第七章 分子發(fā)光-熒光與磷光

1、第七章molecular luminescence analysis一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 由分子結(jié)構(gòu)理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機(jī)理。1. 分子能級與躍遷分子能級與躍遷 分子能級比原子能級復(fù)雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉(zhuǎn)動能級； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、

2、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；2.電子激發(fā)態(tài)的多重度 電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應(yīng)單重態(tài)能級低； 大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)； S0T1 禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級圖)；進(jìn)入的幾率??； 2.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑(分子的去激過程) 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和無輻射躍遷等方式失去能量；和無輻射躍遷等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動弛預(yù)無輻

3、射躍遷 激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對大；熒光熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；磷光磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子吸收和發(fā)射過程的Jablonski能級圖非輻射能量傳遞過程振動弛豫振動弛豫：在凝聚相體系中，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)(如S1和S2)的分子能通過與溶劑分子的碰撞迅速以熱的形式把多余的振動能量傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級的最低振動能級，

4、這個過程稱為振動弛豫。發(fā)生振動弛豫的時間10 -12 s。內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換：當(dāng)S2的較低振動能級與S1的較高振動能級的能量相當(dāng)或重疊時，分子有可能從S2的振動能級以無輻射方式過渡到S1的能量相等的振動能級上。這個過程稱為內(nèi)轉(zhuǎn)換。內(nèi)轉(zhuǎn)換發(fā)生的時間約為10 -12 s。內(nèi)轉(zhuǎn)換過程同樣也發(fā)生在激發(fā)態(tài)三重態(tài)的電子能級間。 由于振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換過程極為迅速(10 -12 s)，因此，激發(fā)后的分子很快回到電子第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動能級。所以高于第一激發(fā)態(tài)的熒光發(fā)射十分少見。外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換過程是熒光或磷光的競爭過程，因此，該過程使熒光或

5、磷光減弱或“猝滅”。系間跨越系間跨越：是不同多重態(tài)之間的一種無輻射躍遷。該過程是激發(fā)電子改變其自旋態(tài)，分子的多重性發(fā)生變化的結(jié)果。當(dāng)兩種能態(tài)的振動能級重疊時，這種躍遷的概率增大。 如S1到T1躍遷就是系間躍遷的例子，即單重態(tài)到三重態(tài)的躍遷。即較低單重態(tài)振動能級與較高的三重態(tài)振動能級重疊。這種躍遷是“禁阻”的。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進(jìn)行。輻射能量傳遞過程 熒光發(fā)射：熒光發(fā)射：當(dāng)分子處于第一激發(fā)單重態(tài)當(dāng)分子處于第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低能級時，分的最低能級時，分子返回基態(tài)的過程比振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化過程慢得多。分子可子返回基態(tài)的過程比振動弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)化過程慢得多。分子可能通過發(fā)射光子躍

6、遷回到基態(tài)能通過發(fā)射光子躍遷回到基態(tài)S0的各振動能級上，這個過程的各振動能級上，這個過程稱為熒光發(fā)射。稱為熒光發(fā)射。電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（ 多為 S1 S0躍遷），發(fā)射波長為 l2的熒光； 10-710 -9 s 。 由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； l l2 l l 2 l l 1 ；磷光發(fā)射磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)過系間跨躍達(dá)到激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過迅速的振動弛豫達(dá)到第一激發(fā)三重態(tài)(T1)的最低振動能級上，從T1態(tài)分子經(jīng)發(fā)射光子返回基態(tài)。此過程稱為磷光發(fā)射。磷光發(fā)射是不同多重態(tài)之間的躍遷(即T1 S0)，故屬于“禁阻”躍遷。因此磷光的壽命比熒光要長很多，約

7、為10-3到10s。所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，還?？梢杂^察到發(fā)光現(xiàn)象，而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。2. 分子的活化與去活化 分子的活化與去活化*MXMX n1iihv n1jjhvMXMX* 任何熒光分子都具有兩種特征的光譜，即激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l 固定測量波長(選最大發(fā)射波長),化合物發(fā)射的熒光(磷光)強(qiáng)度與照射光波長的關(guān)

8、系曲線。 固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強(qiáng)度)與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。200260320380440500560620熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 90004008001200160020002400280032003600400044004800 IFl l200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)

9、光譜和熒光光譜蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜三、熒光光譜的特征激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系1、Stokes位移 在溶液中，分子的熒光發(fā)射波長總是比其相應(yīng)的吸收(或激發(fā))光譜的波長長，熒光發(fā)射這種波長位移的現(xiàn)象稱為Stokes位移。 處于激發(fā)態(tài)的分子一方面由于振動弛豫等損失了部分能量，另一方面溶劑分子的弛豫作用使其能量進(jìn)一步損失，因而產(chǎn)生了發(fā)射光譜波長的位移，這種位移表明在熒光激發(fā)和發(fā)射之間所產(chǎn)生的能量損失。200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900040080012001600200024002800320036004000440

10、04800 IFl l 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關(guān)系。 鏡像規(guī)則的解釋大多數(shù)吸收光譜的形狀表明了分子的第一激發(fā)態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)，而熒光發(fā)射光譜則表明了分子基態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)一般情況下，分子的基態(tài)和第一激發(fā)單重態(tài)的振動能級結(jié)構(gòu)相似，因此吸收光譜的形狀與熒光發(fā)生光譜的形狀呈鏡像對稱關(guān)系。3、熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān) 一般地，用不同波長的激發(fā)光激發(fā)熒光分子，可以觀察到形狀相同的熒光發(fā)射光譜。熒光分子無論被激發(fā)到哪一個激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子經(jīng)振動弛豫及內(nèi)轉(zhuǎn)換等過程最終回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級。而分子的熒光發(fā)射總是從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級躍遷到基態(tài)的

11、各振動能級上，所以熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)。S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動弛豫分子吸收和發(fā)射過程的Jablonski能級圖200250300350400450500550600650700750800850900080016002400320040004800 IFl lRLSbC303. 20teT,bCIIlgTlgA bC303.20te1T1II1 )e1(IIIbC303.20t0 )e1(I)II(IbC303.20t0F !nx!4x!3x!2x!1x1en432

12、x )!4)bC30. 2(!3)bC30. 2(!2)bC30. 2(bC30. 2(II4320F CbIk30. 2I0FF CbIk30. 2I0PP CKIF KCIP n1iikkF(P)F(P)1 激激發(fā)發(fā)分分子子總總數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)射射熒熒光光的的分分子子數(shù)數(shù) F n1iiFFFkkk 激激發(fā)發(fā)分分子子總總數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)射射磷磷光光的的分分子子數(shù)數(shù) P n1iiPPstPkkk 強(qiáng)熒光的有機(jī)化合物具備下特征強(qiáng)熒光的有機(jī)化合物具備下特征:具有大的共軛具有大的共軛鍵結(jié)構(gòu)；鍵結(jié)構(gòu)；具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；具有剛性的平面結(jié)構(gòu)；具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為具有最低的單重電子激發(fā)態(tài)為S1為為 * 型；型；取代

13、基團(tuán)為給電子取代基。取代基團(tuán)為給電子取代基。N NN NCCOO-O-OCOCOO-O-OCH2OHCH3H3CONO2NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-CCHHCCHHOHO-OHO-三. 金屬螯合物的熒光NOHNOZnNNOOAlNNOHHO三、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素1.1.溶劑的影響溶劑的影響 除一般溶劑效應(yīng)外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化；2.2.溫度的影響溫度的影響 熒光強(qiáng)度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加。3. 3. 溶液溶液pHpH 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物

14、的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；5.溶液熒光的猝滅Hhvhvk*,k*1QMQMMMMM2 *,*hvhvAADD )(A)D()A()(D)(A)D()A()(D1*0011*001SSSTSSSS* NCH3CH3NCH3CH3+_23*3231OMOM 1k*hvhvDDDD D)(DDD11* kT M2M)M(MM*3*3*3400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 5000102030405060708090100

15、 T T %l lbCIIlgA0t CbIk30. 2I0FF A ,I ,kI0FF 紫外-可見分光光度計測量池(吸收池)I0ItI0ItIF,p7.5 7.5 化學(xué)發(fā)光分析化學(xué)發(fā)光分析一、一、基本原理基本原理1. 1. 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 在化學(xué)反應(yīng)過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物；（2）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)）化學(xué)發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng) E=

16、170300 kJ/mol；位于可見光區(qū)；位于可見光區(qū)；（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行；發(fā)光持續(xù)時間較長，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行； 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。2.2.化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：化學(xué)效率：clceem發(fā)射光子的分子數(shù)參加反應(yīng)的分子數(shù)ce激發(fā)態(tài)分子數(shù)參加反應(yīng)分子數(shù)發(fā)光效率：發(fā)光效率：em產(chǎn)生光子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)時刻t 的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))： clclddcIttdc/dt 分析物參加反應(yīng)的速率；3.3.化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光分析的依據(jù) 在化學(xué)發(fā)光分析中，被分

17、析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學(xué)反應(yīng)： cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt =Kc； K 為反應(yīng)速率常數(shù)。定性依據(jù)：定性依據(jù)：（1）在一定條件下，峰值光強(qiáng)度與被測物濃度成線性；（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強(qiáng)度(S)，其與被測物濃度成線性：4.4.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的類型（1 1）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)）氣相化學(xué)發(fā)光反應(yīng)a. 一氧化氮與一氧化氮與O3的發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光反應(yīng) NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 發(fā)射的光譜范圍：600875nm，靈敏度1ng/cm-3；b.氧原子與氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光反應(yīng) O3 O2

18、+ O （1000 C石英管中進(jìn)行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3； O3 O2 + O （1000 C石英管中進(jìn)行石英管中進(jìn)行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 發(fā)射光譜范圍：發(fā)射光譜范圍：4001400nm；靈敏度；靈敏度1ng/cm-3；氧原子與氧原子與CO的發(fā)光反應(yīng)：的發(fā)光反應(yīng)： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 發(fā)射光譜范圍：發(fā)射光譜范圍：300500nm；靈敏度；靈敏度1ng/cm-3； 氧原子與氧原子與NO的發(fā)光反應(yīng)：的發(fā)光反應(yīng)：c. 乙烯與乙烯與O

19、3的發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光反應(yīng) 乙烯與乙烯與O3反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛：反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)乙醛： CH2O* CH2O + h 最大發(fā)射波長：最大發(fā)射波長：435nm；對；對O3的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)的特效反應(yīng)；線性響應(yīng)范圍范圍1 ng/cm-3 1 g/cm-3；（2 2）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)）火焰中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；在富氫火焰中，也存在著很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；a. 一氧化氮一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 發(fā)射光譜范圍：發(fā)射光譜范圍：660770nm； 最大發(fā)射波長：最大發(fā)射波長：690nm； 在在富氫火焰中：富氫火焰中： NO2 + 2

20、H NO + H2O 該反應(yīng)十分迅速；該反應(yīng)十分迅速；b.硫化物硫化物 揮發(fā)性硫化物揮發(fā)性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等等在富在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）：氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（藍(lán)色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 發(fā)射光譜范圍：發(fā)射光譜范圍：350460nm； 最大發(fā)射波長：最大發(fā)射波長：394nm； 靈敏度：靈敏度： 0.2 ng/cm-3； 發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。發(fā)射光強(qiáng)度與硫化物濃度的平方成正比。（3 3）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)）液相中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 機(jī)理研究較多

21、，在分析中應(yīng)用最多；可測痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）； 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效率：0.150. 05； 魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過程：反應(yīng)過程： 該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。5. 5. 化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用化學(xué)與生物發(fā)光分析的應(yīng)用（1） 該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用該發(fā)光反應(yīng)速度慢，某些金屬離子可催化反應(yīng)；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子?？蓽y痕量的這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、F

22、e2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2） 可檢測低至可檢測低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3） 間接測定某些生物試樣間接測定某些生物試樣 氨基酸氨基酸 + O2 酮酸酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 通過測定生成的通過測定生成的H2O2 ，確定，確定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶 草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應(yīng)體系，可發(fā)出很強(qiáng)的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。生物

23、發(fā)光分析應(yīng)用生物發(fā)光分析應(yīng)用 1 1 在pH 78；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應(yīng)，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復(fù)合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8復(fù)合物與氧反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光： AMP LH2 E + O2 氧化熒光素* + AMP+CO2 + H2O氧化熒光素* 氧化熒光素 + h最大發(fā)射波長562nm；生物發(fā)光分析應(yīng)用生物發(fā)光分析應(yīng)用 2 2 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在細(xì)菌中的黃素酶作用下，在氧化型黃素單核苷酸(FMA)存在下，發(fā)生發(fā)光反應(yīng) ：NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2NADH脫氫酶FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h黃素酶最大發(fā)射波長495 nm；二、二、特點特點1. 1