已知基因序列的獲取方法

1、已知基因序列的獲取策略兼談引物設(shè)計(jì)與序列分析黃黃 鋼鋼第三軍醫(yī)大學(xué)遺傳教研室第三軍醫(yī)大學(xué)遺傳教研室2006.11.1.獲取序列信息，設(shè)計(jì)合適的引物選取相應(yīng)的組織或細(xì)胞相應(yīng)的組織或細(xì)胞，提取RNA并RTPCR擴(kuò)增獲得全長cDNA裝入合適的克隆或表達(dá)載體，菌落菌落PCR、酶切與測(cè)序證實(shí)根據(jù)需要進(jìn)一步進(jìn)行亞克隆RNase H消化（可選）一、如何獲取已知目的基因的序列信息n先查找其蛋白相關(guān)信息,了解該基因編碼產(chǎn)物的基本情況與功能（）n進(jìn)一步查找其核酸相關(guān)序列信息，常用數(shù)據(jù)庫：Genebank、EBI、DDBJ二、目的基因cDNA序列的獲取方法ncDNA文庫掃描nRT-PCR

2、n人工合成組織RNA的提取n在勻漿器中加工冷凍的組織n通過注射器加工冷凍的組織n在液氮中將組織研磨成粉末在液氮中將組織研磨成粉末n在液氮中研磨組織至粉末狀，細(xì)胞裂解更完全，產(chǎn)量比前二者多一倍。n合適的合適的RNA提取方法加上合適的組織處提取方法加上合適的組織處理方法，才能夠獲得最佳的提取效果理方法，才能夠獲得最佳的提取效果RNA提取兩要素n忌諱貪多忌諱貪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上組織，一般50mg用1mlTrizol較合適n速戰(zhàn)速?zèng)Q速戰(zhàn)速?zèng)Q：盡量縮短提取時(shí)間，不要完全照搬Protocol,比如勻漿后如果沒有很多組織碎片的話，可以立即加入氯仿，立即離心，14000rpm

3、離心10min,取完上清加入0.61體積的異丙醇，立即高速離心（14,000rpm,5min），. 總之盡量快速！盡量減少RNAase污染nRNase的危害主要集中在將RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重點(diǎn)應(yīng)當(dāng)放在組織樣本的保存和RNA水溶液的保存上。n注意實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：各種器材的去RNAase處理與無RNAase的準(zhǔn)備。n長期保存RNA時(shí)建議用去離子甲酰胺溶解總RNA沉淀如何確認(rèn)RNA的質(zhì)量nRNA的電泳圖譜的電泳圖譜n檢測(cè)RNA溶液的吸光度n保溫試驗(yàn)n熒光染色、毛細(xì)管電泳和Agilent2100生物分析儀分析28S18S5SRT引物的選用nGSP：適合序列肯定的模板，

4、常用于一步法RTPCR。但是引物設(shè)計(jì)質(zhì)量影響RT的結(jié)果。在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。nOligo dT引物:真核生物的mRNA適用，建議用于高質(zhì)量RNA及全長轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄；n隨機(jī)引物：適合各種RNA的RT，可用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。RT中提高合成全長cDNA的效率n消除mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)：逆轉(zhuǎn)錄之前將RT引物與RNA 模板進(jìn)行短暫的熱變性, 可破壞mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu), 促進(jìn)錨定引物與模板的正確配對(duì)。n選用RNase H滅活改造的新型耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶： Thermoscript、Superscript 等，RT后建議進(jìn)行RNase H消化處理。n錨定RT引物的選用：5(T)25V N3n熱

5、啟動(dòng)RTn有條件者選用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA 小于小于5微克微克可自己找公司合成可自己找公司合成建議用熱蓋建議用熱蓋PCR儀儀或空氣浴孵箱保溫或空氣浴孵箱保溫建議選用建議選用RNase H消化消化高保真DNA 多聚酶的選用n常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等nPCR過程中HotStart與Touchdown的使用n高保真DNA 多聚酶與普通rTaq的混合使用nPCR產(chǎn)物加A尾進(jìn)行T-A克?。貉h(huán)即將結(jié)束

6、時(shí)加入rTaq 5U 72 保溫2030 minn兩步變溫法PCR載體構(gòu)建中的常見問題n利用單酶切位點(diǎn)將片段插入載體n雙酶切中的問題n對(duì)過長cDNA片段:可分段擴(kuò)增，再利用RE位點(diǎn)或重疊延伸融合成全長cDNAn酶切位點(diǎn)甲基化的問題 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC真核表達(dá)載體的選擇nPromoter Conventional/Tissue-Specific/InduciblenPoly (A) tailnKozak序列：9GCCGCCA/GCCAUGG4一個(gè)載體內(nèi)的多基因表達(dá)nIRES系統(tǒng)n加linker直接融合表達(dá)n多個(gè)獨(dú)立的表達(dá) cassettes：優(yōu)于共轉(zhuǎn)

7、染表達(dá)SOE技術(shù)與基因人工合成及多基因融合技術(shù)與基因人工合成及多基因融合n基因設(shè)計(jì)與人工合成中的密碼子優(yōu)化nDNAWorks 2.4 (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2002) /dnaworks/SOE：Spliced by overlapping extension搭橋技術(shù)融合基因搭橋技術(shù)融合基因三、引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)的引物設(shè)計(jì)的3條基本原則：條基本原則：n引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)n引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，n引物不能在模板的

8、非目的位點(diǎn)引發(fā)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配即錯(cuò)配)。 引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)n引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38bp。 n引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。n引物3端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。n5端序列的修飾與標(biāo)記端序列的修飾與標(biāo)記：可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應(yīng)在5端限制酶位點(diǎn)外再加1-3個(gè)保護(hù)堿基。n簡并引物簡并引物：應(yīng)選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子

9、的Met, 3端應(yīng)不存在簡并性端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。n同源性或互補(bǔ)性同源性或互補(bǔ)性：兩引物間最好不存在4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。nGC含量：含量：一般為40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。 nTm值：值：引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳。有多種計(jì)算方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在軟件中常使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method) 。 nG值：值：指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G值較低（絕對(duì)值不超過9），而5端和中間G值

10、相對(duì)較高的引物。引物的3端的G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 Primer Premier 5.0n引物設(shè)計(jì)n限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析nDNA基元(motif)查找n同源性分析 Genetool V 2.0Oligo6.69四、測(cè)序圖比對(duì)、拼接與虛擬克隆(in silico cloning)n常用本地軟件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等n在線工具：BLAST等常用序列拼接軟件nDNAstar

11、 的SeqMan模塊nVectorNTI程序的Contig Express模塊nSequencher開始開始所有程序所有程序DNAstar SeqMan新的拼接任務(wù)新的拼接任務(wù)添加序列添加序列打開保存序列的文件夾打開保存序列的文件夾選擇序列選擇序列導(dǎo)入導(dǎo)入整理一下末端整理一下末端用鼠標(biāo)拖動(dòng)手用鼠標(biāo)拖動(dòng)手動(dòng)更改末端動(dòng)更改末端用鼠標(biāo)點(diǎn)擊更改用鼠標(biāo)點(diǎn)擊更改序列方向和形式序列方向和形式選擇載體選擇載體自動(dòng)查找自動(dòng)查找拼接拼接看看結(jié)果看看結(jié)果點(diǎn)開測(cè)序圖點(diǎn)開測(cè)序圖6種閱讀框種閱讀框選擇的序選擇的序列的位置列的位置NCBI查詢所選擇的序列查詢所選擇的序列保存結(jié)果保存結(jié)果打印成打印成PDF文文件也是一個(gè)不件也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇錯(cuò)的選擇運(yùn)行運(yùn)行VNTI 程序程序Contig Express程序窗口，可以設(shè)定參數(shù)，程序窗口，可以設(shè)定參數(shù)，一般用默認(rèn)值即可。一般用默認(rèn)值即可。導(dǎo)入測(cè)序結(jié)果（文導(dǎo)入測(cè)序結(jié)果（文件擴(kuò)展名件擴(kuò)展名ab1改成改成abi）相關(guān)軟件）相關(guān)軟件 EditView for Macs ；Chroma for Windows 也可以用鼠標(biāo)右鍵也可以用鼠標(biāo)右鍵導(dǎo)入后可以雙擊查看和編輯各個(gè)測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入后可以雙擊查看和編輯各個(gè)