病毒感染細(xì)胞試驗(yàn)整體流程及原理本

1、病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞,常用的手段是將目的基因包裝成病毒來(lái)感染細(xì)胞,從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求.1、病毒的種類病毒有很多種,常見(jiàn)的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒Lentivirus是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種.構(gòu)建的siRNA/miRNA慢病毒載體,與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通siRNA載體相比,一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用,另一方面,Lentivirus-siRNA克隆經(jīng)過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后,可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞,并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞

2、的基因組,進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá).1.1.2 特點(diǎn)1直接包裝成為假病毒顆粒,對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用,適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比方神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞.2可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式,在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株.3可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究.4無(wú)需任何轉(zhuǎn)染試劑,操作簡(jiǎn)便.5可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記.1.1.3 慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：1含有目的基因的慢病毒RNAi干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取.2慢病毒載體,包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等.3培養(yǎng)48hrs-72hrs左右,收集含有病毒的上清培養(yǎng)液.4病毒的純化和濃縮.5分裝、-80C保存

3、.6滴度測(cè)定目的基因檢定,并出具檢測(cè)報(bào)告.1.2、 腺病毒1.2.1 原理腺病毒Adenovirus,Ad是一種無(wú)包膜的線狀雙鏈DNA病毒,其復(fù)制不依賴于宿主細(xì)胞的分裂.有近50個(gè)血清型,大多數(shù)Ad載體都是基于血清型2和5,通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的復(fù)制水平.這些重組病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制,因此是一種適用于治療的高效限制系統(tǒng).1.2.2 特點(diǎn)1幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞2可以獲得復(fù)制缺陷型E1和E3缺失的腺病毒3病毒滴度高,產(chǎn)生病毒經(jīng)過(guò)濃縮后可以到達(dá)1012PFU/mL,能有效的進(jìn)行增殖.4腺病毒載體感染宿主的范圍比擬廣,制備容易,操作簡(jiǎn)單5感染細(xì)胞時(shí)

4、,不整合到染色體中,不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn),生物平安性Wj.1.2.3 腺病毒包裝簡(jiǎn)要流程1構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA的腺病毒載體2采用PacI消化純化的質(zhì)粒.3消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液.4將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒.5分裝,-80C保存.1.3、慢病毒和腺病毒的比擬慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比擬病是表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)Lentivirus腺病毒表達(dá)系統(tǒng)Adenovirus病是基因組RNA雙鏈DNA復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組,長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組外,瞬時(shí)表達(dá)外源基

5、因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞,適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)局水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢1-3天快1-2天滴度滴度最高可達(dá)10*8pfU/ml滴度最高可達(dá)10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過(guò)8kb的外源片段,滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入高達(dá)8kb的外源片段,滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體2.1構(gòu)建手段一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案,有以下兩種手段.1)如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn),采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段,回收并連接到載體,酶切,并測(cè)序鑒定2)如果沒(méi)有匹配的酶切位點(diǎn),那么設(shè)計(jì)

6、帶有特殊接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到目的片段,采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段,回收并連接到穿梭載體,酶切,并測(cè)序鑒定2.2質(zhì)粒載體2.2.1 概念能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu),包括真核生物的細(xì)胞器(主要指線粒體和葉綠體)中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸(DNA)分子2.2.2 特征質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因,例如,四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等.有些質(zhì)粒稱為附加體(episome),這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體,也能從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的DNA分子.質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制.通過(guò)個(gè)些特性,人們可以把一些目的DNA片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中,通過(guò)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中

7、,利用選擇培養(yǎng)基來(lái)篩選從而不斷的復(fù)制,來(lái)得到目的產(chǎn)物.3、質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增,然后提取質(zhì)粒,以下是質(zhì)粒DNA在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟.3.1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中,37c振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.2取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40mlLB液體培養(yǎng)基中,37c振蕩培養(yǎng)23h3菌液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中,冰上放置10min44c離心10min4000r/min5倒出培養(yǎng)液,將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細(xì)胞沉淀,立即冰浴30min1.1 4c離心1

8、0min4000r/min8倒出上清液,用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細(xì)胞冰上放置9分裝細(xì)胞,200ul一份,4c保存1.2 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化1取200ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞,參加質(zhì)粒DNA2ul混勻,冰浴30min2離心管放到42c保溫90s3冰浴2min4每管加800ulLB液體培養(yǎng)基,37c培養(yǎng)1h150r/min5取適當(dāng)體積100ul的復(fù)蘇細(xì)胞,涂布在選擇性培養(yǎng)基上,正置30min6倒置平皿37C,1216h,出現(xiàn)菌落1.3 質(zhì)粒提取步驟1取14ml在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液,12000轉(zhuǎn)離心1min,棄上清2加250ul溶液I/RNaseA溶液I為細(xì)胞懸浮液混合液,漩渦

9、劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮,室溫靜置1-2min.3參加250ul溶液n細(xì)胞裂解液,輕柔的反復(fù)顛倒混勻5-6次.室溫放置1-2min,使菌體充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液.4參加350ul溶液出中和液,馬上輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次,此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀.512000室溫離心10min,收集上清.6將上清置于DNA純化柱中,靜置1-2min.712000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液.8參加500ul溶液PB洗滌液12000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液,目的是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫,以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA.9參加500ul溶液W去鹽液,12000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液,重復(fù)一次.10120

10、00轉(zhuǎn)離心3min,以徹底去除純化柱中殘留的液體.11將DNA純化柱置于新的離心管中,懸浮滴加50-100ul溶液曰uent為無(wú)菌的雙蒸水,PH為8.0-8.5,室溫放置2min.1212000轉(zhuǎn)離心1min,此時(shí)管底即為高純度的質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒于-20C保存.質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培養(yǎng)基于1.5ml離心管中12000轉(zhuǎn)離心1min,棄上清,吸取培養(yǎng)基重復(fù)離心棄上清離心,留取少量菌液作為菌種保存,可直接置于-20加250ulBufferS1懸浮細(xì)菌,懸浮均勻一一加250ulBufferS2溫和充分的上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻,使菌體裂解加350ulBufferS3溫和上下翻轉(zhuǎn)12000離心10m

11、in取上清液轉(zhuǎn)移到專用的制備管2ml12000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液加500ulBufferW112000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液加500ulBufferW212000轉(zhuǎn)離心1min,棄濾液,重復(fù)一遍將制備管置回2ml離心管12000轉(zhuǎn)離心1min將制備管移入新的1.5ml離心管中,力口6080ulEluent或離子水,室溫1min12000轉(zhuǎn)離心1min移去制備管,將有質(zhì)粒的離心管于4c或是-20C保存4、質(zhì)粒DNA和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生病毒即病毒包裝1.1 名詞解釋1.1.1293 T細(xì)胞是由293細(xì)胞派生,表達(dá)SV40大T抗原的人腎上皮細(xì)胞系,被廣泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)各種

12、目標(biāo)蛋白,或是用以包裝病毒.1.1.1294 ：某些細(xì)胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體,可作為生物膜,用于捕獲外源性物質(zhì)后更有效地運(yùn)送到靶細(xì)胞,經(jīng)同細(xì)胞融合而釋放.1.2 共轉(zhuǎn)染的操作步驟第一天：用無(wú)抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細(xì)胞,2ml/孔.保證第二天細(xì)胞密度到達(dá)80%-90%融合度第二天：1.500 ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2ug表達(dá)質(zhì)粒+1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G2. 500ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋15ul脂質(zhì)體20003. 5min后,將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合,室溫靜止20min4. 從6孔板中吸出1ml無(wú)血清培養(yǎng)基,然后滴參加1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物.5. 6-1

13、0h后,移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基,代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FB從此刻開(kāi)始算時(shí)間.第三天：1 .轉(zhuǎn)染24h后,熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染效率應(yīng)到達(dá)70%以上第四天：1 .轉(zhuǎn)染后48和72h分別收獲含病毒的上清.2.3000rpm離心20min,0.45um濾膜過(guò)濾,去除細(xì)胞沉淀.3.12000轉(zhuǎn)離心濃縮細(xì)胞、分裝-80C貯存.4.滴度測(cè)定目的基因檢定,并出具檢測(cè)報(bào)告.4.3病毒包裝的原理質(zhì)粒DNA為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)RNA,但不能譯出慢病毒的外殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒,其同時(shí)連有目的基因和報(bào)告基因,psPAX2為能表達(dá)慢病毒外殼的質(zhì)粒,其表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)粘附機(jī)制更易穿過(guò)細(xì)胞膜,p

14、MD2.G為慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒,通過(guò)lipofectamine2000進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因組中,宿主基因組在表達(dá)時(shí),隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因RNA與psPAX2、pMD2.G基因譯出的蛋白組裝為慢病毒.在上述程序中提及的“第四天收集病毒.在第五天再用該病毒感染靶細(xì)胞,病毒進(jìn)入細(xì)胞后,其遺傳物質(zhì)RNA反轉(zhuǎn)錄出DNA,該基因再整合到靶細(xì)胞的基因組中,完成轉(zhuǎn)染過(guò)程,由于質(zhì)粒DNA只能轉(zhuǎn)錄出病毒RNA和表達(dá)目的基因卻不能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋白成分,因此其不能像普通的病毒一樣在宿主細(xì)胞能反復(fù)增殖,故對(duì)宿主細(xì)胞是無(wú)害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細(xì)胞基因組中.5、慢病毒感染細(xì)胞5.1 流程圖潔臺(tái)

15、*.院臺(tái)%LenHwiraihpre即的System5.2 感染步驟1鋪板：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后,按1*105/L密度接種于12孔板,生長(zhǎng)過(guò)夜2感染：將70-80%W菌12孔板中的培養(yǎng)液吸除,換新鮮的培養(yǎng)液,同時(shí)參加PBS濃度梯度稀釋的病毒液,混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng).1.1 24h左右可換液,48小時(shí)即可看熒光,具體根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來(lái)看.5.3 熒光顯微鏡的操作流程翻開(kāi)熒光器30min內(nèi)不能關(guān)閉,否那么影響顯微鏡壽命,細(xì)胞培養(yǎng)板置于載物臺(tái),調(diào)節(jié)物鏡和光圈,先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞,再關(guān)閉光,開(kāi)啟熒光通道,觀察熒光強(qiáng)度,判定感染率.圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時(shí)間,增益值和彩色度使熒光照片最完

16、美.針對(duì)leica5.4 考前須知內(nèi)容1 .病毒濃度要適宜,太少的話細(xì)胞被感染的也少,但是病毒濃度太大,對(duì)細(xì)胞有傷害.2 .感染病毒時(shí)培養(yǎng)基量少,以保證病毒的濃度,在培養(yǎng)10h左右可根據(jù)培養(yǎng)基顏色加培養(yǎng)基.3在不明確細(xì)胞感染復(fù)數(shù)情況下,可進(jìn)行濃度梯度感染,計(jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù).4在加病毒后一般24h左右可換液,48小時(shí)即可看熒光,具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來(lái)看.6、感染后的細(xì)胞檢測(cè)方法6.1 熒光初步檢測(cè)假設(shè)有熒光,那么表示病毒感染成功,但并不能確定目的基因是否整合到細(xì)胞中,待進(jìn)一步檢測(cè),熒光有強(qiáng)弱之分,與病毒參加的量有關(guān).6.2 RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)6.2.1 原理由于真核細(xì)胞DNA含有很多

17、非編碼區(qū),真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后,經(jīng)過(guò)剪切和拼接,去掉這些非編碼區(qū),才能形成真正的mRNA,是否表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)相應(yīng)的蛋白,只能通過(guò)提取其mRNA并RT-PCR這條途徑來(lái)測(cè)定6.2.2 RNA提取步驟力口ImlTrizol,吹打后移至1.5ml無(wú)菌的離心管中；加100ul氯仿劇烈振蕩30s混勻,12000轉(zhuǎn)15min,可看到明顯分層；取上層透明液體至新的1.5ml離心管中,加等體積的異丙醇,混勻靜置10min,12000轉(zhuǎn)離心10min,棄上清,加1ml70%乙醇,12000轉(zhuǎn),離心10min,棄上清,風(fēng)干剩余液體,最后加DEPC-水溶解RNA,電泳,粗步判定RNA純度.6

18、.2.3 RT-PCR步驟：RT是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程,用前一天提取好的總RNA,在參加引物,模版和酶,并在PCR儀的溫度設(shè)置下,RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.PCR是cDNA在模版,引物,酶的作用下進(jìn)行復(fù)制成雙鏈DNA.具體步驟省略6.3 蛋白提取及Western檢測(cè)western-Bloting：蛋白免疫印跡Westernblotting或Immunoblotting一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測(cè)三個(gè)局部組成.第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,使待測(cè)樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶.第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上,用得最多的材料是硝酸纖維素膜NC膜和PVDF膜,蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移電泳,它又有半干法和濕法之分,現(xiàn)在大多用濕法.第三步是用特異性的抗體檢測(cè)出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原.免疫檢測(cè)的方法可以是直接的和間接的.現(xiàn)在多用