微生物細(xì)胞破碎學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞(xbo)破碎破碎第一頁(yè)，共74頁(yè)。第2頁(yè)/共74頁(yè)第二頁(yè)，共74頁(yè)。為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要(byo)了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（表了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)（表1）：）： 微生物微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚/nm/nm20-8020-8010-1310-13100-300100-300100-250100-250層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要組主要組成成肽聚糖肽聚糖（40-90%40-90%）多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋

2、白質(zhì)脂多糖脂多糖（1-4%1-4%）肽聚糖肽聚糖（5-10%5-10%）脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖（11-22%11-22%）磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖（30-40%30-40%）甘露聚糖甘露聚糖（30%30%）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（6-8%6-8%）脂類(lèi)脂類(lèi)（8.5-8.5-13.5%13.5%）多聚糖多聚糖（80-90%80-90%）脂類(lèi)脂類(lèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)一、細(xì)胞壁的組成一、細(xì)胞壁的組成(z chn)和結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)第3頁(yè)/共74頁(yè)第三頁(yè)，共74頁(yè)。第4頁(yè)/共74頁(yè)第四頁(yè)，共74頁(yè)。第5頁(yè)/共74頁(yè)第五頁(yè)，共74頁(yè)。第6頁(yè)/共74頁(yè)第六頁(yè)，共74頁(yè)。第7頁(yè)/共74頁(yè)第七頁(yè)，共74頁(yè)。第8頁(yè)/共74頁(yè)

3、第八頁(yè)，共74頁(yè)。u細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自細(xì)菌破碎的主要阻力來(lái)自(li z)于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的堅(jiān)固；性細(xì)菌的堅(jiān)固；u酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它酵母細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；的厚度；u由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比由于霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高。 u不同種類(lèi)的細(xì)胞結(jié)

4、構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到不同種類(lèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)差別很大，破碎的難易程度也不同，由難到易的大致排列順序?yàn)椋褐参锛?xì)胞真菌（如霉菌、酵母菌）革蘭易的大致排列順序?yàn)椋褐参锛?xì)胞真菌（如霉菌、酵母菌）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌動(dòng)物細(xì)胞。氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌動(dòng)物細(xì)胞。第9頁(yè)/共74頁(yè)第九頁(yè)，共74頁(yè)。第10頁(yè)/共74頁(yè)第十頁(yè)，共74頁(yè)。二、常用二、常用(chn yn)破碎方法破碎方法分分 類(lèi)類(lèi)作作 用用 機(jī)機(jī) 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性機(jī)機(jī)械械法法珠磨法珠磨法固體剪切作用固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易

5、失活，漿液分離困難高壓勻漿法高壓勻漿法液體剪切作用液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和絲狀菌和含有包含體的基因工程菌含有包含體的基因工程菌超聲破碎法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作不適合大規(guī)模操作X-pressX-press法法固體剪切作用固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合的產(chǎn)物不適合非非機(jī)機(jī)械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度專(zhuān)一性，條件溫和，漿液易分離，具有高度專(zhuān)一性，條件

6、溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差低，通用性差滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)- -融化融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法干燥法改變細(xì)胞膜滲透性改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活第11頁(yè)/共74頁(yè)第十一頁(yè)，共74頁(yè)。細(xì)胞破碎細(xì)

7、胞破碎(p su)機(jī)理圖機(jī)理圖第12頁(yè)/共74頁(yè)第十二頁(yè)，共74頁(yè)。進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速）一起快速(kui s)攪拌或研磨，攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用

8、夾套冷卻的方式帶走。冷卻的方式帶走。1.珠磨法（珠磨法（Bead mill）原理原理(yunl)：第13頁(yè)/共74頁(yè)第十三頁(yè)，共74頁(yè)。高速高速(o s)珠磨機(jī)珠磨機(jī)第14頁(yè)/共74頁(yè)第十四頁(yè)，共74頁(yè)。第15頁(yè)/共74頁(yè)第十五頁(yè)，共74頁(yè)。膠體磨膠體磨德國(guó)進(jìn)口德國(guó)進(jìn)口(jn ku)珠珠磨機(jī)磨機(jī)第16頁(yè)/共74頁(yè)第十六頁(yè)，共74頁(yè)。第17頁(yè)/共74頁(yè)第十七頁(yè)，共74頁(yè)。破碎破碎(p su)作用方程作用方程破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符合下列公式破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt ln1/(1-R)=Kt 其中其中 R R 破碎率；破碎率

9、； K K一一 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)(chngsh)(chngsh)； t t一一 時(shí)間。時(shí)間。 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)(chngsh)K(chngsh)K與許多操作參數(shù)有關(guān)，如與許多操作參數(shù)有關(guān)，如如攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠如攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液的濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠的裝量和珠體的直徑，以及溫度等。的裝量和珠體的直徑，以及溫度等。第18頁(yè)/共74頁(yè)第十八頁(yè)，共74頁(yè)。操作(cozu)條件的選擇：珠體大小根據(jù)細(xì)胞大小、濃度以及連續(xù)操作時(shí)不使珠體帶出來(lái)選擇。珠體裝量裝量少時(shí)(shosh)，細(xì)胞不易破碎；裝量大時(shí)，能量消耗大，研磨室熱擴(kuò)散性能降低，引

10、起溫度升高。溫度溫度高時(shí)細(xì)胞較易破碎，但要考慮目的產(chǎn)物不受破壞。一般溫度控制在540內(nèi)時(shí)影響較小。攪拌(jiobn)轉(zhuǎn)速過(guò)高將使能量消耗大增，而破碎率上升不明顯。能耗Rn第19頁(yè)/共74頁(yè)第十九頁(yè)，共74頁(yè)。第20頁(yè)/共74頁(yè)第二十頁(yè)，共74頁(yè)。第21頁(yè)/共74頁(yè)第二十一頁(yè)，共74頁(yè)。第22頁(yè)/共74頁(yè)第二十二頁(yè)，共74頁(yè)。第23頁(yè)/共74頁(yè)第二十三頁(yè)，共74頁(yè)。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：以下：降低能耗降低能耗減少大分子目的減少大分子目的(md)產(chǎn)物的失活產(chǎn)物的失活減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來(lái)的

11、困難。離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。第24頁(yè)/共74頁(yè)第二十四頁(yè)，共74頁(yè)。采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國(guó)采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國(guó)APV公司和美國(guó)公司和美國(guó) Microfluidics公司均有產(chǎn)品公司均有產(chǎn)品(chnpn)出售）。出售）。2.高壓勻漿高壓勻漿(yn jin)法（法（High-pressure homogenization）大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過(guò)針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸

12、浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速?lài)姵龅臐{液又射到靜止速度高達(dá)幾百米，高速?lài)姵龅臐{液又射到靜止(jngzh)的撞的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。細(xì)胞破碎。原理：原理：第25頁(yè)/共74頁(yè)第二十五頁(yè)，共74頁(yè)。高壓高壓(goy)勻漿器勻漿器第26頁(yè)/共74頁(yè)第二十六頁(yè)，共74頁(yè)。第27頁(yè)/共74頁(yè)第二十七頁(yè)，共74頁(yè)。大、中、小型高壓大、中、小型高壓(goy)勻漿器勻漿器第28頁(yè)/共74

13、頁(yè)第二十八頁(yè)，共74頁(yè)。第29頁(yè)/共74頁(yè)第二十九頁(yè)，共74頁(yè)。第30頁(yè)/共74頁(yè)第三十頁(yè)，共74頁(yè)。第31頁(yè)/共74頁(yè)第三十一頁(yè)，共74頁(yè)。p易造成易造成(zo chn)堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌p較小的革蘭氏陽(yáng)性菌較小的革蘭氏陽(yáng)性菌p含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）不宜采用高壓勻漿不宜采用高壓勻漿(yn jin)法的細(xì)胞類(lèi)法的細(xì)胞類(lèi)型：型： 第32頁(yè)/共74頁(yè)第三十二頁(yè)，共74頁(yè)。第33頁(yè)/共74頁(yè)第三十三頁(yè)，共74頁(yè)。第34頁(yè)/共74頁(yè)第三十四頁(yè)，共74頁(yè)。噴霧撞擊破碎(p su)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖第35頁(yè)/共

14、74頁(yè)第三十五頁(yè)，共74頁(yè)。板，得以破碎。第36頁(yè)/共74頁(yè)第三十六頁(yè)，共74頁(yè)。第37頁(yè)/共74頁(yè)第三十七頁(yè)，共74頁(yè)。第38頁(yè)/共74頁(yè)第三十八頁(yè)，共74頁(yè)。利用發(fā)射利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生(fshng)空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎超聲破碎(p su)法（法（Ultrasonication）一般桿菌比球菌易破碎，一

15、般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差，該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用（聲能傳遞和散熱）。較差，該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用（聲能傳遞和散熱）。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些(mu xi)敏感性活性物質(zhì)失活。敏感性活性物質(zhì)失活。第39頁(yè)/共74頁(yè)第三十九頁(yè)，共74頁(yè)。第40頁(yè)/共74頁(yè)第四十頁(yè)，共74頁(yè)。第41頁(yè)/共74頁(yè)第四十一頁(yè)，共74頁(yè)。3.超聲破碎超聲破碎(p su)法（法（Ultrasonication）其破碎率的相關(guān)其破碎率的相關(guān)(xinggun)因素因素: 聲頻、聲能；聲頻、聲能；處

16、理時(shí)間處理時(shí)間細(xì)胞細(xì)胞(xbo)濃度濃度菌種類(lèi)型菌種類(lèi)型 第42頁(yè)/共74頁(yè)第四十二頁(yè)，共74頁(yè)。第43頁(yè)/共74頁(yè)第四十三頁(yè)，共74頁(yè)。第44頁(yè)/共74頁(yè)第四十四頁(yè)，共74頁(yè)。第45頁(yè)/共74頁(yè)第四十五頁(yè)，共74頁(yè)。影響超聲對(duì)生物產(chǎn)品的回收有很多因素影響超聲對(duì)生物產(chǎn)品的回收有很多因素（1）溫度）溫度 避免方法避免方法 預(yù)冷預(yù)冷 冷凝循環(huán)水冷凝循環(huán)水（2）游離基的生成等化學(xué)效應(yīng)）游離基的生成等化學(xué)效應(yīng). 應(yīng)對(duì)方式應(yīng)對(duì)方式 添加游離基的清除劑添加游離基的清除劑胱氨酸，谷胱甘肽或者利用胱氨酸，谷胱甘肽或者利用(lyng)氫氫 氣頂吹細(xì)胞懸浮液來(lái)緩和氣頂吹細(xì)胞懸浮液來(lái)緩和第46頁(yè)/共74頁(yè)第四十六頁(yè)

17、，共74頁(yè)。第47頁(yè)/共74頁(yè)第四十七頁(yè)，共74頁(yè)。第48頁(yè)/共74頁(yè)第四十八頁(yè)，共74頁(yè)。第49頁(yè)/共74頁(yè)第四十九頁(yè)，共74頁(yè)。4.酶溶法（酶溶法（Enzymatic Lysis）（1）外加）外加(wiji)酶法酶法 常用常用(chn yn)的溶酶的溶酶溶菌酶溶菌酶-1，3-葡聚糖酶葡聚糖酶-1，6-葡聚糖酶葡聚糖酶蛋白酶蛋白酶甘露甘露(gnl)糖酶糖酶糖苷酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類(lèi)溶菌酶主要用于細(xì)菌類(lèi)細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物第50頁(yè)/共74頁(yè)第五十頁(yè)，共74頁(yè)。如：對(duì)酵母細(xì)胞如：對(duì)酵母細(xì)胞(xbo)采用酶法破碎時(shí)，

18、先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞(xbo)膜破裂，釋出膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。胞內(nèi)產(chǎn)物。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞(xbo)外形完整。外形完整。缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶），產(chǎn)

19、物抑制的存在。的酶），產(chǎn)物抑制的存在。 如在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚如在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。糖酶。 第51頁(yè)/共74頁(yè)第五十一頁(yè)，共74頁(yè)。u誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)(jf)自身溶胞酶的活自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。u影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、影響自溶過(guò)程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。常用加熱法和干燥法。胞代謝途徑等。常用加熱法和干燥法。u缺點(diǎn)是：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自缺點(diǎn)是：對(duì)不

20、穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。 （2）自溶法（）自溶法（Autolysis）第52頁(yè)/共74頁(yè)第五十二頁(yè)，共74頁(yè)。某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以金屬螯合劑等，可以(ky)改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。5.化學(xué)化學(xué)(huxu)滲透法（滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁

21、膜的結(jié)構(gòu)該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)(jigu)與組成。與組成。 第53頁(yè)/共74頁(yè)第五十三頁(yè)，共74頁(yè)。如如Triton X-100是一種非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有是一種非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二其他的表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二(sh r)烷基磺酸鈉烷基磺酸鈉等也可使細(xì)胞破碎。等也可使細(xì)胞破碎。（1）表面）表面(biomin)活性劑活性劑可促使細(xì)胞某些組分可促使細(xì)胞某些

22、組分(zfn)溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。第54頁(yè)/共74頁(yè)第五十四頁(yè)，共74頁(yè)。處理處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通細(xì)菌的外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子?？慷r(jià)陽(yáng)離子Ca2+或或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將將Ca2+或或Mg2+螯合，大量螯合，大量(dling)的脂多糖分子將脫的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通

23、透性的增強(qiáng)。（2）EDTA螯合劑螯合劑第55頁(yè)/共74頁(yè)第五十五頁(yè)，共74頁(yè)。能分解細(xì)胞壁中的類(lèi)脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物能分解細(xì)胞壁中的類(lèi)脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)質(zhì)(wzh)被釋放出來(lái)。被釋放出來(lái)。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。（3）有機(jī)溶劑）有機(jī)溶劑（4）變性劑）變性劑鹽酸胍（鹽酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（）和脲（Urea）是常用的變性劑。是常用的變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從變性劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。而使疏水性化合物溶于

24、水溶液。第56頁(yè)/共74頁(yè)第五十六頁(yè)，共74頁(yè)。不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透處理方式不同細(xì)胞可采用的化學(xué)滲透處理方式細(xì)胞類(lèi)型細(xì)胞類(lèi)型變性劑變性劑清潔劑清潔劑有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑酶酶抗生素抗生素生物試劑生物試劑螯合劑螯合劑革蘭氏陰革蘭氏陰性細(xì)菌性細(xì)菌* * * * * * *革蘭氏陽(yáng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌性細(xì)菌* * * *酵母菌酵母菌* * * * * * *植物細(xì)胞植物細(xì)胞* * * * *巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞* * * * 表示表示(biosh)適用適用第57頁(yè)/共74頁(yè)第五十七頁(yè)，共74頁(yè)。各種試劑的不同作用機(jī)理，將幾種試劑合理地搭配(dpi)使用能有效地提高胞內(nèi)物質(zhì)的釋放率。例：?jiǎn)为?dú)用0.1mol/L鹽酸

25、胍處理(chl)E.coli僅釋放約1%的蛋白質(zhì)0.5% TritonX-100處理蛋白質(zhì)釋放(shfng)率為4%二者合用，蛋白質(zhì)釋放(shfng)率可達(dá)53%左右第58頁(yè)/共74頁(yè)第五十八頁(yè)，共74頁(yè)。u通用性差；通用性差；u時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般(ybn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%；u有些化學(xué)試劑有毒有些化學(xué)試劑有毒 。化學(xué)化學(xué)(huxu)滲透法優(yōu)點(diǎn)：滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)缺點(diǎn)(qudin)：l對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍如多肽和小分

26、子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；滯留在胞內(nèi)；l細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。一步提取。第59頁(yè)/共74頁(yè)第五十九頁(yè)，共74頁(yè)。將濃縮的菌體懸浮液冷卻至將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25形成冰晶體，利用形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)(shyng

27、)范圍廣、破碎率高、細(xì)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)(shyng)于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。 6.其他其他(qt)方法方法1. X-press法法第60頁(yè)/共74頁(yè)第六十頁(yè)，共74頁(yè)。第61頁(yè)/共74頁(yè)第六十一頁(yè)，共74頁(yè)。將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速透壓的突然變化，水迅速(xn s)(x

28、n s)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。度減弱。 2. 2. 滲透壓法（滲透壓法（Osmotic pressureOsmotic pressure）第62頁(yè)/共74頁(yè)第六十二頁(yè)，共74頁(yè)。第63頁(yè)/共74頁(yè)第六十三頁(yè)，共74頁(yè)。o細(xì)胞膜疏水鍵破裂細(xì)胞膜疏水鍵破裂o胞內(nèi)結(jié)冰細(xì)胞膨脹而破裂胞內(nèi)結(jié)冰細(xì)胞膨脹而破裂o適用適用(shyng)于細(xì)

29、胞壁較脆弱的菌體，破碎率于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。些蛋白質(zhì)變性。 3. 3. 反復(fù)反復(fù)(fnf)(fnf)凍結(jié)凍結(jié)- -融融化法化法第64頁(yè)/共74頁(yè)第六十四頁(yè)，共74頁(yè)。使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變(gibin)(gibin)細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在氣流干燥主要適用于酵母菌，一

30、般在25-3025-30的氣流中吹干；的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)如真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于較不穩(wěn)定的生化物質(zhì)如酶。酶。4.4.干燥干燥(gnzo)(gnzo)法法氣流干燥氣流干燥真空干燥真空干燥噴霧干燥噴霧干燥冷凍干燥冷凍干燥第65頁(yè)/共74頁(yè)第六十五頁(yè)，共74頁(yè)。第66頁(yè)/共74頁(yè)第六十六頁(yè)，共74頁(yè)。第67頁(yè)/共74頁(yè)第六十七頁(yè)，共74頁(yè)。第68頁(yè)/共74頁(yè)第六十八頁(yè)，共74頁(yè)。三、破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)三、破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)(jsh)(jsh)的研究方向的研究方向 細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含(ni hn)

31、(ni hn)物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線(xiàn)性增加導(dǎo)電率隨著破碎率的增加而呈線(xiàn)性增加 。1. 1. 破碎率的測(cè)定破碎率的測(cè)定(cdng)(cdng)1)1) 直接測(cè)定法直接測(cè)定法2)2) 目的產(chǎn)物測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法3)3) 導(dǎo)電率測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。采用染色的方法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。如采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，如采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離細(xì)胞碎片，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)或酶）的含量或活性，并與或酶）的含量或活性，并與100%100%破碎率所獲得的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值