[4]離體培養(yǎng)的無菌操作

1、Chapter 2 Micropropagation Equipments and Techniques植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)的基本設施和的基本設施和一般技術(shù)一般技術(shù)Sterile Culture Techniques 一、外植體的選擇一、外植體的選擇n外植體（explant）是指從活植物體上切取活植物體上切取下來的可以用于組織培養(yǎng)的組織或器官，下來的可以用于組織培養(yǎng)的組織或器官，它是植物離體培養(yǎng)的基礎材料。nExplant-Tissue taken from its original site and transferred to an artificial medium for grow

2、th or maintenance. 1. 外植體的來源外植體的來源 外植體來源的環(huán)境以及外植體的類型均會影響將來培養(yǎng)的順利與否，用于外植體分離的母體植物材料一般有三種來源：n生長在自然環(huán)境下的植物；n有目的培育在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物；n無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物。 2、外植體的選擇、外植體的選擇n外植體對誘導反應及其再生能力的影響體現(xiàn)在外植體的生理狀態(tài)上； n生理狀態(tài)年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細胞更有利于培養(yǎng)； n有性繁殖植物以胚或幼嫩果實為外植體較好；n無性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成功。 3、外植體的類型、外植體的類型n外植

3、體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時甚至影響分化的程度和器官類型（如桉樹、菊花等）； n外植體的取材方式還影響植株再生的途徑 ；n具有變態(tài)器官（如鱗莖、球莖、塊莖等）的植物，在組織培養(yǎng)中往往也容易形成相應的變態(tài)器官（如百合、水仙、馬鈴薯等）。 Stock plant selection and preparationSelection of a suitable mother plant is essential for successfulmicropropagationExplant Genetically superior Clean environment Young and

4、vigorous 4、外植體滅菌 （1） 幾種常用消毒劑的效果比較幾種常用消毒劑的效果比較 外植體的滅菌（2）n將待滅菌的外植體置于燒杯或容器中，其體積不要超過容器的三分之一。先加幾滴洗滌劑的水中清洗后，用一尼龍網(wǎng)或脫脂紗布覆蓋杯口，然后將其置于自來水管下沖洗20min；n用7075的乙醇處理0.51 min，立即除去乙醇，用潔凈水沖洗3次；n然后在燒杯中加入消毒劑（可選用下表介紹的任何一種），同時滴12滴土溫20，滅菌處理320 min；n燒杯置于凈化工作臺上，棄去消毒液，用無菌水清洗5次，每次12min；n滅菌后的外植體用無菌紙吸干水分備用。細菌污染長菌細菌污染長菌落落二、二、 無菌操作技

5、術(shù)無菌操作技術(shù)Sterile Culture Successful control of contamination depends largely upon the operators techniques in aseptic culture. You should always be aware of potential sources of contamination such as dust, hair, hands, and clothes. Obviously, your hands should be washed, sleeves rolled up, long hair t

6、ied back, etc. Washing your hands with 70% ethyl alcohol is an easy precautionary measure that can be taken. Talking or sneezing while culture material is exposed also can lead to contamination. When transferring plant parts from one container to another, do not touch the inside edges of either vess

7、el. By observing where contamination arises in a culture vessel, you may be able to determine the source of contamination. 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一 有菌的范疇是有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺表面、簡單煮點，無菌室等未處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未

8、處理之前、我沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。洗得多干凈等等都是有菌的。 菌包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。 菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋件要

9、求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。生。一般操作技術(shù)一般操作技術(shù)滅菌滅菌一般操作技術(shù)一般操作技術(shù)滅菌滅菌 無菌的范疇是無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學的滅菌方過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學的滅菌方法處理后的物體；法處理后的物體； 滅菌滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的微生物全部殺死。有生命的微生物全部殺死。一般操作技術(shù)一般操作技術(shù)滅菌滅菌 消毒：消毒：指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生指殺死、

10、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用危害作用. 顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺、接種室、超凈臺、等等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。的微生物。 在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。一般操作技術(shù)一般操作技術(shù)滅菌滅菌 常

11、用的滅菌方法常用的滅菌方法 物理方法物理方法 如干熱如干熱(烘燒和灼燒烘燒和灼燒)、濕熱、濕熱(常壓或高壓蒸煮常壓或高壓蒸煮)、射、射線處理線處理(紫外線、超聲波、微波紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；沖洗等措施； 化學方法化學方法 使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不伺材料不同目的適當選用。和藥劑要根據(jù)工作中的不伺材料不同目的適當選用。一般操作技術(shù)一般操作技術(shù)滅菌滅菌1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌、培養(yǎng)基用濕熱滅菌高壓蒸汽滅菌2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌（95%的酒精，酒精燈火焰上灼燒）3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌（烘箱加熱到160-180持續(xù)90分鐘）4、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌（一些生長調(diào)節(jié)劑如赤霉素、玉米素、脫落酸和一些化學成分在高溫高壓下會發(fā)生降解而失去效能或降低效能）5、空間采用紫外線和熏蒸滅菌、空間采用紫外線和熏蒸滅菌（紫外線滅菌與熏