第十章高效液相色譜法ppt課件

1、第十章第十章高效液相色譜法高效液相色譜法第一節(jié)第一節(jié) 固定相和流動相固定相和流動相第二節(jié)第二節(jié) 高效液相色譜儀高效液相色譜儀第三節(jié)第三節(jié) 液液- -固色譜法固色譜法第四節(jié)第四節(jié) 化學鍵合相色譜化學鍵合相色譜法法第五節(jié)第五節(jié) 離子交換色譜法離子交換色譜法第六節(jié)第六節(jié) 尺寸排阻色譜法尺寸排阻色譜法第七節(jié)第七節(jié) 分別方式的選擇分別方式的選擇及運用及運用 high performance liquid chromatograph,HPLC色譜法分類表示圖色譜液相色譜柱色譜紙色譜薄層色譜高高效效液液相相色色譜譜H HP PL LC C氣相色譜概述 高效液相色譜法是在氣相色譜和經(jīng)典液相色譜的根底上70年代

2、初期開展起來的一種以液體做流動相的新色譜技術。 現(xiàn)代液相色譜和經(jīng)典液相色譜沒有本質的區(qū)別。不同點僅僅是現(xiàn)代液相色譜比經(jīng)典液相色譜有較高的效率 和實現(xiàn)了自動化 操作。經(jīng)典的液相色譜法，流動相在常壓下保送，所用的固定相柱效低，分析周期長。而現(xiàn)代液相色譜法援用了氣相色譜的實際，流動相改為高壓保送最高保送壓力可達4.9107Pa；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進展延續(xù)檢測。因此，高效液相色譜具有分析速度快、分別效能高、自動化等特點。所以人們稱它為高壓、高速、高效或現(xiàn)代液相色譜法。一、一、HP

3、LC與經(jīng)典與經(jīng)典LC區(qū)別區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1經(jīng)典LC：僅做為一種分別手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓保送流動相 柱效低H，n 分析周期長 無法在線檢測2HPLC：分別和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定相粒徑17% 分配色譜 硅膠失活載體 吸附的水固定液第四節(jié)第四節(jié) 化學鍵合相色譜法化學鍵合相色譜法一、概述一、概述二、化學鍵合相二、化學鍵合相三、反相鍵合相色三、反相鍵合相色譜法譜法四、正相鍵合相色四、正相鍵合相色譜法譜法一、概述一、概述 將固定液機械地涂漬在擔體上組成固定相。雖然選用與固定液不互溶的溶劑作流動相，但在色譜過程中固定液仍會有微量溶解。以及

4、流動相經(jīng)過色譜柱的機械沖擊，固定相會不斷流失，即使將流動相預先用固定相液體飽和或在色譜柱前加一個前置柱，使流動相先經(jīng)過前置柱，再進入色譜柱，但仍難以完全防止固定液的流失。 續(xù)前 70年代初開展了一種新型的固定相化學鍵合固定相。這種固定相是經(jīng)過化學反響把各種不同的有機基團鍵合到硅膠載體外表的游離羥基上，替代機械涂漬的液體固定相。這不僅防止了液體固定相流失的困擾，還大大改善了固定相的功能，提高了分別的選擇性，化學鍵合色譜適用于分別幾乎一切類型的化合物。 根據(jù)鍵合相與流動相之間相對極性的強弱，可將鍵合相色譜分為極性鍵合相色譜和非極性鍵合相色譜。在極性鍵合相色譜中，由于流動相的極性比固定相極性要小，所

5、以極性鍵合相色譜屬于正相色譜。弱極性鍵合相既可作為正相色譜，也可作為反相色譜。但通常所說的反相色譜系指非極性鍵合色譜。反相色譜在現(xiàn)代液相色譜中運用最為廣泛。二、化學鍵合相二、化學鍵合相 化學鍵合固定相普通都采用化學鍵合固定相普通都采用硅膠薄殼型或全多孔微粒型硅膠薄殼型或全多孔微粒型為基體。在鍵合反響之前，要為基體。在鍵合反響之前，要對硅膠進展酸洗、中和、枯燥對硅膠進展酸洗、中和、枯燥活化等處置，然后再使硅膠外活化等處置，然后再使硅膠外表上的硅羥基與各種有機物或表上的硅羥基與各種有機物或有機硅化合物起反響，制備化有機硅化合物起反響，制備化學鍵合固定相。學鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：A 硅酸

6、酯型=Si-O-C=鍵合相 將醇與硅膠外表的羥基進展酯化反響，在硅膠外表構成=Si-O-C=鍵合相。反響生成單分子層鍵合相。普通用極性小的溶劑洗脫，分別極性化合物。B 硅氮型=Si-N=鍵合相 假設用SOCl2將硅膠外表的羥基先轉化成鹵素氯化，再與各種有機胺反響，可以得到各種不同極性基因的鍵合相?？捎梅菢O性或強極性的溶劑作為流動相。C 硅碳型硅碳型=Si-C=鍵合相鍵合相 將硅膠外表氯化后，使將硅膠外表氯化后，使Si-Cl鍵轉化為鍵轉化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機基團直鍵。在這類固定相中，有機基團直接鍵合在硅膠外表上。接鍵合在硅膠外表上。D 硅氧烷型硅氧烷型=Si-O-Si-C=鍵合相鍵

7、合相 將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反將硅膠與有機氯硅烷或烷氧基硅烷反響制備。這類鍵合相具有相當?shù)哪蜔嵝皂懼苽?。這類鍵合相具有相當?shù)哪蜔嵝院突瘜W穩(wěn)定性，是目前運用最為廣泛的和化學穩(wěn)定性，是目前運用最為廣泛的鍵合相。鍵合相。三、反相鍵合相色譜法三、反相鍵合相色譜法 在反相色譜中，普通采用非極性在反相色譜中，普通采用非極性鍵合固定相，如硅膠鍵合固定相，如硅膠-C18H37簡稱簡稱O D S或或C18硅膠硅膠-苯基等，用強極苯基等，用強極性的溶劑為流動相，如甲醇性的溶劑為流動相，如甲醇/水，乙水，乙腈腈/水，水和無機鹽的緩沖液等。水，水和無機鹽的緩沖液等。 目前，對于反相色譜的保管機制目前，對于反相

8、色譜的保管機制還沒有一致的看法，大致有兩種觀念：還沒有一致的看法，大致有兩種觀念：一種以為屬于分配色譜，另一種以為一種以為屬于分配色譜，另一種以為屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，屬于吸附色譜。在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的組分極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。后流出。 分配色譜的作用機制是假設混合分配色譜的作用機制是假設混合溶劑水溶劑水+有機溶劑中極性弱的有有機溶劑中極性弱的有機溶劑吸附于非極性烷基配合基外表，機溶劑吸附于非極性烷基配合基外表，組分分子在流動相中與被非極性烷基組分分子在流動相中與被非極性烷基配合基所吸附的液相中進展分配。配合基所吸附的液相中進展分配。

9、吸附色譜的作用機制是把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠外表上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛，這種“分子毛有強的疏水特性。當用水與有機溶劑所組成的極性溶劑為流動相來分別有機化合物時，一方面，非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會從水中被“擠出來，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締協(xié)作用。另一方面，被分別物的極性部分遭到極性流動相的作用，使它分開固定相，減少保管值，此即解締過程。顯然，這兩種作用力之差，決議了分子在色譜中的保管行為。 普通地，固定相的烷基配合基或分別分子中非極性部分的外表積越大，或者流動相外表張力及介電常數(shù)越大，那么締協(xié)作用越強，分配比也越大，保管值越大。 四

10、、正相鍵合色譜法四、正相鍵合色譜法 在正相色譜中，普通采用極性鍵合固定相，硅在正相色譜中，普通采用極性鍵合固定相，硅膠外表鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的稱號由膠外表鍵合的是極性的有機基團，鍵合相的稱號由鍵合上去的基團而定。最常用的有氰基鍵合上去的基團而定。最常用的有氰基-C N、氨基氨基-NH2、二醇基、二醇基DIOL鍵合相。流動相鍵合相。流動相普通用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，普通用比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機溶劑，如烴類溶劑，或其中參與一定量的極性溶劑如氯如烴類溶劑，或其中參與一定量的極性溶劑如氯仿、醇、乙腈等，以調(diào)理流動相的洗脫強度。通仿、醇、乙腈等，以調(diào)理流動相的洗

11、脫強度。通常用于分別極性化合物。常用于分別極性化合物。 普通以為正相色譜的分別機制屬于分配色譜。組分的分配比k值，隨其極性的添加而增大，但隨流動相中極性調(diào)理劑的極性增大或濃度增大而降低。同時，極性鍵合相的極性越大，組分的保管值越大。 該法主要用于分別異構體，極性不同的化合物，特別是用來分別不同類型的化合物?；瘜W鍵合色譜具有以下優(yōu)點：化學鍵合色譜具有以下優(yōu)點： A. 適用于分別幾乎一切類型的化合物。一方面經(jīng)過控適用于分別幾乎一切類型的化合物。一方面經(jīng)過控制化學鍵合反響，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠制化學鍵合反響，可以把不同的有機基團鍵合到硅膠外表上，從而大大提高了分別的選擇性；另一方面可外表上

12、，從而大大提高了分別的選擇性；另一方面可以經(jīng)過改動流動相的組成符合種類來有效地分別非極以經(jīng)過改動流動相的組成符合種類來有效地分別非極性、極性和離子型化合物。性、極性和離子型化合物。 B. 由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這由于鍵合到載體上的基團不易被剪切而流失，這不僅處理了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適不僅處理了由于固定液流失所帶來的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復雜體系的分別發(fā)明了條件。合于梯度洗脫，為復雜體系的分別發(fā)明了條件。續(xù)前C. 鍵合固定相對不太強的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。D. 固定相柱效高，運用壽命長，分析重現(xiàn)性好。1分別機制：利用組分在兩相

13、中溶解度的差別2固定相：載體+固定液物理或機械涂漬法 缺陷：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不適用 固定液極性NLLC 固定液非極性RLLC3正相色譜固定液極性 流動相極性NLLC 極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱 適于分別極性組分 反相色譜固定液極性 固定相極性 底劑 + 有機調(diào)理劑極性調(diào)理劑 例：水 + 甲醇，乙腈，THF4流動相極性與k的關系： 流動相極性，洗脫才干，k，組分tR5出柱順序：極性大的組分先出柱 極性小的組分后出柱6適用：非極性中等極性組分HPLC80%問題三正相鍵合相色譜三正相鍵合相色譜1分別機制：溶質分子與固定相之間定向作用力、 誘導力、或氫鍵作用力2固定相：極性大的氰基

14、或氨基鍵合相3流動相：極性小同LSC 底劑 + 有機極性調(diào)理劑 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4流動相極性與k的關系： 流動相極性，洗脫才干，組分tR，k5出柱順序：構造相近組分，極性小的組分先 出柱極性大的組分后出柱6適用： 氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性類似極性稍小 分別物質也類似 氨基鍵合相與硅膠性質差別大，堿性 分析極性大物質、糖類等第五節(jié)第五節(jié) 離子交換色譜法離子交換色譜法一、原理一、原理二、固定相二、固定相三、流動相三、流動相四、離子色譜法四、離子色譜法ion-exchange chromatograph 離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術的結合來測定溶液中陽離子和

15、陰離子的一種分別分析方法。凡在溶液中可以電離的物質，通常都可用離子交換色譜法進展分別。它不僅適用無機離子混合物的分別，亦可用于有機物的分別，例如氨基酸、核酸、蛋白質等生物大分子，因此運用范圍較廣。 一、原理一、原理 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實現(xiàn)分別的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團和可游離的平衡離子。當待分析物質電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進展可逆交換，其交換反響通式如下： 陽離子交換： RSO3-H+M+RSO3-M+ H+陰離子交換： RNR3+Cl-+X-RNR3+X-+ Cl-普通方式： R一AB RBA對于陽離子交換

16、樹脂，一價離子的選擇性順序為： Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價離子的順序為： Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對于陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序為： ClO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOF二、固定相 作為固定相的離子交換劑，其基質大致有三大類：合成樹脂聚苯乙烯、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強弱之分見下表表表10- 2 離子交換劑上的官能基離子交換劑上的官能基 常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種： 1. 多孔

17、型離子交換樹脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為520m，有微孔型和大孔型之分2. 薄膜型離子交換樹脂 它是在直徑約為30m的固體情性核上，凝聚12m厚的樹脂層。3. 外表多孔型離子交換樹脂 它是在固體情性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹脂。4. 離子交換鍵合固定相 它是用化學反響將離子交換基團鍵合到惰性載體外表。它也分為兩種類型。一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點是機械性能穩(wěn)定，可運用小粒度固定相和高柱壓來實現(xiàn)快速分別。 三、流動相三、流動相 離子交換色譜法所用流

18、動相大都是一定pH和鹽濃度或離子強度的緩沖溶液。經(jīng)過改動流動相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改動選擇性。假設添加鹽離子的濃度，那么可降低樣品離子的競爭吸附才干，從而降低其在固定相上的保管值。 關于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分別有機酸和有機堿時，這些酸堿的離解程度可經(jīng)過改動流動相的pH值來控制。增大pH值會使酸的電離度添加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結果相反。但無論屬于哪種情況，只需電離度增大，就會使樣品的保管值增大。 四、離子色譜法 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分別方法。 離子交換色譜法在無機離子的分析和運用遭到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的

19、被測離子，如采用電導檢測器，由于被測離子的電導信號被強電解質流動相的高背景電導信號淹沒而無法檢測。為理處理這一問題，1975年Small等人提出一種能同時測定多種無機和有機離子的新技術：續(xù)前 他們在離子交換分別柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分別柱電荷相反的離子交換樹脂。經(jīng)過分別柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導的流動相轉變成低背景電導的流動相，從而用電導檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術稱為離子色譜。假設樣品為陽離子，用無機酸作流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換劑。當試樣經(jīng)陽離子交換劑的分別柱后，隨流動相進入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個重要反響： R+OHH+Cl- R+

20、Cl十H2O R+一OH-M+Cl-M+OHR+Cl- 由反響可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉變?yōu)殡妼Ш苄〉乃?，消除了流動相本底電導的影響。同時，又將樣品陽離子M+轉變成相應的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測陽離子電導的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有類似的作用機理。 續(xù)前 在分別柱后加一個抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在經(jīng)過抑制柱后會加寬，降低了分別度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導率極低的溶液，例如110-4510-4molL-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑

21、制型離子色譜或單柱離子色譜。1.1.離子色譜法原理離子色譜法原理 離子色譜原理，與傳統(tǒng)離子交離子色譜原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點：換的不同點：采用交換容量非常低的特制離子交采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；換樹脂為固定相；細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓細顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；輸液泵；低濃度淋洗液或本底電導抑制在分別柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導；可采用電導檢測器，快速分別分析微量無機離子混合物；各種抑制安裝及無抑制方法的出現(xiàn)，開展迅速。2.2.離子色譜具有以下優(yōu)點離子色譜具有以下優(yōu)點1 1分析速度快分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個試樣的分析

22、；個試樣的分析；2 2分別才干高分別才干高 在適宜的條件下，可使在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物常見的各種陰離子混合物分別；例：運用雙柱法，分別；例：運用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分別。陰離子完全分別。3分別混合陰離子的最有效方法分別混合陰離子的最有效方法4耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱3. 離子色譜法安裝：第六節(jié)第六節(jié) 尺寸排阻色譜法尺寸排阻色譜法一、原理一、原理二、固定相二、固定相三、流動相三、流動相size- exclusion chromatograph 尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的

23、分別。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機理，而是基于試樣分子的尺寸和外形不同來實現(xiàn)分別的。 尺寸排阻色譜具有其他液相色譜所沒有的特點： 1保管時間是分子尺寸的函數(shù)，有能夠提供分子構造的某些信息。(2)保管時間短，譜峰窄，易檢測，可采用靈敏度較低的檢測器。3固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強保管分子，因此柱壽命長。4不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質量差別必需大于10才干得以分別。一、原理 尺寸排阻色譜是按分子大小順序進展分別的一種色譜方法。其固定相為化學惰性多孔物質凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不

24、能浸透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來；中等體積的分子部分浸透；小分子可完全浸透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。這樣，樣品分子根本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其浸透過程模型見圖20-7。 二、固定相 排阻色譜固定相種類很多，普通可分為軟性、半剛性和剛性凝膠三類。 所謂凝膠，指含有大量液體普通是水的柔軟而富于彈性的物質，它是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀構造的多聚體。 1. 軟性凝膠 如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠都具有較小的交聯(lián)構造，其微孔能吸入大量的溶劑，并能溶脹到它們干體的許多倍。它們適用以水溶性溶劑作流動相，普通用于小分子質量物質的分析，不適宜用在高效液相色譜中。 2. 半剛性凝膠 如高交聯(lián)度的

25、聚苯乙烯Styragel比軟性凝膠稍耐壓，溶脹性不如軟性凝膠。常以有機溶劑作流動相。用于高效液相色譜時，流速不宜大。3. 剛性凝膠 如多孔硅膠、多孔玻璃等；它們既可用水溶性溶劑，又可用有機溶劑作流動相，可在較高壓強和較高流速下操作。普通控制壓強小于7MPa，流速1cm3s-1；否那么將影響凝膠孔徑，呵斥不良分別。三、流動相 排阻色譜所選用的流動相必需能溶解樣品，并必需與凝膠本身非常類似，這樣才干潤濕凝膠。當采用軟性凝膠時，溶劑也必需能溶脹凝膠。另外，溶劑的粘度要小，因為高粘度溶劑往往限制分子分散作用而影響分別效果。這對于具有低分散系數(shù)的大分子物質分別，尤需留意。選擇溶劑還必需與檢測器相匹配。常

26、用的流動相有四氫呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液為流動相的凝膠色譜適用于水溶性樣品， 以有機溶劑為流動相的凝膠色譜適用于非水溶性樣品。第七節(jié)第七節(jié) 分別方式的選擇及運分別方式的選擇及運用用 choice of choice of separation types separation types and applacations and applacations of HPLC of HPLC 一、相對分子質量一、相對分子質量二、溶解度二、溶解度三、化學構造三、化學構造四、運用四、運用色譜分別類型的選擇 要正確地選擇色譜分別方法，首先必需盡能夠多的 了解樣品的有關性質，其次必需熟習各種色譜方法的主要特點及其運用范圍。 選擇色譜分別