限制性核酸內(nèi)切酶切割原理方法結(jié)果分析及應(yīng)用

1、PPT制作：杜雨濛、張佳佳、陳靚限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割原理、切割原理、方法、結(jié)果分析及應(yīng)用方法、結(jié)果分析及應(yīng)用課堂內(nèi)容回顧：1、定義：、定義： 1、定義：、定義：限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別是可以識(shí)別特特定的定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的進(jìn)行切割的一一類酶類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。，簡(jiǎn)稱限制酶。2、分類：、分類：型酶：具有型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點(diǎn)處切割修飾的作用在非特異位點(diǎn)處切割DNA。型酶：是最重要的工具酶型酶：是最重要的工具酶能在能在DNA分子內(nèi)部的特異

2、分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割位點(diǎn)識(shí)別和切割DNA雙鏈，所雙鏈，所 以通常所說的限制以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)型酶：具有DNA修飾的作用在非特異位點(diǎn)處切割DNA。型酶：型酶：是最重要的工具酶能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割DNA雙鏈，所 以通常所說的限制性內(nèi)切酶就指這一類酶。型酶：與型酶一樣，具有限制與修飾活性，其切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。3、命名：、命名：規(guī)則規(guī)則：第一個(gè)字母（大寫）：取自該酶的細(xì)胞屬名第一個(gè)字母（大寫）：取自該酶的細(xì)胞屬名第二、三個(gè)字

3、母（小寫）：該細(xì)胞的種名第二、三個(gè)字母（小寫）：該細(xì)胞的種名第四個(gè)字母（羅馬數(shù)字）：代表同一菌株中第四個(gè)字母（羅馬數(shù)字）：代表同一菌株中 不同限制性內(nèi)切酶的編號(hào)不同限制性內(nèi)切酶的編號(hào)例如：例如：EcoR、Hind 等等等等限制性核酸內(nèi)切酶切割原理1、類和類和類酶：類酶： 在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。的存在。類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而，而類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。分子，然后從底物上解離

4、。2、類由兩種酶組成：類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列；割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至至6個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列，產(chǎn)生回文對(duì)稱特異核苷酸序列，產(chǎn)生5或或3黏性末端（也有一些產(chǎn)生平端或黏性末端（也有一些產(chǎn)生平端或鈍端）鈍端）

5、 幾種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)幾種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)例如：3、同工異源酶：來源不同但能識(shí)別和切割同一位、同工異源酶：來源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。如：點(diǎn)的酶。如：BamH和和Bst，Xho和和Pae R7等可以相互代替使用。等可以相互代替使用。4、同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同末端的限、同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同末端的限制性內(nèi)切酶。如：制性內(nèi)切酶。如：BamH和和Sau3A等由此產(chǎn)等由此產(chǎn)生的生的DNA片段可借黏性末端相互連接，操作是具片段可借黏性末端相互連接，操作是具有更大的靈活性。有更大的靈活性。通過 使 用 (15 種 )限 制 性 內(nèi) 切 酶 酶 切 重 組質(zhì)粒，說明限

6、制性內(nèi)切酶的應(yīng)用和限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析的方法o方法：1.質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建 采用聚合酶鏈反應(yīng)chainreaction，PCR)方法擴(kuò)增出 MLCKcDNA 片段，插入質(zhì)粒 pBKrsv中，構(gòu)建成 pBKrsv-MLCK 重組質(zhì)粒2.酶切、構(gòu)建、片段的純化和連接酶切、構(gòu)建、片段的純化和連接 按Maniatis等方法進(jìn)行。3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化采用“熱休克”法。4.重組質(zhì)粒的提取重組質(zhì)粒的提取 挑取陽(yáng)性克隆，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒。5.定量定量 取5LDNA溶液用4.5l去離子水稀釋，用紫外分光光度計(jì)比色，讀取AZ60和AZ80吸光度值，計(jì)算出AZ60

7、/AZ80比值，按下列公式計(jì)算質(zhì)粒DNA濃度,本實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒DNA濃度為1.0g/L。質(zhì)粒 DNA 濃度(g/L)=AZ60X稀釋度/Z0=AZ60X56.重組質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒的限制性核酸內(nèi)切酶酶切 取0.5ml離心管15只，分別加入質(zhì)粒 2l(2g)，依 次 加 入 限 制性內(nèi) 切 酶 Acc I、Apal I、Ava H、Bgl I、BglH、Nco I、OxanI、Puv H、PpUM I、SalI、Ssp I、SstI、Xba I、Hind皿、EcoR I各0.5微升及相 應(yīng)的 NEBuffer2L、BSAL、去離子水 13.5L、 混勻、點(diǎn)動(dòng)離心，37 水浴孵育2小時(shí)

8、。7、配置配置1.5的瓊脂糖凝膠的瓊脂糖凝膠 稱取瓊脂糖0.6g, 加入 1XTAE 緩 沖 液 40 ml置 微 波 爐 中,中 火120s，熔化后冷卻至60，加入3L10g/l溴化乙錠，混勻，倒入插好梳子的模具中，凝固后放入電泳槽中。電泳槽中加入1TAE緩沖液。8、電泳電泳 取酶切產(chǎn)物8l與DNA上樣緩沖液2l混勻，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可觀察到橘紅色DNA條帶，結(jié)果如圖Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit.結(jié)果重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒pBKrsv-MLCK pBKrsv-MLCK 全長(zhǎng)全長(zhǎng)7378bp7378bp

9、，通過通過 DNAstarDNAstar軟件分析獲得各酶酶切位點(diǎn)的信息軟件分析獲得各酶酶切位點(diǎn)的信息，選擇在插入片段中單獨(dú)存在和在插入片段與質(zhì)選擇在插入片段中單獨(dú)存在和在插入片段與質(zhì)粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，計(jì)粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，計(jì)算酶切后片段大小的理論值經(jīng)各種限制性內(nèi)切算酶切后片段大小的理論值經(jīng)各種限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得不同大小的片段，經(jīng)電泳分析酶酶切后，獲得不同大小的片段，經(jīng)電泳分析與理論設(shè)計(jì)完全一致與理論設(shè)計(jì)完全一致。結(jié)果分析限制性內(nèi)切酶酶譜分析往往用于對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行初分析所獲得的信息將有助于確定構(gòu)建是否成功及其插入片段的方向(orientation

10、)l在選擇限制性內(nèi)切酶時(shí),應(yīng)選擇在插入片段中單獨(dú)存在和在插入片段與質(zhì)粒序列中均含有的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),這樣可保證酶切片段大小能滿足進(jìn)一步分析的需要。在進(jìn)行限制性內(nèi)切酶實(shí)驗(yàn)時(shí)首先應(yīng)進(jìn)行 D N A的定量，1 U 酶的限制性內(nèi)切酶活性指在一定時(shí)間內(nèi)(60min)適當(dāng)溫度下和建議使用的緩沖液中,在50l反應(yīng)體系中,將1g底物 DNA 完全消化所需要的酶量l單位活性依所用底物的不同而不同,使用其他底物時(shí),應(yīng)根據(jù)情況確定所用酶量l根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn),1g底物 DNA 加入 5 U 的限制性內(nèi)切酶在2h時(shí)間內(nèi)可以酶切完全，通常延長(zhǎng)消化。實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題及其討論問題及其討論解決方法解

11、決方法1.標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性2.將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA3.檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳4.換用對(duì)DNA甲基化不敏感的同類酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-,dam-基因型的細(xì)菌菌株5.換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同類酶消化DNA，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+,dam+菌株中擴(kuò)增6.將DNA底物與DNA混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證7.換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證一一.如果如果DNA完全沒有被內(nèi)完全沒有被內(nèi)切酶切割？切酶切割？1.內(nèi)切酶失活2.DNA不純，含有SDS，酚，EDAT等內(nèi)切酶抑制因子3.條件不適（試劑、溫度）4.DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化5.DNA酶切位點(diǎn)沒有甲基化(如Dpn1)6

12、.DNA位點(diǎn)上存在其它修飾7.DNA不存在該酶識(shí)別順序解決方法解決方法二二.如果如果DNA切割不完全？切割不完全？1.內(nèi)切酶活性下降2.內(nèi)切酶稀釋方法不正確3.DNA不純，反應(yīng)條件不佳4.內(nèi)切酶識(shí)別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾5.部分DNA溶液粘在管壁上6.內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)7.酶切后DNA粘性末端退火8.由于反應(yīng)溶液、溫度使內(nèi)切酶變性9.過度稀釋使酶活性降低10.反應(yīng)條件不適11.識(shí)別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序1.用5-10倍量過量消化2.用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶3.同上4.同上5.反應(yīng)前離心數(shù)秒6.將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積7.電泳前將樣品置65保溫5

13、-10分鐘，取出后置冰浴驟冷8.使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度9.適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏10.使用最佳反應(yīng)體系11.加大酶量5-10倍1.用DNA作底物檢查酶切結(jié)果2.電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段三三.如果如果DNA片段數(shù)目片段數(shù)目多于理論值？多于理論值？1.其它內(nèi)切酶污染2.底物中含其它DNA雜質(zhì)解決方法解決方法限制性核酸內(nèi)切酶的限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用應(yīng)用l用于DNA基因組物理圖譜的組建l基因的定位和基因分離lDNA分子堿基序列分析l比較相關(guān)的DNA分子和遺傳工程u 將水稻葉綠體的將水稻葉綠體的DNADNA，用，用EcoR1EcoR1限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶消

14、化后，消化后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMPLMP）的）的1%1%瓊脂糖凝膠中做電泳瓊脂糖凝膠中做電泳分離。從分離。從LMPLMP中分離出分子大小為中分離出分子大小為1.8-2.5kb1.8-2.5kb之間的之間的DNADNA片段，片段，再與同樣經(jīng)過再與同樣經(jīng)過EcoR1EcoR1限制性核制性內(nèi)切酶限制性核制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶切割并用堿性磷酸酶做了脫磷酸化處理的做了脫磷酸化處理的pBR322pBR322質(zhì)粒連接，然后將混合物轉(zhuǎn)移到大質(zhì)粒連接，然后將混合物轉(zhuǎn)移到大腸桿菌腸桿菌53465346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇板上，形成菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇板上，形

15、成AmprAmpr轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoREcoR 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割的切割的水稻水稻DNADNA基因組庫(kù)。用基因組庫(kù)。用AmprAmpr轉(zhuǎn)化子菌落與轉(zhuǎn)化子菌落與32P32P放射性標(biāo)記的放射性標(biāo)記的psbA psbA DNADNA探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽(yáng)性克隆體。從這些探針做菌落雜交，可以分離出其中的陽(yáng)性克隆體。從這些陽(yáng)性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒陽(yáng)性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒DNADNA，經(jīng)進(jìn)一步的分析，經(jīng)進(jìn)一步的分析，就能測(cè)出水稻葉綠體基因就能測(cè)出水稻葉綠體基因psbApsbA的序列。的序列。應(yīng)用一應(yīng)用二u 利用利用pBR322pBR322作為載體作為載體重組人體的抑生長(zhǎng)激素重組人體的抑生長(zhǎng)激素也是一也是一個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組個(gè)經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小