醫(yī)學免疫學實驗Djp1 免疫學實驗課_1_沉淀反應

1、1免疫學診斷、沉淀反應2 實驗室安全門窗、水、電、火源w實驗結束后關閉門窗、水、電、火源w酒精燈和易燃物的使用注意事項；棉塞著火須報告老師w電源空氣開關w水的使用實驗室安全生物安全w白大褂的穿著要求w不得將實驗無關物品帶入實驗室w不得在實驗室內飲食w不得擅自開UV燈w污染及潛在污染物品須進行消毒處理3 實驗課要求w遵守上述規(guī)則w必備物品：實驗指導、實驗報告、紅藍鉛筆、白大褂w注意保護自己、愛惜實驗室儀器和設施w按照實驗要求，認真完成實驗并如實記錄實驗報告w實驗結束后整理本組的臺面w實驗廢棄物分類（污染/潛在污染物、普通廢棄物）放置；w在確認普通廢棄物沒有著火隱患后，倒入垃圾桶4 值日生的職責：

2、w檢查實驗臺面的整理w整理實驗室及垃圾w關閉所有非必需的電器和電源w逐一檢查并確認水槽水龍頭的關閉w關閉窗、門w最后離開實驗室5單向免疫擴散 (講解)雙向免疫擴散試驗（操作）3. 對流免疫電泳（看示教結果）6在半固體瓊脂中進行： 單向免疫擴散雙向免疫擴散對流免疫電泳 沉淀反應（原理）: 可溶性抗原（血清蛋白質、細胞裂解液、組織浸液、微生物蛋白等）與相應的可溶性抗體，在一定的抗原抗體比例下，在一定離子濃度的緩沖體系中，發(fā)生反應，出現(xiàn)沉淀物，稱沉淀反應。在液體中進行： 免疫比濁法：濁度儀（分光光度儀/酶標儀）7 3. 可見性: -取決于抗原取決于抗原-抗體的抗體的濃度濃度和和比例比例； （1）足夠

3、的濃度濃度： （2）適宜的比例比例： 最大最大的抗原抗原-抗體復合物抗體復合物的出現(xiàn) （白色沉淀白色沉淀） 2. 可逆性：非共價鍵非共價鍵；溫度、酸堿度、離子強度；（見后）（見后） 1. 特異性：抗原表位表位-抗體可變區(qū)可變區(qū)，特異性越強-親和力親和力越強抗原抗體反應的特點抗原抗體反應的特點4.抗原抗體反應的二個階段： i: 特異性結合階段：快 ii: 可見反應階段：數(shù)分鐘-數(shù)日8(三) 影響抗原抗體反應的因素 1.溫度： a: 分子熱運動，溫度越高，反應越快； b: 非共價鍵；蛋白質變性 c: 一般最適溫度為一般最適溫度為37 d: 4，過夜，過夜 2.電解質： a: 蛋白質， 兩性分子 b

4、: 離子強度，鹽析 c: 常用常用0.85%生理鹽水生理鹽水 3.pH： a: 一般最適一般最適pH6-8 b: 假陽性：等電點時，電荷為零, 沉淀/凝積9 定量分析 方法: （1）瓊脂42-50溶化，加入已知已知濃度的抗體濃度的抗體，混勻，倒板，冷卻，凝固，打孔 （2）孔中加待測抗原待測抗原， （3）37 ，擴散； 比例合適時，出現(xiàn)白色沉淀環(huán)比例合適時，出現(xiàn)白色沉淀環(huán)， （4）測定沉淀環(huán)沉淀環(huán)直徑直徑。 （5）根據(jù)標準曲線（方程），計數(shù)待測抗原的濃度待測抗原的濃度。已知濃度的抗體瓊脂中含有制作標準曲線：已知的不同濃度的抗原y = k.x + b 趙x錢x孫x李x周x鄭x* 制作標準曲線制作標

5、準曲線：5M10M20M40M80M 160Meg: 2M適宜的比例比例已知抗原的不同濃度5M10M20M40M直徑直徑2M10抗原和抗體分別分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由擴散; 相遇后，在比例合適處，形成沉淀線。*抗原或抗體的定性和組成分析?？乖贵w抗體抗原11根據(jù)沉淀線的形狀，可鑒定兩樣本的抗原是相同、部分相同或完全不同如果Ag1和Ag2, 遷移率（濃度/分子大?。┎煌?，如何？多克隆抗體（Ab-1,2,4）多克隆抗體（Ab-1,2,4）多克隆抗體（Ab-1,2,4）多克隆抗體（Ab-1,2,4）12 1、3孔加抗AFP抗體 2孔，AFP陽性對照血清 4孔，待檢血清 pH 8.6巴比妥緩沖液1234+-抗體陽性對照待測血清13AbAg電場力pH8.6pI7.5pI4.8瓊脂糖：在瓊脂糖：在pH8.6的緩沖液中帶負電的緩沖液中帶負電與瓊脂糖接觸的可移動液體：帶正電與瓊脂糖接觸的可移動液體：帶正電電滲力合力合力移動方向移動方向原理：原理：14 對流免疫電泳對流免疫電泳151. 瓊脂板制備 (1%，5ml) 2. 打孔；3. 加樣；4. 濕盒擴散；37C，24h 123456Ab123456Ab Note1塊玻片上打2套孔套孔，選較好的進行后續(xù)試驗；注意檢查加樣樣品是否正確，加樣時勿溢出溢出