分子量及分子量分布檢測方法

1、分子量及分子量分布檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效體積排阻色譜法（HPSEC）測定可溶性聚乳酸平均分子量（Mw）和分子量分布的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于外科植入物用，能被三氯甲烷（或其他溶劑）完全溶解的包括聚L-乳酸）樹脂（或縮寫PLLA）、聚（D-乳酸）樹脂（或縮寫PDLA）、任何比率的DL型共聚體以及丙交酯（或縮寫PLA）和丙交酯-乙交酯共聚物（或縮寫PLGA）的材料。注1：本方法不是絕對的方法，要求使用市售窄分子量分布聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校正。注2：由于聚乳酸產(chǎn)品在生產(chǎn)加工及滅菌過程中（特別是輻照滅菌），會影響材料本身的分子量及分子量分布，因此在評價產(chǎn)品時，宜采用成品進(jìn)行檢測。2 規(guī)范性引用文件

2、下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T2035-2008塑料術(shù)語及定義3 術(shù)語、定義GB/T2035-2008界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件3.1聚乳酸polylacticacid,PLA包括聚（L-乳酸）樹脂（或縮寫PLLA）、聚（D-乳酸）樹脂（或縮寫PDLA）。3.2丙交酯-乙交脂共聚物polylacticacid-polyglycolideacidcopolymer，PLGA由丙交酯及乙交脂按一定比例共聚得到的高分子化合物。4 方法概要溶解于溶劑的聚乳酸樣

3、品注入填有固體基質(zhì)的色譜柱，按照溶液中聚合物分子大小順序分離。自進(jìn)樣開始檢測器持續(xù)監(jiān)測從柱中出來的洗脫時間，從柱中流出分子按照尺寸分離，并按照其濃度分離的分子量被檢測和記錄。通過校正曲線，洗脫時間可以轉(zhuǎn)為分子量，樣品的各種分子量參數(shù)可由分子量/濃度數(shù)據(jù)計算得出。5 試劑和材料5.1溶劑：本方法推薦使用三氯甲烷（CHCl3）。任何與HPSEC系統(tǒng)組分和柱填料相容的溶劑，并且可溶解聚乳酸樣品的溶劑均可以考慮使用。選擇溶劑應(yīng)考慮試劑的純度和一致性，例如四氫呋喃易與氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)，因此四氫咲喃應(yīng)添加抗氧劑（含量為0.025%0.1%的2,6-二叔丁基對甲苯酚）或持續(xù)攪拌或用惰性氣體防止氧化發(fā)生。5.

4、2聚合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：單分散、已知分子量的窄分子量分布聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品（分子量分布MyMn小于1.1）用于校正。5.3聚合物標(biāo)準(zhǔn)溶液：配制24個混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，含有23種基線分離的標(biāo)準(zhǔn)品、至少5種窄尺寸分布的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品，每種成分的質(zhì)量濃度參考所用標(biāo)準(zhǔn)品的說明書中建議的濃度進(jìn)行配置。標(biāo)準(zhǔn)品在室溫下溶解（至多3天），聚合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制后可在常溫中使用1個月。穩(wěn)定的聚苯乙烯溶液室溫時可儲存數(shù)月。6儀器6.1凝膠滲透色譜儀：主要組件有溶劑儲存器、泵、溶劑脫氣裝置、進(jìn)樣器、填充柱和溶質(zhì)檢測器。6.2磁力攪拌器或類似儀器。7分析步驟7.1儀器性能要求7.2塔板數(shù)塔板數(shù)N是無量綱，與柱效和色譜系統(tǒng)中分散過程相

5、關(guān)。多種程序和方法用于估算塔板數(shù)N。HPSEC色譜柱要求等于或超過10000塔板數(shù)/m。塔板數(shù)應(yīng)定期檢測，及時更換不符合性能要求的色譜柱。本方法建議使用與測試方法接近的方法，例如：檢測器：示差折光檢測器溶劑：三氯甲烷（CHCl3）溫度：35°C流速：ImLmin-1測試溶質(zhì)：約10000gmol-1的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品濃度：1.0gLt進(jìn)樣體積：20對于近似高斯分布的溶質(zhì)峰，式（1）可用于計算塔板數(shù)N（或由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算給出）：N/L=16（Vr/W）2/L（1）式中：N塔板數(shù)，單位為個；L總柱長，單位為米（m）；VR峰淋洗體積，單位為毫升（mL）或時間，單位為分（min）；W峰底寬度

6、，體積，單位為毫升（mL）或時間，單位為分（min）,色譜峰兩側(cè)的拐點所作的切線在基線上的截距。7.3分離度分離度（R）代表色譜柱的分離能力，本方法規(guī)定R值不小于2.0。兩種分子量不同且因數(shù)是10的兩種聚合物標(biāo)準(zhǔn)品（分散性小于1.1）進(jìn)樣質(zhì)量濃度不大于0.03%，進(jìn)樣量20吐。按照式（2）計算分離度（或由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算給出）：RS=2X（Vr2-Vr1"（W1+W2）（2）式中：RS分離度，無量綱；Vr1標(biāo)準(zhǔn)品1的峰淋洗體積，單位為毫升（mL）或時間，單位為分（min）；Vr2標(biāo)準(zhǔn)品2的峰淋洗體積，單位為毫升（mL）或時間，單位為分（min）；W1標(biāo)準(zhǔn)品1的峰底寬度，體積，單位為毫

7、升（mL）或時間，單位為分（min）；W2標(biāo)準(zhǔn)品2的峰底寬度，體積，單位為毫升（mL）或時間，單位為分（min）。7.4檢測器響應(yīng)選擇HPSEC操作條件和設(shè)定最優(yōu)化檢測器響應(yīng)，使用者可參考ASTME685第5部分和第7部分測試液相色譜檢測器的性能。如果測試方法是有效的，聚合物檢測峰髙或所有峰面積積分值應(yīng)直接與進(jìn)樣聚合物質(zhì)量成比例，可進(jìn)樣不同濃度的相同的聚苯乙烯確認(rèn)。7.5基線穩(wěn)定性所選儀器條件應(yīng)保證最小的基線噪聲。噪聲分為短噪聲、長噪聲和漂移。短噪聲為頻率大于循環(huán)/分鐘時檢測器信號隨機(jī)變異的最大峰峰振幅，不應(yīng)超過2%的最大聚合物信號。長噪聲為頻率在0.1循環(huán)/min1循環(huán)/min時檢測器信號的

8、所有隨機(jī)變異的最大振幅，不應(yīng)超過5%的最大聚合物信號。漂移為在超過1h測量噪聲的平均斜率，如果漂移超過2%的最大聚合物峰信號而且沒有校正可能導(dǎo)致錯誤結(jié)果。7.6流速流速應(yīng)定期核查。建議采用（1±0.1）mLmin-1,流速精密度應(yīng)小于0.3%。當(dāng)流速變化超過0.3%,更換或檢修泵、加裝流速監(jiān)測器或使用流速內(nèi)標(biāo)物，如甲苯。7.7凝膠滲透色譜儀工作條件使用凝膠滲透色譜儀測定樣品溶液。由于測試結(jié)果取決于所使用的儀器，因此不能給出分析的通用參數(shù)，實驗表明下列的條件參數(shù)是適用的。1）檢測器：示差折光檢測器2）色譜柱：采用排阻極限為7X104及1X107的凝膠滲透色譜柱串聯(lián)，或符合要求的同類產(chǎn)品

9、。3）溫度：35°C4）溶劑：三氯甲烷5）溶劑流速：1mLmin-16）進(jìn)樣體積：20兒7）聚合物樣品溶質(zhì)濃度：2.0gL-110gL-17.8校正7.9校正步驟待測樣品需在分析前估算分子量范圍，以便選擇合適的聚苯乙烯校正標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用三氯甲烷配制聚苯乙烯校正標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。進(jìn)樣量應(yīng)與樣品進(jìn)樣量一致，可根據(jù)使用柱子的直徑，選擇合適的進(jìn)樣量。7.10校正曲線HPSEC的校正曲線以測量峰洗脫時間t,對校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量值的對數(shù)作圖，lgM=a+bt。在實際RwR的HPSEC分離機(jī)制，校正曲線一般假設(shè)為S型（見圖1），高于溶質(zhì)A分子量的和低于溶質(zhì)D分子量的是無效量。數(shù)據(jù)處理可以使用不同方法處

10、理校正數(shù)據(jù)。圖1HPSEC校正曲線7.11測定過程7.12樣品溶液進(jìn)樣進(jìn)樣前可在每個樣品溶液中加入內(nèi)標(biāo)。進(jìn)樣體積應(yīng)與校正時使用的體積相同。聚合物進(jìn)樣質(zhì)量一般在0.05mg0.5mg之間。當(dāng)分子量分布較窄或分子量較大，應(yīng)降低進(jìn)樣量。如樣品進(jìn)樣量過大，可能影響峰洗脫體積與色譜峰形，可重新對未知樣品或標(biāo)準(zhǔn)品用一半起始濃度進(jìn)樣,確保洗脫曲線是可重復(fù)的。如果變化較大，應(yīng)按照低濃度重復(fù)進(jìn)樣。7.13樣品溶液測定按7.2規(guī)定的條件分析樣品溶液。7.14基線檢測7.1.4討論了符合要求的基線標(biāo)準(zhǔn)。基線為線性，識別聚合物色譜的起始和結(jié)束的基線噪聲，直線連接這兩部分。如果漂移導(dǎo)致真實基線偏離所產(chǎn)生的直線，應(yīng)放棄分

11、析結(jié)果。7.15積分限和數(shù)據(jù)處理建議積分限應(yīng)落在校正曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液最大和最小的洗脫時間范圍之間。不建議對分子量低于500gmol-的色譜峰進(jìn)行積分。由凝膠滲透色譜儀數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采集和處理數(shù)據(jù)。7.16流速校正流速變化應(yīng)在0.3%之內(nèi)，如果HPSEC系統(tǒng)沒有連續(xù)流速監(jiān)測器或這些裝置，如阻尼泵(可以自動和精確監(jiān)測洗脫體積增量)，可以使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。如使用內(nèi)標(biāo)校正，樣品洗脫時間;與校正值有以下關(guān)系，見式：校正ti=ti'(tis)/(tis)'(3)式中：(tis)在校正時，每次進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)平均洗脫量和時間；(tis)'在進(jìn)樣分析時，每次進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)平均洗脫量和時間。8結(jié)果計算8.1數(shù)據(jù)列表記錄色譜峰出峰時間。從校正曲線得出洗脫體積的適當(dāng)?shù)姆肿恿恐怠?.2 平均分子量及分子量分布計算重均分子量）、w采用凝膠滲透色譜儀所配的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理，可得出數(shù)均分子量M）、nz均分子量（M）及分子量分布M/M。zwn9精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值