生物化學大實驗3

1、層析技術(shù)層析技術(shù) 4.1 層析技術(shù)概述層析技術(shù)概述4.1.1 引言引言層 析 法 亦 稱 層 離 法 或 色 譜 法（chromatography），它從發(fā)明至今已有一個多世紀的歷史。1903年俄國植物學家茨維特（m. tswett）首先使用此法分離植物色素。他向填充有caco3粉末的柱內(nèi)加入植物色素提取液，并以石油醚淋洗，由于caco3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分開，柱上端呈黃色，較下端呈綠色，出現(xiàn)了不同顏色的譜帶。后稱之為色譜。由chroma（色彩）和graphs（圖譜）構(gòu)成色譜一詞，層析法由此而得名。但是，當時這種方法并沒引起人們太多的關(guān)注，直到1931年r. kuhn

2、用此法從蛋黃中分離出黃體素、從玉米中分離出玉米黃色素開始，層析技術(shù)才逐漸引起了人們的重視。此后1941年martin用具有親水能力的硅膠介質(zhì)填充的層析柱分離氨基酸成功，并提出了液-液分配層析最初的塔板論。 英國生物學家martin和synge根據(jù)塔板論，提出了遠見卓識的預言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。前者預見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預見了高效液

3、相色譜（hplc）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實現(xiàn)。80年代后期，人們在氣相層析技術(shù)和液相層析技術(shù)的基礎上還發(fā)展了超臨界色譜?，F(xiàn)在它們已成為生物化學與分子生物學、化學等領(lǐng)域不可缺少的分析分離手段。因此, martin和synge于1952年被授予諾貝爾化學獎。 4.1.2 層析的兩個重要理論層析的兩個重要理論層析法是一種利用混合物中各組分的物理、化學及生物學特性的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相中，即固定相和流動相，當流動相流過加有樣品的固定相時，各組分所受固定相的阻滯作用和受流動相的推動作用的影響各不相同，從而使各組分以不同速度移動而達到彼此分離的目的。 （1）塔板理論）塔板理論層析分

4、離技術(shù)的目的是要將混合樣品中各組分彼此分開，它遵循相似相溶的原理，在互不相溶的兩相（固定相和流動相）之間進行分配。根據(jù)塔板理論，可以把層析柱設想由若干個層（即塔板）組成，被分離組分在每一個層（塔板）里的兩相之間達到一次平衡，就進行了一次分配，相當于經(jīng)過一個層（塔板）高。在分離過程中組分要達到多少次平衡，進行了多少次分配，應經(jīng)過多少個層（塔板）高。理論塔板數(shù)量是衡量物質(zhì)在柱內(nèi)的分配次數(shù)，分離次數(shù)越多物質(zhì)的分離效果越好。這樣分配系數(shù)小的組分和分配系數(shù)大的組分就能彼此分開，分配系數(shù)小的組分每次達到平衡的時間短，從層析柱中先流出；分配系數(shù)大的組分每次達到平衡的時間長，從層析柱中后流出。 對于一個層析柱

5、來說，可作如下基本假設：1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為h，稱為一個理論塔板。層析柱的長度用l表示。2. 每個塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動相之間瞬間達到平衡，且忽略分子縱向擴散。3. 溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)。4. 流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程（即不連續(xù)過程）。5. 溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當于一個兩相平衡的小單元（一次萃取）。則理論塔板數(shù)量n為：l/h（2）速率理論）速率理論根據(jù)上述假設，塔板理論初步闡明了組分在層析中的遷移速度。它可以

6、定量地描述層析柱的柱效率等。對層析技術(shù)的發(fā)展起了重要的推動作用。但是塔板理論采用的是平衡過程的研究方法，忽略了許多動力學因素對柱分離效率的影響。實際上，層析分離與分子的擴散及運動速度是有關(guān)的，而且，同一溶質(zhì)在不同流動相流速下將具有不同的理論塔板數(shù)，所以，后來又發(fā)展了非平衡態(tài)的層析理論，或稱速率理論。該理論吸收了層析的塔板理論的觀點，同時又進一步把層析分離的分配過程與渦旋流擴散、分子擴散及傳質(zhì)阻力三者的關(guān)系聯(lián)系起來，提出了連續(xù)流塔板模型。用van deemter方程表示影響塔板高度的因素。h=a+b/u+cu其中，a、b、c分別表示渦旋流擴散、分子擴散和傳質(zhì)阻力的3種系數(shù)；u表示流動相線性流速。

7、由上式可以看出，當流動相流速一定時，a、b、c越小，h也越小，理論塔板數(shù)越大，柱效就越高。下面我們來討論一下這三方面因素的影響。渦旋流擴散（渦旋流擴散（a） 流動相中的組分由于受到固定相顆粒的阻礙，不得不從各種無規(guī)則的固體顆粒之間的間隙繞行，迫使其流動的方向不斷發(fā)生改變，稱為渦旋流擴散。由此可見，渦旋流現(xiàn)象的發(fā)生是由于固定相的顆粒大小不均勻及填充柱的不均勻引起各組分在層析柱中所發(fā)生的位移不同。它與流動相的性質(zhì)、流速及組分的性質(zhì)無關(guān)。因而，層析最好使用顆粒細、粒度均勻的填料作為固定相，以減少渦旋流擴散。 分子擴散（分子擴散（b/u）分子擴散是由濃度梯度所造成的。當樣品隨著流動相流經(jīng)層析柱的時候，

8、樣品的前端和后端的濃度一定會降低，這就產(chǎn)生了濃度差，有了濃度差就會形成自由擴散，即分子擴散。分子擴散對于氣相色譜和液相色譜的影響大相徑庭，由于組分在液體中比氣體中的擴散要小105倍，它對液相色譜的影響可以忽略。分子擴散不僅與組分在氣相層析中停留的時間成正比，它還與載氣和組分的性質(zhì)、溫度液相色譜的影響、壓力和分子量等有關(guān)。 傳質(zhì)阻力（傳質(zhì)阻力（cu） 在層析過程中，樣品各組分總是從流動相進入固定相，又從固定相進入流動相，如此反復多次，最終完成層析。那么，流動相把組分交給固定相速度，固定相把組分交給流動相的速度，以及各組分在固定相和流動相中達到平衡的速度都是影響層析的因素，這就是傳質(zhì)阻力。由此可見

9、，傳質(zhì)阻力與流動相中組分的擴散和固定相中組分的擴散有關(guān)。由于氣體分子的傳質(zhì)速度特別快，傳質(zhì)阻力對于氣相色譜和液相色譜的影響也是大相徑庭的，與分子擴散的影響相反，它對氣相色譜的影響可以忽略。若要減少液相層析的傳質(zhì)阻力，最好使用顆粒細，且微孔孔徑大的固定相。 4.1.3 層析的基本概念層析的基本概念 1. 固定相：固定相： 固定相是由層析基質(zhì)組成的。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。 2. 流動相：流動相： 在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)向一定方向移動的液體、氣體或

10、超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。3. 分配系數(shù)及遷移率（或比移值）分配系數(shù)及遷移率（或比移值）： 分配系數(shù)是指：在一定的條件下，某一組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用k來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的重要依據(jù)。遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，某一組分在相同的時間內(nèi)，在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用rf來表示。實驗中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標準物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用rx來表示。不同物質(zhì)的分

11、配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。4. 分辨率（或分離度）分辨率（或分離度） 簡言之，分辨率是指相鄰兩個峰的分開程度，是用來判斷相鄰兩組分在層析柱內(nèi)的分離情況的，可以用兩個層析峰保留值之差與兩峰底寬的平均值之比表示。用rs來表示。圖是計算分辨率的示意圖。分辨率： 由上式可見，rs值越大，兩種組分分離的越好。當rs 1時，兩峰總會有部分重疊；當rs = 1時，兩組分具有教好的分離，互相重疊約2%，即每種組分的純度約為98%；當rs=1.5時，兩組分完全能分開，每種組分的純度可達到99.8%。一般而言，

12、rs 0.8標志相鄰兩組分的分離不符合要求，rs=1.5是相鄰兩組分達到完全分離的重要標志。 總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方面的。我們應當根據(jù)實際情況綜合考慮，特別是對于生物大分子，我們還必須考慮它的穩(wěn)定性，活性等問題。如ph值、溫度等都會產(chǎn)生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預期的效果。 5. 正相色譜與反相色譜正相色譜與反相色譜正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。一般來說，正相色譜（或正相柱）用于分離純化極性大的分子（帶電離子等）。反相色譜是指固定相的極性低于

13、流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。一般來說，反相色譜（或反相柱）用于分離純化極性小的有機分子（有機酸、醇、酚等）。 6. 操作容量（或交換容量）操作容量（或交換容量）在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應達到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克來表示，數(shù)值越大，表明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強；否則反之。應當注意，同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的，其受到分子大?。臻g效應）、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等諸多因素的影響。因此，實際操作時，要想能得到有效的分

14、離，樣品的加入量要盡量少些。7. 床體積（床體積（vt）通常床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（vt）。vt是基質(zhì)的外水體積（vo）和內(nèi)水體積（vi）以及自身體積（vg）的總和。即vt= vo + vi + vg。柱床體積vt可以通過加入一定量的水至層析柱預定標記處，然后測量水的體積來測定。8. 洗脫體積（洗脫體積（ve）洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值時的流動相體積。 9. 外水體積（外水體積（vo）外水體積指基質(zhì)顆粒之間體積的總和。外水體積vo可以通過測定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來測定。一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質(zhì)。因為它

15、的分子量大（為200萬），在各種型號的凝膠中都被完全排阻，并且它呈藍色，易于觀察和檢測。10. 內(nèi)水體積（內(nèi)水體積（vi）內(nèi)水體積是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和。11. 基質(zhì)體積（基質(zhì)體積（vg）基質(zhì)體積是指基質(zhì)自身所具有的體積。12. 死時間（死時間（t0）及死體積（）及死體積（v0）流動相中的溶質(zhì)進入層析柱后，不被固定相所吸附，與固定相不發(fā)生任何作用，通過柱所需要的時間，稱為死時間（t0）；通過柱所收集的體積，稱為死體積（v0）。13. 保留時間（保留時間（tr）及保留體積（）及保留體積（vr）自流動性中的某一組分進入層析柱開始到出現(xiàn)該組分峰最高點時，所需要的時間稱為保留時間（tr），所收集的

16、體積稱為保留體積（vr）。4.1.4 層析法的分類層析法的分類 層析根據(jù)不同的標準可以分為多種類型：1. 根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進行層析。柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。2. 根據(jù)流動相的形式分類，層析可以分為液相層析、氣相層析

17、和超臨界層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限制了其在生化領(lǐng)域的應用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。3. 根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)。凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相

18、，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進行分離的一種層析技術(shù)。離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。4.1.5 柱層析的基本裝置及基本操作柱層析的基本裝置及基本操作1. 柱層析的基本裝置柱層析的基本裝置柱層析的設備主要有溶劑池、層析柱、恒流泵、部分收集器、檢測儀和記錄儀。有時還需要梯度混合器等。溶劑池主要用于儲存樣品和作為流動

19、相溶液或溶劑的儲存器。層析柱包括層析介質(zhì)、帶有篩板的玻管和各種接口。恒流泵用以保持一定的操作壓，作為流動相的推動力，以便使樣品和洗脫液以一定的流速通過層析柱。部分收集器收集柱子流出液的裝置，它使每一管按預定的時間或滴數(shù)收集流出液，然后自動移位，下一管再繼續(xù)收集，把整個流出液劃分成許多個部分。檢測儀是用來監(jiān)測通過層析柱的流出液的儀器，主要有紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光率檢測器和電導檢測器等。梯度混合器是有兩個彼此相通的圓筒容器和一個攪拌器組成的。如圖：通過該裝置可以制造出線型梯度、凸型梯度、凹型梯度三種梯度形式。在圖中的a瓶中注入低濃度溶液，在b瓶中注入高濃度溶液，若a1=b1時，則為線型梯

20、度；若a1b1時，則為凹型梯度。如果在a瓶和b瓶中注入的是不同的ph或極性的溶液，同樣也可以得到類似于上述的三種梯度類型。 2. 柱層析的基本操作柱層析的基本操作柱層析的基本操作包括以下一些步驟： 選柱選柱 層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等現(xiàn)象。一般柱長度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:251:100之間。 裝柱裝柱柱子填充質(zhì)量的好與差，是關(guān)系到柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵。一般要求填料

21、在柱內(nèi)顆粒大小分布均勻，松緊一致，填料微孔中無氣泡，不能分層，連接處無死體積，柱床體積穩(wěn)定，在較高的工作壓力下不坍塌變形、流速穩(wěn)定等。否則要重新裝柱。在填充層析柱之前，對所要填充的材料需作一些預處理。可根據(jù)不同的材料作相應的溶脹、漂洗、再生、轉(zhuǎn)型、脫氣等。例如，將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當濃度的酸（0.5n1n）、堿 （0.5n1n）、鹽（0.5m1m）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)，用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈，然后再用酸堿處理得到所需的離子形式，最后再用去離子水（或蒸餾水）洗滌至中性。 層析柱的填充是先關(guān)閉出水口，用溶劑灌注至1/

22、3柱高，并使篩板下的“死體積”不存有氣泡，再將處理好的填充材料緩慢地倒入柱中，以防止氣泡存留在柱內(nèi)，靜置使其沉降，并放出過多的溶劑，為了避免分層，最好一次裝完，如需分幾次填充，則在二次填充前應先在已經(jīng)沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復這個過程，直至裝到需要的高度。用溶劑徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點。最后在床面上鋪一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時擾亂床表面。 平衡平衡 柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的ph和離子強度）平衡柱子。用恒流泵控制其流速（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為23倍柱床體積，以保證平衡后柱子符合填充均勻、松緊一致和沒有氣泡的標準。如果

23、需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。 加樣加樣 加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，加樣體積應低于5%的床體積。對于分析性柱層析，加樣體積不超過床體積的1%。上柱前，應先將樣品溶解在溶劑里或?qū)ο疵撘和肝?，使樣品溶液的濃度盡可能高些，以減少加樣體積，使區(qū)帶狹窄。當然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。 應注意的是：樣品溶液不能有沉淀出現(xiàn)，否則應過濾后再上樣。加樣時應緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊填料，以保持填料表面平坦。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效

24、果。 洗脫洗脫 洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。 簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑進行洗脫，也就是溶劑的種類、濃度、ph等都不變化。如果被分離物質(zhì)的各組分在該溶劑和固定相中的分配系數(shù)較大，采用這種方法是適宜的。 分步洗脫：對層析柱進行洗脫時，當與柱子結(jié)合的一個組分被一種溶劑洗脫后，更換溶劑洗脫下一個組分，一種溶劑洗脫其中一種組分。這種用幾種洗脫能力遞增的溶劑進行逐級洗脫的方法稱為分步洗脫。 梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質(zhì)差異較小時，可以采用逐漸改變?nèi)軇┑男再|(zhì)，形成一個濃度、極性、離子強度或ph值等連續(xù)遞增或遞減的梯度，從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱為梯度洗脫。最常用

25、的是濃度梯度，在水溶液中，亦即離子強度梯度。它的優(yōu)點之一是能夠減少拖尾現(xiàn)象。 由于影響柱層析效果的因素很多，洗脫條件的選擇就尤為重要。在選擇了洗脫方式后，同時還應注意洗脫時的速率。根據(jù)速率理論，我們知道流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。因此，為了獲得滿意的分離結(jié)果，溶劑的流速務必恰當控制。除了洗脫方式、流速以外，還有溫度、壓力等條件的影響?？傊?，我們必須經(jīng)過反復的試驗與調(diào)整，才能得到最佳的洗脫條件。 收集、檢測、合并及保存收集、檢測、合并及保存 洗脫下來的流出液用部分收集器來收集。每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。然后將收集的每管溶液進行濃度或活性測定。根據(jù)測定結(jié)果

26、，即可繪制出洗脫曲線（以管號或洗脫體積為橫坐標，以每管溶液中樣品的濃度或活性為縱坐標）。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進行鑒定。對于是單條帶的，認為已達電泳純，合并在一起。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?柱子的再生柱子的再生 柱層析的許多填料（吸附劑、離子交換樹脂或凝膠等）經(jīng)過適當方法的處理，又恢復其性能，可以反復使用多次，這就稱為柱子的再生。各種填料的再生方法是不同的，詳細操作可參閱操作手冊及有關(guān)文獻。 4.2 凝膠層析凝膠層析 凝膠層析是2

27、0世紀60年代發(fā)展起來的一種簡便有效的生物化學分離分析方法，又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析等。它是以具網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠填料作為固定相，小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部，按分子量大小分離樣品中各個組分的液相色譜方法。1959年，porath和flodin首次將多孔聚合物交聯(lián)葡聚糖凝膠作為柱填料，后來人們將凝膠制成球形微珠，作為分離介質(zhì)，獲得了巨大成功。1964年，moore又制備了具有不同孔徑的交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，能夠進行有機溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動相為有機溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。隨后這一技術(shù)得到不斷的完善和發(fā)展，目前已經(jīng)成為生物化

28、學實驗中不可替代的技術(shù)手段之一。 凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前主要用于生物化學、分子生物學和生物制藥研究和生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化。同時還應用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。它具有設備簡單、操作方便、重復性好、樣品回收率高、條件溫和，特別是不改變樣品生物學活性等優(yōu)點。 4.2.1 凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理 凝膠層析是一種物理的分離純化手段，它是依據(jù)樣品中各組分間分子大小的差異設計的。凝膠層析的填料溶脹后是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球形惰性凝膠顆粒，顆粒的表面和內(nèi)部形成很多孔穴，且孔穴直徑較一

29、致。若樣品中各組分的分子大小不同，樣品進入凝膠層析柱后，各個組分向凝膠顆粒的孔穴內(nèi)擴散，能否進入孔穴內(nèi)部取決于孔穴的大小和組分分子的大小。比孔穴孔徑大的分子不能進入孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔穴之外，只能沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網(wǎng)狀孔通過，隨流動相向下流動，它們在柱內(nèi)遷移的路徑短，停留時間短，保留值小，所以遷移率最快，首先從柱中流出；而分子小的組分則可以完全進入凝膠顆粒內(nèi)部，沿著凝膠顆粒內(nèi)的立體網(wǎng)狀孔穴流過，它們在柱內(nèi)遷移的路徑長，停留時間長，保留值大，所以遷移率最慢，最后從柱中流出；而分子大小介于二者之間的在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們的大小，所以它們流出的時間也介于二者之間，分子越大

30、的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。4.2.2 凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì) 凝膠的種類很多，但能用于凝膠層析的，應具有這樣幾個特征：惰性好，不能與待分離的物質(zhì)發(fā)生化學反應、吸附作用、離子交換作用或親和反應等；耐受性好，在高溫和有機溶劑的作用下，不發(fā)生變形；剛性好，應具有一定機械強度，能承受一定的操作壓力。常用的凝膠主要有葡聚糖凝膠（dextran）、聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide）、瓊脂糖凝膠（agarose）以及聚丙烯酰胺和瓊脂糖之間的交聯(lián)物。另外還有多孔玻璃珠、多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等等

31、。下面將分別介紹。 1. 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與交聯(lián)劑相互交聯(lián)而成的凝膠。葡聚糖凝膠主要由pharmacia biotech生產(chǎn)。常見的有兩大類，商品名分別為sephadex和sephacryl。sephadex又可分為g型和lh型兩類。葡聚糖凝膠中最常見的是sephadex g系列，它是葡聚糖與3氯1,2環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑）以醚鍵相互交聯(lián)而成。結(jié)構(gòu)式圖！葡聚糖凝膠的交聯(lián)程度（簡稱交聯(lián)度）由環(huán)氧氯丙烷的百分比控制，它與凝膠顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑的大小有直接關(guān)系，交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越小，分離的分子量越?。环粗宦?lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑越大，分離的分子量越大。 sepha

32、dex g的主要型號是g-10 g-200，型號不同，交聯(lián)度也不同，分離相對分子質(zhì)量的范圍就不同，這就是所謂的分級分離。例如sephadex g-75對球形蛋白的分級分離范圍為3,00070,000，它表示分子量在這個范圍內(nèi)的球形蛋白可以通過sephadex g-75得到較好的分離。sephadex g后面的數(shù)字除以10表示該凝膠的吸水率（吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，不包括顆粒間吸附的水份。單位是ml / g干膠）。如sephadex g-50，表示吸水率是5ml/g干膠。葡聚糖凝膠是不溶于有機溶劑和水的聚合物，但其結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基，因此，sephadex g的親水性很好，

33、能迅速在水中和電解質(zhì)溶液中溶脹，層析過程中與水溶性溶質(zhì)接觸非常容易。不同型號的sephadex g的吸水率不同，分級分離范圍也不同。數(shù)字越大的，分級分離范圍越大，排阻極限也越大。 排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。它代表該凝膠能有效分離的最大分子量，大于它的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如sephadex g-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。sephadex g中排阻極限最大的g-200為6105。sephadex g在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復使用

34、。sephadex g穩(wěn)定工作的ph一般為為210。強酸溶液和氧化劑會使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免sephadex g與強酸和氧化劑接觸。sephadex g在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100 c下40 min對凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。 sephadex g由于含有羥基基團，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團（尤其是堿性蛋白）發(fā)生吸附作用。但一般在離子強度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。所以在用sephadex g進行凝膠層析實驗時常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免sephadex g與蛋白發(fā)生吸附，但應注意如果鹽濃度過高，會引起凝膠柱床

35、體積發(fā)生較大的變化。sephadex g有各種顆粒大?。ㄒ话阌写?、中、細、超細）可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差；細顆粒流速慢，但分辨率高。要根據(jù)分離要求來選擇顆粒大小。sephadex g的機械穩(wěn)定性相對較差，它不耐壓，分辨率高的細顆粒要求流速較慢，所以不能實現(xiàn)快速而高效的分離。 另外，sephadex g-25和g-50中分別加入羥丙基基團反應，形成lh型烷基化葡聚糖凝膠。lh型葡聚糖凝膠與g型葡聚糖凝膠相比較區(qū)別在于：一般以g型葡聚糖凝膠（經(jīng)水溶液溶脹）作為固定相，以水溶液作為流動項，對水溶性物質(zhì)進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠過濾層析。而以lh型葡聚糖凝膠（經(jīng)乙醇或二甲亞砜甲酰

36、胺或n、n-二甲基甲酰胺等有機溶劑溶脹）作為固定相，以有機溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進行分離的層析方法稱為葡聚糖凝膠滲透層析。lh型葡聚糖凝膠的主要型號為sephadex lh-20和lh-60，適用于分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。 sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（n, n-methylene bisacrylamide）交聯(lián)而成。是一種硬性凝膠。sephacryl與sephadex相比有很多優(yōu)點：其一，它的化學和機械穩(wěn)定性更高，sephacryl在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可用各種去污劑（如sds）、6mol/l鹽酸胍或8mol/l尿素等作為洗脫液；其二

37、，耐高溫，在120消毒（ph7.0時）處理后，層析性質(zhì)沒有明顯變化；其三，sephacryl穩(wěn)定工作的ph一般為211，在0.2mol/l naoh溶液中（室溫）處理100小時，其低流速和多孔性沒有明顯影響；其四，sephacryl的機械性能較好，比較耐壓，可以用較高的流速洗脫，分辨率也較高；其五，它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達到108，遠遠大于sephadex的范圍。所以它不僅可以用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至是質(zhì)粒、大的病毒顆粒（直徑300-400nm）。 2. 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠是以丙烯酰胺（acrylamide，簡稱acr）為單體，甲叉雙丙烯

38、酰胺（n, n-methylene bisacrylamide，簡稱bis）為交聯(lián)劑，在過硫酸銨-temed（四甲基已二胺）或核黃素-temed催化劑的作用下交聯(lián)而成。通過控制丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的比例，就可以得到不同交聯(lián)度的聚丙烯酰胺凝膠。最常用的聚丙烯酰胺凝膠層析介質(zhì)是由bio-rad laboratories生產(chǎn)的商品名為bio-gel p的系列產(chǎn)品，主要型號有bio-gel p-2 bio-gel p-300等10種，后面的數(shù)字103基本代表它們的排阻極限，排阻極限最大的bio-gel p-300為3105。所以數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越小，凝膠孔徑越大，分級分離的范圍也就越大，反之亦

39、然。 聚丙烯酰胺凝膠的分級分離范圍、吸水率等性能，在水溶液、一般的有機溶液、鹽溶液中的穩(wěn)定性等基本近似于sephadex。聚丙烯酰胺凝膠在酸中的穩(wěn)定性比sephadex好，在ph為110之間比較穩(wěn)定。但在較強的堿性或較高的溫度條件下不如sephadex穩(wěn)定，易發(fā)生分解。另外，聚丙烯酰胺凝膠是一種化學合成的凝膠，不會象葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠那樣可能生長微生物。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族、酸性、堿性化合物稍有吸附作用，如使用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病就可以克服。 3. 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠 瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖。瓊脂由中性鏈狀的瓊脂糖和帶負電荷的含磺酸基和羧基的瓊脂膠兩部分組成

40、。其制備過程就是去除瓊脂膠留下瓊脂糖。瓊脂糖是由d半乳糖和3,6脫水半乳糖交替構(gòu)成的鏈狀多糖。它在100 c時呈液態(tài)，當溫度降至45 c以下時，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的商品名因生產(chǎn)廠家不同而異，常見的主要有瑞典的sepharose系列、美國的bio-gel a系列、英國的sagavac系列、丹麥的gelarose系列和我國的qt系列等。在sepharose b系列產(chǎn)品中，b前面的數(shù)字表示瓊脂糖的百分比濃度，例如sepharose 6b表示瓊脂糖的濃度為6%， b前面的數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分級分離的范圍也就越小，

41、反之亦然。 瓊脂糖凝膠的穩(wěn)定性要超過一般的葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。它在室溫下保存是很穩(wěn)定的，工作在ph 49之間是穩(wěn)定的，另外瓊脂糖凝膠的機械強度和孔穴的穩(wěn)定性都很好，在高鹽濃度下，柱床體積一般不會發(fā)生明顯變化，因此，使用瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)洗脫速度可以更快。瓊脂糖凝膠對樣品的吸附作用很小，排阻極限卻很大，分離范圍更廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。瓊脂糖凝膠不耐高溫，使用溫度以030 c為宜。 sepharose與1,3二溴異丙醇反應，形成sepharose cl型交聯(lián)凝膠，交聯(lián)前后的分離性能沒有改變，只是熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性都有所提高，可以在更廣泛的ph范圍內(nèi)應用，穩(wěn)定工作的ph范

42、圍為313。sepharose cl型凝膠還特別適合于含有有機溶劑的分離。 4. 聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠聚丙烯酰胺和瓊脂糖交聯(lián)凝膠 該凝膠是利用交聯(lián)的聚丙烯酰胺作為三維空間骨架，再用瓊脂糖嵌入其內(nèi)部組成的混合型凝膠。這樣制成的凝膠剛性好，孔徑大，理化性質(zhì)介于兩者之間。它們主要由lkb提供的 ultrol gel aca系列，aca后面的數(shù)字分別表示聚丙烯酰胺和瓊脂糖的百分比濃度，例如ultrol gel aca34表示聚丙烯酰胺的百分比濃度是3%，同時瓊脂糖的百分比濃度是4%，數(shù)字越大，表示交聯(lián)度越大，凝膠孔徑越小，分級分離的范圍也就越小，反之亦然。 5. 多孔硅膠、多孔玻璃珠多孔硅膠、多

43、孔玻璃珠 顧名思義，它們就是將硅膠或玻璃制成具有一定直徑的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)的球形顆粒。多孔硅膠和多孔玻璃珠都屬于硬質(zhì)無機凝膠。它們的最大的特點是機械強度很高、化學穩(wěn)定性好，使用方便而且壽命長，在較高的層析流速下，分辨率并不受影響。最大缺點是吸附效應較強（尤其是多孔硅膠），可能會吸附比較多的蛋白，但可以通過表面處理和選擇洗脫液來降低吸附。另外它們也不能用于強堿性溶液，一般使用時ph應小于8.5。多孔硅膠和多孔玻璃珠的分離范圍都比較寬，多孔硅膠一般為1025106，多孔玻璃珠一般為31039106。 除了上述5類凝膠外，由于近年來各類凝膠技術(shù)發(fā)展得很快，目前已研制出很多性能優(yōu)越的新型凝膠。例如pharm

44、acia biotech的superdex（由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成）和superrose（高交聯(lián)度多孔瓊脂糖珠）。其它關(guān)于各種凝膠產(chǎn)品的詳細情況可以參閱各個公司的產(chǎn)品目錄。 4.2.3 凝膠層析操作的具體問題凝膠層析操作的具體問題 1. 凝膠的選擇凝膠的選擇 選擇凝膠時，首先要確定是組分分離還是組別分離。所謂組別分離是指分離那些相對分子質(zhì)量之間相差很大的樣品。例如蛋白樣品的脫鹽或蛋白、核酸溶液去除小分子雜質(zhì)以及一些注射劑去除大分子熱源物質(zhì)等等，它們之間的相對分子質(zhì)量相差數(shù)十至數(shù)百倍，應選用能將大分子完全排阻而小分子完全滲透的凝膠，一般交聯(lián)度較大的凝膠層析介質(zhì)分離效果好，比如，

45、葡聚糖凝膠sephadex g-25或聚丙烯酰胺凝膠bio-gel p-6等。所謂組分分離則是指分離那些相對分子質(zhì)量之間相差較小的樣品。在進行組分分離時，要大概知道樣品各組分的相對分子質(zhì)量的最大最小值才能選擇凝膠的型號，例如分離相對分子質(zhì)量在5000100000之間的混合樣品，選擇凝膠的分離范圍應正好包括所需的各個組分的相對分子質(zhì)量，比如，葡聚糖凝膠sephadex g-100等。因為分離范圍選擇過小，則某些組分不能得到分離；分離范圍選擇過大，則分辨率較低，分離效果不好。選擇凝膠時，其次要選擇凝膠顆粒的粒度。所謂粒度就是凝膠顆粒的大小，而與交聯(lián)度無關(guān)。粒度小，外水體積也小，裝柱易均勻，層析時渦

46、旋擴散影響小，分辨率高，但流速慢；粒度大，外水體積也大，裝柱不易均勻，層析時渦旋擴散影響較大，分辨率低，但流速快。選擇時要依據(jù)分離的具體情況而定，例如進行組別分離時，則可以選用粒度大的凝膠，很快達到分離的目的；進行組分分離時，則要選用粒度小的凝膠以提高分辨率。 2. 凝膠的預處理凝膠的預處理選擇好凝膠的類型和層析柱后，根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度，按下面的公式估算出凝膠的用量。干膠用量（g）柱床體積（ml）/ 膨脹度（ml / g）。由于處理凝膠過程中可能有一定損失，所以用此公式計算出的干凝膠用量還需再增加1020。 將稱取的干凝膠放在蒸餾水中溶脹，所需的溶脹時間依據(jù)不同類型凝膠的產(chǎn)品說明

47、。如果加熱煮沸，則溶脹時間會大大縮短，一般在15小時即可完成，而且煮沸也可以去除凝膠顆粒中的氣泡。但必須避免在酸或堿中加熱，以免凝膠被破壞。溶脹處理后，要對凝膠進行反復漂洗，傾瀉去除表面的雜質(zhì)和不均一的粒度過小的凝膠。然后用0.5mol/l naoh-0.5mol/l nacl浸泡半個小時，再用水洗至中性。為了除去凝膠顆粒中的氣泡，可以通過抽氣或加熱煮沸的方法實現(xiàn)，否則會影響分離效果。多孔玻璃珠和多孔硅膠不需溶脹處理。 3. 凝膠的再生和保存凝膠的再生和保存對于剛使用的新凝膠柱子，只需洗滌后重新平衡，即可再生。對于使用多次的凝膠柱子，需要將凝膠取出，按預處理的方法用酸或減處理后，重新裝柱即可再

48、生。使用過的凝膠，若要短時間保存，一般是反復洗滌去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后加入適當?shù)目咕鷦?，例如?.02的疊氮化鈉、0.01%0.02%三氯丁醇、0.005%0.01%乙基汞硫代水楊酸鈉、0.001%0.01%苯基汞代乙酸鹽、苯基汞代硝酸鹽或苯基汞代硼酸鹽等，4 c下保存。若在較長的時間內(nèi)不再使用，溶液中的凝膠容易長細菌，使其化學性質(zhì)發(fā)生某些變化，如發(fā)生氧化、離子化等，因此，需將其干燥保存。首先要將凝膠進行洗滌，以除去凝膠表面的污染物，然后將凝膠放在濃度由低到高的乙醇中逐級脫水（30%、50%、70%、80%、95%、無水乙醇），最后是乙醚，脫水后的凝膠在室溫下晾干，或置于60 c烘箱中烘干，將

49、乙醚揮發(fā)干，即可裝瓶保存。注意溶脹的凝膠不能直接高溫烘干，否則可能會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。 4. 洗脫液的選擇洗脫液的選擇凝膠層析所使用的洗脫液比較簡單，只是起運載工具的作用，不依賴于洗脫液性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，一般只使用一種緩沖液。洗脫液另一個的目的是為了消除組分與固定相的吸附等作用。一般來說，洗脫液的選擇只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 5. 加樣量加樣量加樣量也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，實驗效率低。一般來說，加樣量越少，或加樣體積越小，分辨率越高。凝膠柱較大，加樣量就可以較大；