核酸提取常見(jiàn)試劑的作用原理0001

1、核酸提取常見(jiàn)試劑的作用原理異硫氟酸”瓜強(qiáng)用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。月瓜鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑，在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫鼠酸月瓜，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機(jī)的卷曲狀態(tài)。含有強(qiáng)力的陰離子和陽(yáng)離子基團(tuán)，它們可以形成較強(qiáng)的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫鼠酸月瓜可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸月瓜、尿素鹽酸月瓜是一個(gè)核酸酶的強(qiáng)抑制劑，它并不是一種足夠強(qiáng)的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來(lái)。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機(jī)制：1變性蛋

2、白和鹽酸月瓜、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白-變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起N-D反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸”瓜、尿素對(duì)氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當(dāng)濃度高時(shí)，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果鹽酸月瓜、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強(qiáng)，鹽酸月瓜、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體變性1防止蛋白質(zhì)或酶等（如輔酶A）分子中SH基團(tuán)氧化成二硫鍵，2在某些酶反應(yīng)過(guò)程中維持體系的還原環(huán)境。DTT,DDTE、琉基乙醇應(yīng)用最廣，谷胱甘

3、肽也常應(yīng)用，由于他是生物體內(nèi)的還原劑，同時(shí)氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。DNA提取中，常使用琉基乙醇，維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類(lèi)氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應(yīng)高于2%0&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵（肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。1還原蛋白質(zhì)二硫鍵，使Rna酶變性2抑制酚類(lèi)氧化，若氧化，核酸會(huì)變成灰黑色，苯酚的氧化產(chǎn)物苯酶等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3保護(hù)蛋白質(zhì)的琉基蛋白質(zhì)提取中需要琉基乙醇還原二硫鍵，使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸”瓜能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但不影響肽鍵和二硫鍵，

4、不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上還原劑琉基乙醇或DTT,能還原二硫鍵，使RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比琉基乙醇低很多。而且DTT比琉基乙醇的濃度低7倍時(shí),兩者效果相近，但DTT價(jià)格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長(zhǎng)它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。抑制Rnase?舌性TCEP三（2-甲酰乙基）瞬鹽酸鹽Trizol苯酚、異硫鼠酸”瓜、8羥基唾咻、&琉基乙酉1等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，

5、使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8羥基唾咻、異硫氟酸”瓜、&琉基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羥基唾咻可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫鼠酸”瓜屬于解偶劑，是一類(lèi)強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。組織破碎，裂解細(xì)胞十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫（55-65C）裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，形成SDS/蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物，釋放核

6、酸，提高鹽（KAc或NaAc）濃度并降低溫度（冰?。?，使SDS/蛋白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作簡(jiǎn)單，溫和，可提取到高分子量的DNA,但產(chǎn)物多糖類(lèi)雜質(zhì)較多陽(yáng)離子強(qiáng)表面活性劑，通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離溶解膜類(lèi)蛋白SDS能裂解細(xì)胞。使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵，使染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。(1) SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到

7、蛋白質(zhì)的疏水部位；(2) SDS可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變(3) SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質(zhì)溶解，變性(4)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并使復(fù)合物帶負(fù)電質(zhì)粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl,你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassiumdodecylsulfate,PDS,而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中

8、的納離子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了CTAB:十六烷基三甲基澳乙胺，低溫時(shí)易沉淀陽(yáng)離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽(yáng)離子去污劑，低離子強(qiáng)度(0.1-0.5MNaCl),沉淀核酸與酸性多聚糖，而蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強(qiáng)度的溶液中(

9、>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。CTAB可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的DNA,這種去污劑加入調(diào)節(jié)至高離子強(qiáng)度的細(xì)菌和細(xì)胞裂解液中（0.7MNaCl）,經(jīng)過(guò)連續(xù)的酚/氯仿抽提,去除CTAB/黏多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體，異丙醇/無(wú)水乙醇沉淀上清即可將DNA分離出來(lái)CTAB還有提高DNA互補(bǔ)鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的DNA雙螺旋的作用CTAB法的主要特點(diǎn)是用用較廣CTAB溶液在低于15度會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料時(shí)，必須預(yù)熱，且離心溫

10、度不低于15度酶抑制劑，螯合二價(jià)金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制細(xì)胞中DNase的活性，該酶可降解DNAEDTA是去垢劑，結(jié)合離子用，而它結(jié)合的部分離子是能夠誘發(fā)或者促進(jìn)RNA酶活性的,比如Ca2+0EDTA是一種二價(jià)離子熬合劑，能熬合Mg2+和Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子，而多種RNA酶的活性是需要依賴二價(jià)陽(yáng)離子的，所以EDTA能通過(guò)熬合二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)抑制RNA酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH。0.01M,DNase酶基本失活。酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變性精胺或其他多胺酶抑制劑，降低核酸酶的影響酶抑制劑，降低重

11、金屬氧化酶的影響減少酚類(lèi)、酶類(lèi)、單寧類(lèi)物質(zhì)的影響，抗氧化作用，絡(luò)合多酚和菇類(lèi)物質(zhì)，防止多酚類(lèi)褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR強(qiáng)抑制劑，必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入PVP或PVPP等能絡(luò)合多酚和菇類(lèi)物質(zhì)，離心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成酶類(lèi)，避免溶液變褐色而具有抗氧化能力提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度，用量根據(jù)雜質(zhì)而定（1-6%）,PVP同時(shí)能去除多糖，因此將PVP和琉基乙醇配合使用并調(diào)整用量，能有效防止多酚污染PVP（聚乙烯叱咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖

12、。Triton-x100TritonX100之類(lèi)的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，所以在280nm有很強(qiáng)的吸收。蛋白酶K:切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的竣基端肽鍵，將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來(lái)。蛋白酶K在較廣的pH范圍內(nèi)均有活性(pH4-12.5)溫度范圍37-60度鹽濃度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污劑：Tween20(5%)、TritonX-100(1%)和SDS(1%滌件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳.如組織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血沙全血)局部分泌物、尿，糞便等.蛋

13、白酶K的一般工作濃度是50100仙g/ml蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質(zhì)，滅活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代DEPC處理水的,但有些人說(shuō)效果不好。蛋白酶K,威力巨大的廣譜蛋白酶，95C加熱10分鐘，則完全失活。數(shù)年前首次使用它替代DEPC處理RNA抽提用的離心管和槍頭，效果不錯(cuò)；后來(lái)又用于處理RNase-Free的水，效果也是一級(jí)棒。從此就再也不用DEPC了。配制RNA裂解試劑時(shí)，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后即可.槍頭及離心管去除RNase：先將槍頭

14、及離心管清洗干凈后，移入預(yù)先混好的含1ug/ml蛋白酶K的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置30分鐘后，連水一起高壓滅菌。棄水后，烘干即可。RNase-Free水的獲得：直接在滅菌的雙蒸儲(chǔ)水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質(zhì)的殘留對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有可見(jiàn)的影響。無(wú)蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸儲(chǔ)水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml0輕輕混勻后，倒入專用的蒸儲(chǔ)器中。放置15分鐘后，加熱蒸儲(chǔ)，流出的就是無(wú)蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free水。要提醒的是，該專用蒸儲(chǔ)器頭幾次流出來(lái)的水，只能當(dāng)普通蒸儲(chǔ)水用，因?yàn)橥ǖ乐须y確保R

15、Nase-Free的環(huán)境；另外，一定要主要密閉性，否則，流出的水又被污染了。因此混合使用最佳，經(jīng)酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為1:1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)非極性分子水為極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c他們混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子見(jiàn)的水分子被擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性，經(jīng)離心，變性蛋白密度比對(duì)大，而與水相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿使蛋白質(zhì)變性量要足夠，因?yàn)楸椒尤コ鞍资怯幸欢ǖ娘柡投鹊模^(guò)飽和度，裂解體系中蛋白質(zhì)不能被一次性去除，必須多次抽提。離心后分三層，下層有機(jī)層中有一些脂溶性的雜質(zhì)，中間層白色絮

16、狀沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸；變性后的蛋白質(zhì)從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。抽提DNA,為混合均勻，容易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇=24:1或酚：氯仿：異戊醇=25:24:1（不必先配置，臨用前加入即可）減少操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相沉淀DNA時(shí)總會(huì)加入高濃度的鹽，加鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的兩個(gè)因素，使蛋

17、白和DNA分離并沉淀下來(lái).而此時(shí)鹽的陽(yáng)離子會(huì)與DNA結(jié)合形成DNA-陽(yáng)離子鹽溶于溶液中，再用無(wú)水乙醇可以將DNA-陽(yáng)離子鹽沉淀下來(lái)提取DNA時(shí)先加0.14mol/L氯化鈉，因?yàn)樵谶@種濃度的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白質(zhì)的溶解度增加，這樣通過(guò)過(guò)濾能將DNA分離開(kāi)，以除去蛋白質(zhì)。再加入95%的酒精能使DNA沉淀,因?yàn)樵谶@個(gè)濃度下DNA溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化鈉，DNA和蛋白質(zhì)都能被酒精所沉淀，就無(wú)法將DNA和蛋白質(zhì)分離開(kāi)。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。這樣可

18、以是DNA沉淀出來(lái)在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。它可以控制反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，同時(shí)還有一定的緩沖作用，保證體系PH的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，總之檸檬酸鈉在這里的作用類(lèi)似于食物中的防腐劑。焦碳酸二乙酯，它通過(guò)和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唾

19、環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強(qiáng)。在Tris中不穩(wěn)定，很快會(huì)分解為二氧化碳和乙醇。強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑0.1%濃度Tris-HCl緩沖體系，使pH變化不會(huì)太大加入異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質(zhì)污染，異丙醇的沉淀效果要比無(wú)水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一個(gè)弊端就是會(huì)沉淀下來(lái)好多的鹽和蛋白質(zhì)這樣會(huì)影響下一步的操作，一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70%乙醇70%乙醇洗滌DNA沉淀（因?yàn)樵?0%乙醇里DNA是不溶的，而鹽離子卻可溶），用無(wú)水乙醇則達(dá)不到這個(gè)目的！乙醇對(duì)于蛋白質(zhì)、核酸的沉淀效應(yīng)隨分子量加大而增大，小分

20、子的核酸和蛋白質(zhì)碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA,是為了去除殘余的鹽類(lèi)，去除過(guò)量SDS和酚等雜物，因?yàn)镾DS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過(guò)棄上清液去除這種去污劑，避免對(duì)以后PCR反應(yīng)的影響。（焦碳酸二乙酯）：常用RNA酶抑制劑，與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唾環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑用高濃度甲酰胺替代苯酚從細(xì)胞裂解物的蛋白酶K消化物中分離抽提DNA,甲酰胺是一種離子化溶劑，能分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物并使蛋白變性和釋放，因其不影響蛋白酶K的活性，特別適于分離高分子質(zhì)量的DNA,其分離物籍火棉膠袋的透析，去除變性蛋白進(jìn)而純化DNA。聚乙二醇P

21、EG有機(jī)聚合物，無(wú)毒，親水性強(qiáng)，相對(duì)分子量6-20k,沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時(shí)受離子強(qiáng)度、溶液pH值和溫度等因素的影響，采用該方法可將病毒濃縮10倍以上。為一種非離子多聚物，多離子多聚物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)重要沉淀劑?；诙嗑畚锏某恋碜饔弥饕蕾囉诙嗑畚锏臐舛群捅怀恋砦锏姆肿恿看笮?，Laurent等（1967）提出PEG的沉淀機(jī)理主要是通過(guò)空間位置排斥，使液體中的微粒（包括生物大分子、病毒和細(xì)菌等）被迫集聚在一起而引起沉淀的發(fā)生。PEG最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白（IgG）和沉淀一些細(xì)菌病毒，今年來(lái)逐漸應(yīng)用于核酸和酶的分離純化，特別是用PEG分離質(zhì)粒DNA,已相當(dāng)普遍。用P

22、EG8000代替乙醇沉淀DNA,可以在500ulDNA液中加入200ul20%PEG8000冷1.2mol/LNaCl),冰浴20min(Lietal.,1994)。該操作的優(yōu)點(diǎn)在于：操作條件溫和，不易引起生物大分子的變性。同時(shí)具有極高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。乙基黃原酸鉀乙基黃原酸鉀能夠與多糖結(jié)合，形成可溶性復(fù)合物，使細(xì)胞壁破裂，釋放出核酸。此復(fù)合物在錢(qián)離子存在的情況下可轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗苄?，并可通過(guò)簡(jiǎn)單的離心除去，不需要苯酚或氯仿抽提。另外，乙基黃原酸鉀能夠結(jié)合金屬離子，抑制DNase的活性。Tillett等(2000)利用該方法從藍(lán)細(xì)菌、微生物、環(huán)境樣品中提取到高質(zhì)量

23、的核酸，DNA可以用于酶切、克隆、PCR,RNA可以用于RT-PCR,Southern雜交等反應(yīng)，并且樣品中不含核酸酶，溫育16h沒(méi)有發(fā)生降解。異硫氟酸”瓜強(qiáng)用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。月瓜鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑，在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強(qiáng)的是異硫鼠酸月瓜，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機(jī)的卷曲狀態(tài)。含有強(qiáng)力的陰離子和陽(yáng)離子基團(tuán)，它們可以形成較強(qiáng)的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫鼠酸月瓜可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸月瓜、尿素鹽酸月瓜是一個(gè)核酸酶的強(qiáng)抑制劑，它并不是

24、一種足夠強(qiáng)的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來(lái)。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機(jī)制：1變性蛋白和鹽酸月瓜、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白-變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起N-D反應(yīng)平衡向右移動(dòng)，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸”瓜、尿素對(duì)氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當(dāng)濃度高時(shí)，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果鹽酸月瓜、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強(qiáng)，鹽酸月瓜、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體變性1防止蛋白質(zhì)或酶等（如

25、輔酶A）分子中SH基團(tuán)氧化成二硫鍵，2在某些酶反應(yīng)過(guò)程中維持體系的還原環(huán)境。DTT,DDTE、琉基乙醇應(yīng)用最廣，谷胱甘肽也常應(yīng)用，由于他是生物體內(nèi)的還原劑，同時(shí)氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。DNA提取中，常使用琉基乙醇，維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類(lèi)氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應(yīng)高于2%0&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵（肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。1還原蛋白質(zhì)二硫鍵，使Rna酶變性2抑制酚類(lèi)氧化，若氧化，核酸會(huì)變成灰黑色，苯酚的氧化產(chǎn)物苯酶等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3保護(hù)蛋白質(zhì)的琉基蛋白質(zhì)提取中需要琉基乙醇還原二硫

26、鍵，使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸”瓜能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上還原劑琉基乙醇或DTT,能還原二硫鍵，使RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比琉基乙醇低很多。而且DTT比琉基乙醇的濃度低7倍時(shí),兩者效果相近，但DTT價(jià)格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長(zhǎng)它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。抑制Rnase?舌性TCEP三（2-甲酰乙基）瞬鹽酸鹽Tri

27、zol苯酚、異硫鼠酸”瓜、8羥基唾咻、&琉基乙酉1等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8羥基唾咻、異硫氟酸”瓜、&琉基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8羥基唾咻可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫鼠酸”瓜屬于解偶劑，是一類(lèi)強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。組織破碎，裂解細(xì)胞十

28、二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫(55-65C)裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，形成SDS/蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物，釋放核酸，提高鹽(KAc或NaAc)濃度并降低溫度(冰浴)，使SDS/蛋白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作簡(jiǎn)單，溫和，可提取到高分子量的DNA,但產(chǎn)物多糖類(lèi)雜質(zhì)較多陽(yáng)離子強(qiáng)表面活性劑，通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離溶解膜類(lèi)蛋白SDS能裂解細(xì)胞。使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這

29、種價(jià)鍵，使染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。(1) SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)的疏水部位；(2) SDS可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變(3) SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質(zhì)溶解，變性(4) 形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并使復(fù)合物帶負(fù)電質(zhì)粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl,你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl,你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassiumdodecyl

30、sulfate,PDS,而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了CTAB:十六烷基三甲基澳乙胺，低溫時(shí)易沉淀陽(yáng)離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽(yáng)離子去污劑

31、，低離子強(qiáng)度(0.1-0.5MNaCl),沉淀核酸與酸性多聚糖，而蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過(guò)有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類(lèi)等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái)。CTAB可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的DNA,這種去污劑加入調(diào)節(jié)至高離子強(qiáng)度的細(xì)菌和細(xì)胞裂解液中(>0.7MNaCl),經(jīng)過(guò)連續(xù)的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體，異丙醇/無(wú)水乙醇沉淀上清即可將DNA分離出來(lái)CTAB還有提高DNA互補(bǔ)鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的DNA雙螺

32、旋的作用CTAB法的主要特點(diǎn)是用用較廣CTAB溶液在低于15度會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料時(shí)，必須預(yù)熱，且離心溫度不低于15度酶抑制劑，螯合二價(jià)金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制細(xì)胞中DNase的活性，該酶可降解DNAEDTA是去垢劑，結(jié)合離子用，而它結(jié)合的部分離子是能夠誘發(fā)或者促進(jìn)RNA酶活性的,比如Ca2+0EDTA是一種二價(jià)離子熬合劑，能熬合Mg2+和Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子，而多種RNA酶的活性是需要依賴二價(jià)陽(yáng)離子的，所以EDTA能通過(guò)熬合二價(jià)陽(yáng)離子來(lái)抑制RNA酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和NaOH粉末混合后，再加水，然后用NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH。0.01M,DNase酶基本失活。酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變性精胺或其他多胺酶抑制劑，降低核酸酶的影響酶抑制劑，降低重金屬氧化酶的影響減少酚類(lèi)、酶類(lèi)、單寧類(lèi)物質(zhì)的影響，抗氧化作用，絡(luò)合多酚和菇類(lèi)物質(zhì)，防止多酚類(lèi)褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR強(qiáng)抑制劑，必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入PVP或PVPP等能絡(luò)合多酚和菇類(lèi)物質(zhì)，離心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成酶類(lèi)，避免溶液變褐色而具有抗氧化能力