如何選題與課題設計

1、科研基本訓練專題講座科研基本訓練專題講座如何選題和設計課題如何選題和設計課題高成江高成江, , 教授教授, , 泰山學者泰山學者山東大學醫(yī)學院免疫學研究所山東大學醫(yī)學院免疫學研究所 88382292 (office), 88382113 (lab) Office: building 6, Rm 438 Email: 1.1.盡快完成觀念的轉變盡快完成觀念的轉變: : 從從“學生學生”轉變?yōu)檗D變?yōu)椤翱蒲泄ぷ髡呖蒲泄ぷ髡摺?從從“學習學習”轉變?yōu)檗D變?yōu)椤把芯垦芯俊薄啊薄疤剿魈剿鳌笨朔F(xiàn)在學生的一些弱點：克服現(xiàn)在學生的一些弱點：應試教育和就業(yè)問題，缺乏對科學研究的激情。應試教育和就業(yè)問題，缺乏對科學

2、研究的激情。眾多眾多“雜事雜事”，眾多的，眾多的“節(jié)假日節(jié)假日”。社會的浮躁與急功近利，潛不下心搞學問。社會的浮躁與急功近利，潛不下心搞學問。一、充分發(fā)揮自己的學習主動性一、充分發(fā)揮自己的學習主動性2.2.明確科學研究的目的明確科學研究的目的: :科學研究目的科學研究目的: :探索人類認識的未知領域探索人類認識的未知領域, ,探索真理探索真理.發(fā)現(xiàn)新事物，新現(xiàn)象；揭示新規(guī)律發(fā)現(xiàn)新事物，新現(xiàn)象；揭示新規(guī)律（闡明規(guī)律）（闡明規(guī)律） ；提供新認識提供新認識(新解釋新解釋) )?？蒲泄ぷ髡叩目蒲泄ぷ髡叩墓ぷ髂康墓ぷ髂康? .科研的動力：科研的動力：（1 1）追求）追求真理（好奇心，認死理）真理（好奇心

3、，認死理） ( (自然科學有自然科學有無窮魅力無窮魅力) )； （2）社會需求（指揮棒）；（）社會需求（指揮棒）；（3）功）功利驅使。利驅使。 事業(yè)心事業(yè)心, ,上進心上進心, ,虛榮心虛榮心1 1、定研究、定研究 “ “方向方向”和和“領域領域” 所在所在Lab（導師）固定的研究方向（導師）固定的研究方向1)熟悉實驗室熟悉實驗室PI的工作（查文獻并瀏覽導師的工作（查文獻并瀏覽導師發(fā)表的文章）發(fā)表的文章）2)參加參加 Lab meeting, Journal club 3)熟悉實驗室工作環(huán)境與實驗操作熟悉實驗室工作環(huán)境與實驗操作 (要泡實驗要泡實驗室；參與師兄姐實驗室；參與師兄姐實驗,第一學期

4、年第一學期年)，重點是熟，重點是熟悉實驗儀器悉實驗儀器二、如何選題，要做什么二、如何選題，要做什么2、復習文獻，寫出綜述、復習文獻，寫出綜述大量查閱并整理大量查閱并整理“課題課題”有關文獻，撰寫綜述（是否發(fā)表？）有關文獻，撰寫綜述（是否發(fā)表？） (第一學年第一學年/學期）學期）1） 掌握學科水準掌握學科水準; 當前重大進展與趨勢當前重大進展與趨勢2）了解焦點與熱點）了解焦點與熱點;已已/正正/將進行的研究課題將進行的研究課題3）(全面全面) 歷史、現(xiàn)狀、展望歷史、現(xiàn)狀、展望; 主要研究方法手段，實驗技術主要研究方法手段，實驗技術4）從文獻中找蛛絲馬跡（依據(jù)），按自己的學識創(chuàng)新思維，）從文獻中找

5、蛛絲馬跡（依據(jù)），按自己的學識創(chuàng)新思維，大膽假設。大膽假設。5）打消陰性（否定）結果的顧慮，陰性實驗也具有科學價值）打消陰性（否定）結果的顧慮，陰性實驗也具有科學價值(指路標與警示牌指路標與警示牌)免疫學領域研究熱點免疫學領域研究熱點 腫瘤免疫的研究進展腫瘤免疫的研究進展 固有免疫的研究進展固有免疫的研究進展 T細胞分群、分化、發(fā)育的研究進展細胞分群、分化、發(fā)育的研究進展 NK細胞的研究進展細胞的研究進展 microRNA與免疫調節(jié)與免疫調節(jié) 自身免疫病的病因及治療自身免疫病的病因及治療Key questions: how the innate immune response is regul

6、ated?MRegulatory proteins: TRIM38, TRIP, hnRNP UmicroRNA: 210, 147nTRAF-interacting Protein (TRIP): A Novel Component of the Tumor Necrosis Factor Receptor (TNFR)- and CD30-TRAF Signaling Complexes That Inhibits TRAF2-mediated NFkB Activation. J. Exp. Med. 1997nThe Tumor Suppressor CYLD Interacts wi

7、th TRIP and Regulates Negatively Nuclear Factor B Activation by Tumor Necrosis Factor. J. Exp. Med. 2003查文獻，提假設成功的例子查文獻，提假設成功的例子nEarly embryonic lethality caused by targeted disruption of the TRAF-interacting protein (TRIP) gene. BBRC. 2007nTRAF-interacting protein (TRIP) is a RING-dependent ubiquit

8、in ligase. BBRC. 2007nThe protein-tyrosine kinase SYK interacts with TRAF-interacting protein TRIP in breast epithelial cells .Oncogene. 2009 3、定、定“課題課題”： 凝練科學問題，提出明確的idea 1）導師研究生共同討論制定，課題不要遠離“方向”和“領域”。2）既考慮工作需要，也要尊重研究生的興趣 3）注重工作的連續(xù)性與新領域的開拓 4）課題難易程度要考慮研究生能力5）利用臨床資源的研究(注意倫理原則）6）現(xiàn)有的研究基礎與工作條件，課題的前期研究工作

9、Novelty（新穎性）（新穎性）是否要有重要臨床或學術價值？是否要有重要臨床或學術價值？是否具有原創(chuàng)性？是否具有原創(chuàng)性？是否具有應用價值？是否具有應用價值？不是簡單重復別人的實驗（換材料），不是跟蹤不是簡單重復別人的實驗（換材料），不是跟蹤 。研究別人沒有研究過的東西，難，但創(chuàng)新性強研究別人沒有研究過的東西，難，但創(chuàng)新性強別人已研究過的東西，但可以研究它的新功能，別人已研究過的東西，但可以研究它的新功能，容易。容易。1 1、明確課題的研究目的和研究內容。、明確課題的研究目的和研究內容。 研究內容適當（做什么，編研究內容適當（做什么，編“故事故事”） 小心求證小心求證 小題大做深做小題大做深做

10、 不要大題小做淺做不要大題小做淺做；“深入深入”與與“全面全面”矛盾矛盾 針對研究目的（假說）決定研究內容針對研究目的（假說）決定研究內容 避免研究內容不足以得到預定目的（小于，少于）避免研究內容不足以得到預定目的（小于，少于） 避免研究內容超越預定目的（大于，多于）避免研究內容超越預定目的（大于，多于）三、設計課題，如何做三、設計課題，如何做 例例 背景：巨噬細胞活化可誘導新基因背景：巨噬細胞活化可誘導新基因A A的表達。的表達。假設：假設：A A基因可調控巨噬細胞的活化?；蚩烧{控巨噬細胞的活化。課題：研究課題：研究A A基因對巨噬細胞活化的作用和機制?；驅奘杉毎罨淖饔煤蜋C制。研究

11、內容研究內容1. A1. A基因是否對巨噬細胞活化有作用？基因是否對巨噬細胞活化有作用？研究內容研究內容2 2：A A基因調控巨噬細胞活化的機制？基因調控巨噬細胞活化的機制？結論：結論：A A基因是巨噬細胞的活化調控因子?；蚴蔷奘杉毎幕罨{控因子。2、實驗設計要嚴謹全面，特別是對照實驗（包、實驗設計要嚴謹全面，特別是對照實驗（包括陰性和陽性對照）括陰性和陽性對照），病例數(shù)，嚴格質控，病例數(shù)，嚴格質控（repeat, duplicate)repeat, duplicate)對照試驗檢測你的實驗體系；對照試驗檢測你的實驗體系；一個試驗至少要重復三次或更多次；一個試驗至少要重復三次或更多次；測量

12、的數(shù)據(jù)要重復三次至六次；測量的數(shù)據(jù)要重復三次至六次；臨床病例材料要幾百例；臨床病例材料要幾百例；3、技術路線要合理、技術路線要合理4、實驗方法要可靠并公認；動物模型要成熟公、實驗方法要可靠并公認；動物模型要成熟公認。認。 方法選擇：方法選擇： 目的決定方法選擇；目的決定方法選擇；PCRPCR， WBWB 實驗條件選方法；實驗條件選方法；MSMS 工作者熟練程度選方法工作者熟練程度選方法 模型：經典與新建（是否需與人一致或接近）模型：經典與新建（是否需與人一致或接近）1）新基因的生物信息學分析: 編碼產物預測分析 序列同源性分析 蛋白質功能域分析2）新基因的體內表達規(guī)律分析 mRNA水平的表達譜

13、分析 蛋白質水平的表達分析基因功能研究策略基因功能研究策略4）功能獲得策略 基因轉染技術 轉基因技術5）功能失活策略 基于siRNA的基因沉默技術 基因敲除 檢測的指標：炎性細胞因子的分泌6）基因編碼產物相互作用蛋白的研究免疫共沉淀技術（co-IP)酵母雙雜交系統(tǒng)FRED和FRET主要分子生物學技術 Western blotting-蛋白印跡 Confocal microscopy-激光共聚焦 Chromatin immunoprecipitation-染色質免疫沉淀 Real-time PCR-實時定量PCR 流式細胞術microRNA-210 negatively regulates LP

14、S-induced macrophage activation by targeting NF-B1BackgroundInnate immunityuThe bodys first line to defense against microbial infection.uMacrophages PRRRLRNLRTLRBackgroundBackgroundNF-BRHDNCNLSClass Ip50/p105(NF-B1)p52/p100(NF-B2)RHDTDNCNLSClass IIp65(RelA/ NF-B3)RelBRel(cRel)microRNAs Backgrounduhi

15、ghly conversed, small non-coding RNA molecules , 21-25ntuMature miRNA interacts with a specific mRNA through pairing of nucleotide bases between the miRNA sequence and the 3 untranslated region (3UTR) of specific mRNA, and leads to translational repression or target mRNA degradation uIn human，700 mi

16、RNAsthe expression of 20-30% genesBackgroundTaganov et al. NF-B-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. PNAS. 2006; 103(33): 1248112486. Liu et al. MiR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regula

17、tes murine macrophage inflammatory responses. PNAS. 2009; 106(37): 1581915824. Taganov et al. MicroRNAs and immunity: tiny players in a big field. Immunity. 2007; 26(2): 133137.Xiao et al. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 2009; 136(1): 2636. OConnell et al. MicroRNA-155

18、 is induced during the macrophage inflammatory response. PNAS. 2007; 104, 16041609. OConnell et al. Inositol phosphatase SHIP1 is a primary target of miR-155. PNAS.2009; 106(17): 71137118.Cardoso et al. miR-155 modulates microglia-mediated immune response by down-regulating SOCS-1 and promoting cyto

19、kine and nitric oxide production. Immunology. 2012;135(1):73-88. microRNAs play an important role not only in the differentiation and development of immune cells, but also in the regulation of immune response.BackgroundObjective100 ng/ml LPS, 24hMurine primary macrophagesExpression level of iNOS,TNF

20、- and IL-12p40 mRNAMicroarray analysis of miRNA expressionmiRNA expression with quantitative real-time PCRTechnical route 1 To identify microRNAs induced by LPS in murine macrophagesResults 1LPS-induced expression of miR-210 in murine macrophages.Fasanaro et al. MicroRNA-210 modulates endothelial ce

21、ll response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosine kinase ligand Ephrin-A3. J Biol Chem. 2008; 283(23): 1587815883.Chan et al. MicroRNA-210 controls mitochondrial metabolism during hypoxia byrepressing the iron-sulfur cluster assembly proteins ISCU1/2. Cell Metab. 2009; 10(4):273284.Biswas et

22、 al. Hypoxia inducible microRNA-210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. PNAS. 2010; 107(15): 69766981.Chan et al. MicroRNA-210: a unique and pleiotropic hypoxamir. Cell Cycle. 2010; 9(6): 10721083. Tsuchiya et al. MicroRNA-210 regulates can

23、cer cell proliferation through targeting fibroblast growth factor receptor-like 1 (FGFRL1). J Biol Chem. 2011; 286(1): 420428.microRNA-210HIF-1 siRNAControl siRNAExpression ofHIF-1Peritoneal macrophagesExpression of miR-210To investigate whether HIF1- was involved in LPS-induced miR-210 expressionTe

24、chnical route 2Results 2 HIF1- increases miR-210 expression.miRNA-210 inhibitormiRNA-210 mimicsmiR-210 expressionPeritoneal macrophagesExpression and secretion of IL-6 and TNF-aTo investigate the possible role of miR-210 in LPS/TLR4 signaling for macrophageTechnical route 3Results 3-1miR-210 mimics

25、inhibits TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.Results 3-2miR-210 inhibitor increases TLR4-induced proinflammatory cytokines expression.Technical route 4miRNA-210 mimic or control mimicMyD88, TRAF6, TAK1 plus TAB1, or IKK-, along with NF-B reporter plasmidHEK293To determine the function and molecular order of miR-210 in the LPS-induced NF-B activationResults 4miR-210 targets molecules downstream of IKK