法包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(fluoresceneeinsituhybridization,FISH)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandeonformati

17、onpolymorphism,SSCP)、多種測(cè)序技術(shù)等。分子生物學(xué)技術(shù)具有高通量，特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢(shì),但也存在價(jià)格昂貴、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。PCR是目前被廣泛使用的一種簡(jiǎn)單、敏感、高效、特異和快速的，能在體外擴(kuò)增DNA的技術(shù)。由經(jīng)典PCR衍生出的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)如逆轉(zhuǎn)錄PCR被用于口咽癌45、結(jié)直腸癌46、前列腺癌47、肺癌48等多種腫瘤的檢測(cè)。甲基化特異性PCR是一種檢測(cè)特異位點(diǎn)甲基化的技術(shù)49,檢測(cè)DNA甲基化敏感性極高,KOIKE等50發(fā)現(xiàn)甲基化特異性PCR對(duì)于胃癌標(biāo)志物的檢出率高于逆轉(zhuǎn)錄PCR。此外，多種PCR衍生技術(shù)如擴(kuò)增融合PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等也被運(yùn)用

18、于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。FISH以標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理，將標(biāo)記的探針與單鏈核酸片段配對(duì)，在熒光顯微鏡下觀察目標(biāo)序列的分布。FISH雖屬于低通量檢測(cè),但目前已被用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞51、突變?nèi)旧w52、染色體重排53,在腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)和個(gè)體化醫(yī)療方面具有重要意義。7 液體活檢液體活檢是一種從血液等非實(shí)性樣本中取樣,用于診斷和檢測(cè)腫瘤的方法。液體活檢技術(shù)主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell,CTC)檢測(cè)、循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)檢測(cè)、外泌體檢測(cè)等。與組織活檢相比,液體活檢能夠早期篩查、檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物,克服了腫瘤的時(shí)空異質(zhì)性,具有無(wú)創(chuàng)、易反復(fù)取樣、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也有價(jià)格昂貴、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等缺點(diǎn)。CTC檢測(cè)目前主要使用的是免疫細(xì)胞化學(xué)方法，但CTC極低的豐度及其異質(zhì)性使其面臨著技術(shù)挑戰(zhàn)。ctDNA檢測(cè)主要采用分子生物學(xué)方法，但ctDNA具有易降解、含量低等缺點(diǎn)，為精準(zhǔn)檢測(cè)帶來困難。外泌體檢測(cè)在腫瘤診斷方面顯示出良好的應(yīng)用前景,是具有發(fā)展?jié)摿Φ?/p>