Aptamer技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用

1、Aptamer技術(shù)在食品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用技術(shù)在食品監(jiān)測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用小組成員：何艷蘇、吳佳、蔡旋小組成員：何艷蘇、吳佳、蔡旋第一節(jié)第一節(jié) Aptamer Aptamer技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理 一、一、AptamerAptamer技術(shù)的發(fā)展歷程技術(shù)的發(fā)展歷程 二、二、AptamerAptamer技術(shù)的基本概念技術(shù)的基本概念 二、二、AptamerAptamer技術(shù)的原理技術(shù)的原理第二節(jié)第二節(jié) 核酸適配體的產(chǎn)生核酸適配體的產(chǎn)生 一、核酸適配體的制備一、核酸適配體的制備 二、相較之于抗體的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)二、相較之于抗體的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn) 三、其他優(yōu)點(diǎn)三、其他優(yōu)點(diǎn) 第三節(jié)第三節(jié) Aptamer Aptamer技

2、術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用 一、檢測(cè)金屬離子一、檢測(cè)金屬離子 二、檢測(cè)有機(jī)小分子二、檢測(cè)有機(jī)小分子 三、檢測(cè)抗生素三、檢測(cè)抗生素 四、檢測(cè)真菌毒素四、檢測(cè)真菌毒素 五、檢測(cè)其他非法添加物五、檢測(cè)其他非法添加物第四節(jié)第四節(jié) Aptamer Aptamer技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀 一、探討與展望一、探討與展望 二、問題與挑戰(zhàn)二、問題與挑戰(zhàn) 第一節(jié)第一節(jié) Aptamer技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理一、一、AptamerAptamer技術(shù)的發(fā)展歷程技術(shù)的發(fā)展歷程l1989年年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)化學(xué)獎(jiǎng) University of Colorado 的Thoas Cach 和

3、Yale 的Sydney Altaman發(fā)現(xiàn)了四膜蟲第一類內(nèi)因子和RNase P的RNA具有催化活性，證明RNA不僅是DNA到蛋白質(zhì)的信號(hào)員，而且也可以像蛋白質(zhì)一樣催化化學(xué)反應(yīng)。引出引出 RNA是否是生命物質(zhì)起源的問題？是否是生命物質(zhì)起源的問題？三件事證明RNA是生命物質(zhì)起源的假說：1、找到完全或主要依賴RNA進(jìn)行生命活動(dòng)的生物；2、如果在現(xiàn)存生物的基因組里找到負(fù)責(zé)基本生命活動(dòng)的功能性RNA的“痕跡”；3、如果我們能從隨機(jī)RNA序列庫中篩選到能夠完成基本生命活動(dòng)的RNA序列。 前兩個(gè)實(shí)現(xiàn)的困難較大，第三個(gè)如果對(duì)于任意給定對(duì)的粒子（包括離子、寡肽、蛋白質(zhì)等），都能找出一個(gè)具有相當(dāng)親和性和特異性的

4、RNA序列，我們就向證明“RNA起源說”邁出了一步。 90年代，人們用不同分子作為target篩選了和它們特異性結(jié)合的RNA分子，并開始命名其為aptamer。Papers inScienceand Nature:1 Tuerk C,Gold L.1990.Systemic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science 249:505-10;2 Ellington AD,Szostak JW.1990.In vitro of RNA mo

5、lecules that bind specific ligands.Nature 346:818-22開始于生物化學(xué)，得寵于化學(xué)生物學(xué) 二、二、AptamerAptamer技術(shù)的定義技術(shù)的定義1 1、核酸適配體是一段、核酸適配體是一段DNADNA或者或者RNARNA序列，是利用體外篩序列，是利用體外篩選技術(shù)從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。選技術(shù)從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。2 2、核酸適配體其本質(zhì)是一段與靶物質(zhì)具有高親和力和、核酸適配體其本質(zhì)是一段與靶物質(zhì)具有高親和力和高特異性的寡核苷酸鏈。高特異性的寡核苷酸鏈。 具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和靶分子廣等特點(diǎn)，近年具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和

6、靶分子廣等特點(diǎn)，近年來被廣泛用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。來被廣泛用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。三、三、AptamerAptamer技術(shù)的原理技術(shù)的原理 核酸分子之間可以通過堿基配對(duì)而特異性結(jié)合；核酸分子之間可以通過堿基配對(duì)而特異性結(jié)合；但不限于此，核酸分子亦可形成多種穩(wěn)定的次級(jí)結(jié)但不限于此，核酸分子亦可形成多種穩(wěn)定的次級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)、發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、口袋等，與靶分構(gòu)，如莖環(huán)、發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、口袋等，與靶分子形成空間互補(bǔ)，通過靜電作用、范德華力以及氫子形成空間互補(bǔ)，通過靜電作用、范德華力以及氫鍵等分子間作用力，而與靶分子緊密和特異性結(jié)合。鍵等分子間作用力，而與靶分子緊密和特異性結(jié)合。 第二節(jié)第二節(jié) 核酸適

7、配體的產(chǎn)生核酸適配體的產(chǎn)生 隨著食品安全問題的頻發(fā)，已經(jīng)嚴(yán)重影響了消費(fèi)者對(duì)隨著食品安全問題的頻發(fā)，已經(jīng)嚴(yán)重影響了消費(fèi)者對(duì)于食品安全的信心。傳統(tǒng)的食品安全檢測(cè)方法包括氣相色于食品安全的信心。傳統(tǒng)的食品安全檢測(cè)方法包括氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜、原子吸收等，因?yàn)槠潇`敏度高，穩(wěn)譜、液相色譜、質(zhì)譜、原子吸收等，因?yàn)槠潇`敏度高，穩(wěn)定性好被廣泛地用于食品安全檢測(cè)分析，但是開發(fā)簡單、定性好被廣泛地用于食品安全檢測(cè)分析，但是開發(fā)簡單、快速、高效食品安全檢測(cè)方法仍是一項(xiàng)緊迫而重要的任務(wù)?？焖佟⒏咝称钒踩珯z測(cè)方法仍是一項(xiàng)緊迫而重要的任務(wù)。 在這樣的背景下，在這樣的背景下，Aptamer技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

8、一、核酸適配體的制備一、核酸適配體的制備 核酸適配體是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment. SELEX技術(shù))篩選出來，SELEX技術(shù)是從體外一個(gè)含1015單鏈寡核普酸庫中篩選出與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，通過洗脫程序去除掉未與靶物質(zhì)相結(jié)合的核酸，再以這些核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行下一輪篩選，通過重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的DNA或RNA分子相繼被洗去，而與靶物質(zhì)有高親和力的核酸適配體從非常大的隨機(jī)文庫中分離出來，且純度

9、隨SELEX過程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫的大多數(shù)(大于90%左右)。SELEX技術(shù)：技術(shù)：SELEXSELEX（指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化）技術(shù)：（指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化）技術(shù)： 基本流程如下基本流程如下: : 概括為：概括為：結(jié)合結(jié)合 分離分離 洗脫洗脫 擴(kuò)增擴(kuò)增 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)圖圖1:SELEX篩選循環(huán)過程示意圖篩選循環(huán)過程示意圖 核酸適配體被比喻為核酸適配體被比喻為“化學(xué)抗體化學(xué)抗體”，但相比于傳統(tǒng)的抗體，但相比于傳統(tǒng)的抗體又具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如又具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如:a.靶分子范圍非常廣泛：從金屬離子到有機(jī)小分子、氨基酸、靶分子范圍非常廣泛：從金屬離子到有機(jī)小分子、氨基酸、蛋白質(zhì)、甚至細(xì)

10、胞。蛋白質(zhì)、甚至細(xì)胞。b.篩選過程不依賴于生物體：并且適配體的篩選過程無需在生篩選過程不依賴于生物體：并且適配體的篩選過程無需在生理?xiàng)l件下進(jìn)行，可以篩選出沒有免疫原性或低免疫原性，甚至理?xiàng)l件下進(jìn)行，可以篩選出沒有免疫原性或低免疫原性，甚至具有毒性的靶物質(zhì)的核酸適配體。具有毒性的靶物質(zhì)的核酸適配體。 二、相較之于抗體的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)二、相較之于抗體的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)c.除此之外，可以通過體外人工合成，獲得成本低廉、高除此之外，可以通過體外人工合成，獲得成本低廉、高純度、具有好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的核酸適配體。純度、具有好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性的核酸適配體。d.并且這些核酸適配體的末端易于修飾上各種活性基團(tuán)如

11、并且這些核酸適配體的末端易于修飾上各種活性基團(tuán)如:氨基、磷酸基、琉基、熒光標(biāo)記物、電化學(xué)標(biāo)記物等，氨基、磷酸基、琉基、熒光標(biāo)記物、電化學(xué)標(biāo)記物等，用于表面固定修飾或者檢測(cè)。用于表面固定修飾或者檢測(cè)。三、其他優(yōu)點(diǎn)三、其他優(yōu)點(diǎn)u(1)具有專一性識(shí)別靶目標(biāo)的特性具有專一性識(shí)別靶目標(biāo)的特性;u(2)具有高的化學(xué)穩(wěn)定性，可在具有高的化學(xué)穩(wěn)定性，可在pH 2-12之間保之間保持穩(wěn)定，即使經(jīng)過持穩(wěn)定，即使經(jīng)過100變性，在室溫下也可以恢復(fù)變性，在室溫下也可以恢復(fù);u(3)適配體可以通過折疊與去折疊捕獲和釋放適配體可以通過折疊與去折疊捕獲和釋放靶目標(biāo)，使得適配體修飾的表而可以重復(fù)使用靶目標(biāo)，使得適配體修飾的表

12、而可以重復(fù)使用;u(4)適配體種類的多元化進(jìn)一步擴(kuò)大了傳感器目標(biāo)分子的范圍適配體種類的多元化進(jìn)一步擴(kuò)大了傳感器目標(biāo)分子的范圍;u(5)適配體易于修飾，可以靈活方便地構(gòu)建各種傳感檢測(cè)方法。適配體易于修飾，可以靈活方便地構(gòu)建各種傳感檢測(cè)方法。 第第三三節(jié)節(jié) Aptamer技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用用 因其簡便、高效、快捷的特點(diǎn)，而廣泛因其簡便、高效、快捷的特點(diǎn)，而廣泛應(yīng)用于生物組裝、藥物遞送、信號(hào)轉(zhuǎn)換、基應(yīng)用于生物組裝、藥物遞送、信號(hào)轉(zhuǎn)換、基因表達(dá)調(diào)控及食品安全領(lǐng)域。因表達(dá)調(diào)控及食品安全領(lǐng)域。圖圖2：Aptamer的篩選與應(yīng)用的篩選與應(yīng)用法一：某科學(xué)家篩選出一種核酸適配

13、體通過構(gòu)型轉(zhuǎn)換形法一：某科學(xué)家篩選出一種核酸適配體通過構(gòu)型轉(zhuǎn)換形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)用于綁定地下水中三價(jià)砷和五價(jià)砷。成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)用于綁定地下水中三價(jià)砷和五價(jià)砷。結(jié)合常數(shù)分別可達(dá)結(jié)合常數(shù)分別可達(dá)7nmo1/L7nmo1/L和和5nmol/L5nmol/L。 （靈敏度高）（靈敏度高）法二：通過核酸適配體和金納米粒子利用比色法實(shí)現(xiàn)對(duì)法二：通過核酸適配體和金納米粒子利用比色法實(shí)現(xiàn)對(duì)三價(jià)砷離子的快速檢驗(yàn)。針對(duì)三價(jià)砷的核酸適配體在三三價(jià)砷離子的快速檢驗(yàn)。針對(duì)三價(jià)砷的核酸適配體在三價(jià)砷離子存在的情況下與砷離子結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色，而帶有價(jià)砷離子存在的情況下與砷離子結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色，而帶有正電荷的正電荷的PDDAPDDA

14、會(huì)導(dǎo)致帶負(fù)電荷的金納米粒子的聚集，從會(huì)導(dǎo)致帶負(fù)電荷的金納米粒子的聚集，從而顏色由紅變藍(lán)實(shí)現(xiàn)比色法測(cè)定。而顏色由紅變藍(lán)實(shí)現(xiàn)比色法測(cè)定。 （方便、快捷）（方便、快捷）一、檢測(cè)金屬離子一、檢測(cè)金屬離子（一）砷離子（一）砷離子圖圖3：Aptamer用于用于As3+檢驗(yàn)檢驗(yàn) 汞離子的危害：是一種高毒性并分布廣泛的污染物，在魚類及貝類中常常以甲基汞的形式存在。汞通過食物攝入后對(duì)人體的危害主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及腎臟，此外對(duì)呼吸系統(tǒng)、皮膚、血液及眼睛也有一定的影響。 利用核酸適配體與鉛和汞分別形成G-quartet結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的構(gòu)型實(shí)現(xiàn)了對(duì)鉛和汞的同時(shí)測(cè)定(見圖4)?，F(xiàn)已開發(fā)了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜

15、微滴傳感器，利用核酸適配體修飾的納米粒子實(shí)現(xiàn)了對(duì)汞離子的高靈敏快速檢測(cè)。 檢測(cè)限可達(dá)10pmol/L.（二）汞離子（二）汞離子圖圖4：核酸適配體同時(shí)檢測(cè)：核酸適配體同時(shí)檢測(cè)Hg2+和和Pb2+示意圖示意圖 雙酚雙酚A A是己知的內(nèi)分泌干擾素，可以發(fā)揮雌激素的作用是己知的內(nèi)分泌干擾素，可以發(fā)揮雌激素的作用擾亂人體內(nèi)的代謝過程。擾亂人體內(nèi)的代謝過程。20102010年，加拿大成為首個(gè)將之列年，加拿大成為首個(gè)將之列為有毒物質(zhì)的國家。在歐盟和加拿大，雙酚為有毒物質(zhì)的國家。在歐盟和加拿大，雙酚A A被禁止用于被禁止用于生產(chǎn)嬰兒奶瓶。生產(chǎn)嬰兒奶瓶。二二、 檢測(cè)有機(jī)小分子檢測(cè)有機(jī)小分子（一）雙酚（一）雙酚A

16、雙酚雙酚A A檢測(cè)過程如下：檢測(cè)過程如下：該方法的檢測(cè)限可達(dá)該方法的檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/mL，特別靈敏。，特別靈敏。檢測(cè)雙酚檢測(cè)雙酚A A的另一種方法：的另一種方法： 此外科學(xué)家篩選出雙酚A的核酸適配體，并開發(fā)了一種基于三明治結(jié)構(gòu)核酸適配體的雙酚A生物傳感器。將一段Aptamer定在傳感器表面用于對(duì)雙酚A的捕獲，另一段熒光標(biāo)記的Aptamer通過三明治結(jié)構(gòu)連接到傳感器表面，通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)對(duì)雙酚A濃度的檢測(cè)。圖圖5：Aptamer檢測(cè)雙酚檢測(cè)雙酚A示意圖示意圖 三聚氰胺是一種以尿素為原料生產(chǎn)的氮雜環(huán)有三聚氰胺是一種以尿素為原料生產(chǎn)的氮雜環(huán)有機(jī)化合物，常溫下為白色單斜晶體，沒有顯著異味

17、。機(jī)化合物，常溫下為白色單斜晶體，沒有顯著異味。目前主要用于木材加工、涂料、造紙等工業(yè)生產(chǎn)過目前主要用于木材加工、涂料、造紙等工業(yè)生產(chǎn)過程，但有些不法商販將其添加到奶粉中提高程，但有些不法商販將其添加到奶粉中提高“氮含氮含量量”，引發(fā)了嚴(yán)重的食品安全事件。因此，研究一，引發(fā)了嚴(yán)重的食品安全事件。因此，研究一種方便、快捷、高效的檢測(cè)方法尤為重要。種方便、快捷、高效的檢測(cè)方法尤為重要。（二）三聚氰胺（二）三聚氰胺圖圖6：基于：基于Aptamer修飾的銀納米粒子利修飾的銀納米粒子利用光散射檢測(cè)三聚氰胺用光散射檢測(cè)三聚氰胺 可卡因增加耐藥性和藥物依賴，從而導(dǎo)致濫用。Takeuchi小組利用可卡因Apt

18、amer與客體間的特異性結(jié)合，制備了可卡因快速檢測(cè)芯片，其原理類似于對(duì)雙酚A的比色法檢測(cè)。（三）可卡因（三）可卡因三、檢測(cè)抗生素三、檢測(cè)抗生素近年來，基于核酸適配體檢測(cè)抗生素的文獻(xiàn)報(bào)道較多，分別涉及電化學(xué)法、比色法、表面等離子共振等方法，涉及的種類有卡那霉素(anamycir) 、妥布拉霉素(Tobramycir) 、四環(huán)素(Tetracycline) ,氯霉素(Chloramphenicol) 、鏈霉素(Streptomycin) 、新霉素(Neomycin) 、土霉素（Oxytetracycline) 。 真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長所

19、產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物都有害。真菌毒素可以通過食物進(jìn)入人體，引對(duì)人類和動(dòng)物都有害。真菌毒素可以通過食物進(jìn)入人體，引起人體急性中毒、慢性中毒，具有致畸、致癌以及致突變作起人體急性中毒、慢性中毒，具有致畸、致癌以及致突變作用等。用等。 法一：電化學(xué)法法一：電化學(xué)法 法二：比色法法二：比色法 法三：熒光試劑條法法三：熒光試劑條法 四四、 檢測(cè)真菌毒素檢測(cè)真菌毒素電化學(xué)法：電化學(xué)法：它是基于Aptamer并利用信號(hào)關(guān)閉模式的電化學(xué)檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)赭曲霉毒素A的快速靈敏檢測(cè)。首先將三種單鏈DNA固定在電極表面，其中一種為赭曲霉毒素A的核酸適配體，通過核酸適配體與目標(biāo)物的特異性結(jié)合改變了亞甲基藍(lán)在

20、電極表面的電化學(xué)性質(zhì)，利用金納米粒子對(duì)信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)了對(duì)著曲霉毒素A的高靈敏快速檢測(cè)，檢測(cè)線可達(dá)30pg/mL。比色法：比色法：它是利用未修飾的金納米粒子實(shí)現(xiàn)對(duì)赭曲霉毒素A的比色法快速檢測(cè)。在赭曲霉毒素A存在的情況卜，核酸適配體與赭曲霉毒素A形成了G-quadruplex結(jié)構(gòu)，而金納米粒子在Mg2+的作用下發(fā)生聚集導(dǎo)致顏色變化，整個(gè)反應(yīng)過程在5分鐘內(nèi)完成，檢測(cè)線可達(dá)20nmo1/L。0pg/mL。圖圖7 7：熒光試劑條法檢測(cè)赭曲霉毒素：熒光試劑條法檢測(cè)赭曲霉毒素A A的原理圖的原理圖熒光試劑條法熒光試劑條法:u 孔雀石綠孔雀石綠(malachite green)(malachite green

21、)是一種合成的三苯基甲烷類工業(yè)染是一種合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，許多國家就將其廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲劑和殺菌劑，料，許多國家就將其廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲劑和殺菌劑，用來殺滅體外寄生蟲和魚卵中的霉菌。因孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)用來殺滅體外寄生蟲和魚卵中的霉菌。因孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時(shí)問長，并有致突變、致畸和致癌的危險(xiǎn)性，故我國、境中殘留時(shí)問長，并有致突變、致畸和致癌的危險(xiǎn)性，故我國、美國、加拿大以及歐盟等許多國家均禁止將其作為人類食用魚的美國、加拿大以及歐盟等許多國家均禁止將其作為人類食用魚的獸藥使用。孔雀石綠的核酸適配體在獸藥使用?？兹甘G的核酸適配體在19991999年就被發(fā)現(xiàn)，最近核酸年就被發(fā)現(xiàn)，最近核酸適配體被作為識(shí)別元素用于魚肉組織內(nèi)的孔雀石綠的熒光檢測(cè)。適配體被作為識(shí)別元素用于魚肉組織內(nèi)的孔雀石綠的熒光檢測(cè)。 u 阿特拉津阿特拉津(Atrazine)(Atrazine)在世界廣泛被使用，是最常使用的農(nóng)業(yè)用殺在世界廣泛被使用，是最常使用的農(nóng)業(yè)用殺草劑之一，但它屬于持久性有機(jī)污染物，不易分解，并且會(huì)從土草劑之一，但它屬于持久性有機(jī)污染物