細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)

1、廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院廣東藥學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院食品生物技術(shù)課件E-mail:z_c_ 手機(jī)手機(jī)鄭 傳傳 進(jìn)進(jìn)第六章細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)第六章細(xì)胞工程與食品產(chǎn)業(yè)主要內(nèi)容n細(xì)胞工程的概念、研究范疇細(xì)胞工程的概念、研究范疇n植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)n動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)n細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)n細(xì)胞拆合技術(shù)細(xì)胞拆合技術(shù)第一節(jié)、概述第一節(jié)、概述 利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用工程學(xué)的方法，在細(xì)胞水平上研究改造應(yīng)用工程學(xué)的方法，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，從而獲得特定生物遺傳特性和生物學(xué)特性，從而獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品

2、或新生物品種的一門綜合的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物品種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。性科學(xué)技術(shù)。概念概念1 1 細(xì)胞工程的概念及研究范疇細(xì)胞工程的概念及研究范疇研究范疇研究范疇動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞融合細(xì)胞核移植（細(xì)胞拆合）細(xì)胞核移植（細(xì)胞拆合）染色體工程染色體工程胚胎工程胚胎工程干細(xì)胞與組織工程干細(xì)胞與組織工程細(xì)胞生物反應(yīng)器細(xì)胞生物反應(yīng)器 1 1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 2 2）動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)）動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 3 3）細(xì)胞融合技術(shù)）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）（體細(xì)胞雜交技術(shù)） 4 4） 細(xì)胞拆合細(xì)胞

3、拆合核核移植技術(shù)移植技術(shù)5 5）染色體工程技術(shù)）染色體工程技術(shù)染色體工程是按人們的需要來添加、削減或染色體工程是按人們的需要來添加、削減或替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。主要分為動(dòng)物染色體工程和新品種的一種技術(shù)。主要分為動(dòng)物染色體工程和植物染色體工程植物染色體工程6 6）胚胎工程技術(shù)）胚胎工程技術(shù)7 7）干細(xì)胞和組織工程）干細(xì)胞和組織工程8 8）細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器）細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器2 2、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用 紫杉醇紫杉醇( (taxoltaxol) )是從紅是從紅豆杉屬豆杉屬( (TaxusTaxus

4、L.) L.)植物中植物中分離出的一個(gè)具有獨(dú)特抗分離出的一個(gè)具有獨(dú)特抗腫瘤活性的二萜類化合物，腫瘤活性的二萜類化合物，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療卵巢現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療卵巢癌和乳腺癌。癌和乳腺癌。三、三、動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞工程的應(yīng)用1.1.在疫苗生在疫苗生產(chǎn)產(chǎn)上的上的應(yīng)應(yīng)用用 。 將將乙型肝炎表面抗原基因乙型肝炎表面抗原基因插插入哺乳入哺乳動(dòng)動(dòng)物物細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)進(jìn)進(jìn)行高效表行高效表達(dá)達(dá)，已生，已生產(chǎn)產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。出乙型肝炎疫苗。2. 2. 生生產(chǎn)產(chǎn)單單克隆抗體克隆抗體 單單克隆抗體可以克隆抗體可以檢測檢測出多出多種種病毒中非常病毒中非常細(xì)細(xì)微的微的株株間間差差異異，鑒鑒定定細(xì)細(xì)菌的菌的種種型和

5、型和亞種亞種。3.3.繁育繁育優(yōu)優(yōu)良品良品種種。 目前，人工受精、胚胎移植等技目前，人工受精、胚胎移植等技術(shù)術(shù)已廣泛已廣泛應(yīng)應(yīng)用用于畜牧于畜牧業(yè)業(yè)生生產(chǎn)產(chǎn)。4. 4. 在干在干擾擾素生素生產(chǎn)產(chǎn)上的上的應(yīng)應(yīng)用用 是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條是指動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的生長、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再件下的生長、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再形成組織的一項(xiàng)技術(shù)。形成組織的一項(xiàng)技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)第二節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第二節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、一、 植物細(xì)胞工程的發(fā)展植物細(xì)胞工程的發(fā)展細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立：的創(chuàng)立：1838183818391839年間由年間由德國

6、的植物學(xué)家施萊登（德國的植物學(xué)家施萊登（SchleidenSchleiden）和）和動(dòng)物學(xué)家施旺（動(dòng)物學(xué)家施旺（SchwannSchwann）所提出）所提出, ,直到直到18185858年才較完善。年才較完善。 理論基礎(chǔ)和探索理論基礎(chǔ)和探索19021902年，德國著名植物生理學(xué)年，德國著名植物生理學(xué)家家HaberlandtHaberlandt, , 提出提出細(xì)胞全能性學(xué)細(xì)胞全能性學(xué)說說，并，并首次進(jìn)行高等植物的細(xì)胞培養(yǎng)首次進(jìn)行高等植物的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，但細(xì)胞未能發(fā)生細(xì)胞分裂和增實(shí)驗(yàn)，但細(xì)胞未能發(fā)生細(xì)胞分裂和增殖。殖。17561756年，年，MonceanMoncean首先發(fā)現(xiàn)植物首先發(fā)現(xiàn)植物在在

7、受傷愈合的組織皮層能產(chǎn)生芽受傷愈合的組織皮層能產(chǎn)生芽，因而預(yù)言這一途徑可以成為一種繁因而預(yù)言這一途徑可以成為一種繁殖方式殖方式培養(yǎng)技術(shù)建立培養(yǎng)技術(shù)建立植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展20世紀(jì)世紀(jì)40年代：年代：J.Bonner 銀膠菊組織培養(yǎng)生產(chǎn)橡銀膠菊組織培養(yǎng)生產(chǎn)橡膠。膠。20世紀(jì)世紀(jì)70年代：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成份。年代：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成份。20世紀(jì)世紀(jì)80年代：年代：400多種植物，多種植物，600多種代謝產(chǎn)物。多種代謝產(chǎn)物。40多種植物次生代謝產(chǎn)物達(dá)到或超過植株產(chǎn)量。多種植物次生代謝產(chǎn)物達(dá)到或超過植株產(chǎn)量。20世紀(jì)世紀(jì)90年代：年代：1000多種植物。多種植物。

8、 1.首先，首先，要取材和除菌要取材和除菌。用一定的化學(xué)試劑對(duì)。用一定的化學(xué)試劑對(duì)材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時(shí)還要借助某材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時(shí)還要借助某些特定的酶，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生些特定的酶，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生長的細(xì)胞。長的細(xì)胞。 常用的消毒滅菌劑常用的消毒滅菌劑: :效果較好的有幾種化學(xué)試劑，效果較好的有幾種化學(xué)試劑，如如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。等。二、細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟二、細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟 2.其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點(diǎn)，配制細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌。采用無菌操作養(yǎng)基，

9、對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌。采用無菌操作技術(shù)，將技術(shù)，將生物材料接種于培養(yǎng)基生物材料接種于培養(yǎng)基中。中。3. 最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，中，提供各類細(xì)胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件提供各類細(xì)胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。細(xì)胞達(dá)到一定生物量時(shí)應(yīng)及時(shí)收獲或傳代。 三三. .植物細(xì)胞培養(yǎng)基植物細(xì)胞培養(yǎng)基植物細(xì)胞的培養(yǎng)基植物細(xì)胞的培養(yǎng)基: :通常包括通常包括無機(jī)鹽、碳源、無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)素、有機(jī)添加劑維生素、生長調(diào)節(jié)素、有機(jī)添加劑等。等。 用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)

10、基營養(yǎng)成分基本上與整個(gè)植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)基本上與整個(gè)植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求要求無機(jī)鹽無機(jī)鹽：有不少鹽可用來提供有不少鹽可用來提供“大量元素大量元素”和和“微量元素微量元素”，表中給出了常用培養(yǎng)基中，表中給出了常用培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的含量。無機(jī)鹽的含量。培養(yǎng)中的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞對(duì)蔗糖和葡萄糖蔗糖和葡萄糖都能利用，都能利用，果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用

11、其它糖作能源，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。但效果不佳。碳源和能源碳源和能源 培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要硫胺素硫胺素，加入，加入煙煙酸、泛酸、生物素和葉酸酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生，效果更好。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。維生素維生素雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入的氨基酸，但加入L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺或其他氨基酸混合或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產(chǎn)物蛋白酶解產(chǎn)物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基

12、酸。其它有機(jī)添加劑如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有機(jī)添加劑還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸氨基酸激素分為兩類，激素分為兩類，生長素和分裂素生長素和分裂素。生長素促進(jìn)。生長素促進(jìn)細(xì)胞生長，最有效和最常用的是細(xì)胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙吲哚乙酸和萘乙酸酸；分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生；分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是物。使用最多的是6-6-芐氨基嘌呤和玉米素芐氨基嘌呤和玉米素，對(duì)芽，對(duì)芽的誘導(dǎo)具有重要作用。分裂素和生長素通常一起的誘導(dǎo)具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進(jìn)細(xì)胞的分裂、生長。使用，來促進(jìn)細(xì)

13、胞的分裂、生長。植物生長激素植物生長激素四四. .愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織愈傷組織：是指外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一：是指外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散的排列的薄壁細(xì)胞，是分化的，團(tuán)不定型的疏散的排列的薄壁細(xì)胞，是分化的，而且還未形成組織的結(jié)構(gòu)。而且還未形成組織的結(jié)構(gòu)。外植體：外植體：是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體培養(yǎng)是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體培養(yǎng)的植物材料。的植物材料。 愈傷組織的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉選擇適宜的培養(yǎng)基：選擇適宜的培養(yǎng)基：MSMS，B5B5，N6N6較高激素

14、濃度較高激素濃度豐富的有機(jī)附加物。豐富的有機(jī)附加物。培養(yǎng)基中有較高含量的無機(jī)氮源培養(yǎng)基中有較高含量的無機(jī)氮源較低的蔗糖濃度較低的蔗糖濃度適當(dāng)縮短繼代培養(yǎng)的間隔時(shí)間有利于疏松易適當(dāng)縮短繼代培養(yǎng)的間隔時(shí)間有利于疏松易碎愈傷組織的形成。碎愈傷組織的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎適宜懸浮培養(yǎng)適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株適宜再生植株懸浮系的建立與培養(yǎng)懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150250ml flaskcentrifuge isolati

15、onsubculture1g/10ml medium100120 rmp culture transfer 1 time/3d80 rpm高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷二是均一性好二是均一性好三是生長速度快、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)三是生長速度快、次生代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)五五. .單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)機(jī)械法機(jī)械法將葉肉組織研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈將葉肉組織研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞?；?xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：不受酶的傷害，有利于細(xì)胞生理和生優(yōu)點(diǎn)：不受酶的傷害，有利于細(xì)胞生理和生化研究。缺點(diǎn)：手

16、工操作難度大，獲得完整的細(xì)化研究。缺點(diǎn)：手工操作難度大，獲得完整的細(xì)胞數(shù)量少。胞數(shù)量少。1 1、單細(xì)胞分離方法、單細(xì)胞分離方法酶法酶法利用利用果膠酶、纖維素酶果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他處理植物葉片或其他外植物體，使細(xì)胞分離。外植物體，使細(xì)胞分離。加滲透壓保護(hù)劑如加滲透壓保護(hù)劑如甘露醇甘露醇以防酶對(duì)細(xì)胞的損以防酶對(duì)細(xì)胞的損傷。傷。加加硫酸葡聚糖鉀鹽硫酸葡聚糖鉀鹽可提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量?？商岣哂坞x細(xì)胞的產(chǎn)量?；瘜W(xué)法化學(xué)法 利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。 草酸鈣草酸鈣處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可獲處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，可獲得分散細(xì)胞。得分散細(xì)胞。秋

17、水仙堿、秋水仙堿、2，4D或或LH?？醋o(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)2 2、單細(xì)胞培養(yǎng)方法、單細(xì)胞培養(yǎng)方法用一塊活躍生長的愈傷組織來促用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，效果好。簡便易行，效果好。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程。將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板培養(yǎng)植板率平板培養(yǎng)植板率優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯單細(xì)

18、胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察。篩選效率高、篩鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定點(diǎn)觀察。篩選效率高、篩選量大、操作簡便。選量大、操作簡便。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成 毒毒害或影響組織吸收。害或影響組織吸收。微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。胞團(tuán)的方法。置培養(yǎng)皿中置培養(yǎng)皿中2628 恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一可對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個(gè)細(xì)胞的生長、分裂

19、、分化等過程。個(gè)細(xì)胞的生長、分裂、分化等過程。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動(dòng)變動(dòng)幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。六六. .提高植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的方法提高植物細(xì)胞次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的方法加入前體物或誘導(dǎo)物加入前體物或誘導(dǎo)物前體物：前體物：次生代謝合成途徑中的某一中次生代謝合成途徑中的某一中間化合物或是合成的起始物。間化合物或是合成的起始物。誘導(dǎo)物：誘導(dǎo)物：一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度一類能引起植物細(xì)胞代謝強(qiáng)度變化或代謝途徑改變的物質(zhì)。變化或代謝途徑改變的物質(zhì)。毛狀根培養(yǎng)毛狀根培養(yǎng)毛狀根毛狀根(hairy roots

20、)是發(fā)根農(nóng)桿菌是發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其感染植物后，其Ri質(zhì)粒上的質(zhì)粒上的TDNA片斷整片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。 冠癭瘤培養(yǎng)冠癭瘤培養(yǎng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用（1 1）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料（2 2）生產(chǎn)食品添加劑）生產(chǎn)食品添加劑（3 3）生產(chǎn)天然食品）生產(chǎn)天然食品 七、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)七、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn)植物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物細(xì)胞對(duì)剪

21、切力敏感。 植物細(xì)胞培養(yǎng)通常形成細(xì)胞團(tuán)。植物細(xì)胞培養(yǎng)通常形成細(xì)胞團(tuán)。 植物細(xì)胞生長速度慢，操作周期長植物細(xì)胞生長速度慢，操作周期長 多泡沫。多泡沫。植物細(xì)胞在高濃度培養(yǎng)時(shí)為假塑性流體。植物細(xì)胞在高濃度培養(yǎng)時(shí)為假塑性流體。植物細(xì)胞的需氧量要比微生物要低的多。植物細(xì)胞的需氧量要比微生物要低的多。大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)需要光照。大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)需要光照。幾種流體特征幾種流體特征1-賓漢型 2-假塑性 3-牛頓型 4-漲塑性 1-漲塑性 2-牛頓型 3-假塑性 1.1.植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增

22、殖培養(yǎng)把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)1 1）培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸面大，傳質(zhì)效果好。）培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸面大，傳質(zhì)效果好。2 2）可帶走有害的代謝產(chǎn)物，避免了有害產(chǎn)物局部）可帶走有害的代謝產(chǎn)物，避免了有害產(chǎn)物局部濃度過高的問題。濃度過高的問題。3 3）能充分保證氧的供給。）能充分保證氧的供給。2.2.植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)植物細(xì)胞固定化培養(yǎng) 植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包裹于一些多糖植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的或多聚化合物上進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的技術(shù)。技術(shù)。固定化培養(yǎng)技術(shù)固定化培養(yǎng)技術(shù)（1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累；）

23、有利于次生物質(zhì)的合成、積累；（2）減弱剪切力損傷；減弱剪切力損傷；（3）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產(chǎn)物的收集；）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產(chǎn)物的收集；固定化培養(yǎng)優(yōu)勢固定化培養(yǎng)優(yōu)勢1 1）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（20世紀(jì)世紀(jì)70年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機(jī)械攪拌反年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機(jī)械攪拌反應(yīng)器。應(yīng)器。 1972年，年，Kato首先用機(jī)械攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)首先用機(jī)械攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)煙草細(xì)胞以獲取煙堿。煙草細(xì)胞以獲取煙堿。Fujita利用這種反應(yīng)器利用這種反應(yīng)器生產(chǎn)紫草寧。生產(chǎn)紫草寧。3.3.植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器機(jī)械

24、攪拌反應(yīng)器機(jī)械攪拌反應(yīng)器機(jī)械攪拌植物細(xì)胞反應(yīng)器機(jī)械攪拌植物細(xì)胞反應(yīng)器 機(jī)械攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題機(jī)械攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題 優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器最大的優(yōu)點(diǎn)就是獲優(yōu)點(diǎn)：機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器最大的優(yōu)點(diǎn)就是獲得得高的溶氧系數(shù)高的溶氧系數(shù) (KLa 100h-1)，植物細(xì)胞培養(yǎng)一植物細(xì)胞培養(yǎng)一般只需要般只需要KLa在在5-20 h-1之間就夠了；再是反應(yīng)器的之間就夠了；再是反應(yīng)器的溫度、溫度、pH值、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)的濃度較易控制值、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)的濃度較易控制。 存在的問題：主要問題是存在的問題：主要問題是剪切力問題剪切力問題；對(duì)只需；對(duì)只需較低較低kLa的植物細(xì)胞培養(yǎng)，促進(jìn)氧傳遞的機(jī)械

25、攪的植物細(xì)胞培養(yǎng)，促進(jìn)氧傳遞的機(jī)械攪拌，每拌，每單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大；機(jī)；機(jī)械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了無菌密封無菌密封問題。問題。非機(jī)械攪拌反應(yīng)器非機(jī)械攪拌反應(yīng)器 通常為氣體攪拌反應(yīng)器，是一種利用通入通常為氣體攪拌反應(yīng)器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓鼓泡式反應(yīng)器泡式反應(yīng)器和和氣升式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器又，氣升式反應(yīng)器又可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)式。可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)式。 我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了“氣升內(nèi)氣升內(nèi)錯(cuò)流式錯(cuò)流

26、式”植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用于培養(yǎng)紫草，植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用于培養(yǎng)紫草，紫草寧含量達(dá)到了干細(xì)胞重的紫草寧含量達(dá)到了干細(xì)胞重的10%，是天然，是天然植株的植株的2-8倍。倍。氣體攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題氣體攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)及存在的問題 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：剪切力小剪切力小，對(duì)植物細(xì)胞損傷??；，對(duì)植物細(xì)胞損傷?。灰驔]有攪拌軸而更因沒有攪拌軸而更易保持無菌易保持無菌；操作費(fèi)用低操作費(fèi)用低。 不足：因氣體攪拌強(qiáng)度低，不足：因氣體攪拌強(qiáng)度低，高密度培養(yǎng)時(shí)混高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻合不夠均勻。靠大量的通氣輸入動(dòng)量和能量，以?？看罅康耐廨斎雱?dòng)量和能量，以保證反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的良好傳質(zhì)、傳熱。但保證反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的良

27、好傳質(zhì)、傳熱。但過量過量的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對(duì)于，對(duì)于細(xì)胞生長有阻礙作用。再是細(xì)胞生長有阻礙作用。再是過高的溶氧對(duì)植物細(xì)過高的溶氧對(duì)植物細(xì)胞合成次級(jí)代謝產(chǎn)物不利胞合成次級(jí)代謝產(chǎn)物不利。2)2)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生物體用物理或固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生物體用物理或化學(xué)方法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固體催化化學(xué)方法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固體催化劑利用。劑利用。優(yōu)點(diǎn)：單位體積細(xì)胞多，受剪切力小。優(yōu)點(diǎn)：單位體積細(xì)胞多，受剪切力小。缺點(diǎn)：由于其混合效果低，對(duì)必要的氧缺點(diǎn)：由于其混合效果低，對(duì)必

28、要的氧傳遞，傳遞，pH值、溫度控制和氣體產(chǎn)物值、溫度控制和氣體產(chǎn)物(如如C02)的排除造成了困難。再者支持物顆的排除造成了困難。再者支持物顆粒破碎易堵塞填充床。粒破碎易堵塞填充床。填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器Jones 在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行了固定化胡蘿在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行了固定化胡蘿卜的培養(yǎng)，卜的培養(yǎng)，Kargi 采用這種反應(yīng)器培養(yǎng)長春采用這種反應(yīng)器培養(yǎng)長春花花流化床反應(yīng)器流化床反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：良好的傳質(zhì)特性。優(yōu)點(diǎn)：良好的傳質(zhì)特性。缺點(diǎn)：剪切力和顆粒碰撞會(huì)損壞固定缺點(diǎn)：剪切力和顆粒碰撞會(huì)損壞固定化細(xì)胞，同時(shí)，流體動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性化細(xì)胞，同時(shí)，流體動(dòng)力學(xué)的復(fù)雜性使之難以放大。使之難以放大。 典型的流化床反

29、應(yīng)器是利用液體或氣體典型的流化床反應(yīng)器是利用液體或氣體的流動(dòng)使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。的流動(dòng)使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。Hamilton 用之培養(yǎng)胡蘿卜細(xì)胞，研究了轉(zhuǎn)化酶活性。用之培養(yǎng)胡蘿卜細(xì)胞，研究了轉(zhuǎn)化酶活性。膜反應(yīng)器膜反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)使用。另外，流體易控制，優(yōu)點(diǎn)：可以重復(fù)使用。另外，流體易控制，易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有選擇性，有利于產(chǎn)品分離。選擇性，有利于產(chǎn)品分離。 缺點(diǎn)是構(gòu)建膜反應(yīng)器的成本較高。缺點(diǎn)是構(gòu)建膜反應(yīng)器的成本較高。第三節(jié)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 1919世紀(jì)世紀(jì)3030年代，年代，Muller,

30、Schwann, VircMuller, Schwann, Virchowhow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到理組織中觀察到多核細(xì)胞多核細(xì)胞現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 1849 1849年年LobingLobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在，的存在，18551855年年18581858年，科學(xué)家們?cè)诜谓M織年，科學(xué)家們?cè)诜谓M織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞。核細(xì)胞。 1 1融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)一、一、動(dòng)物物細(xì)胞工程的發(fā)展動(dòng)物物細(xì)胞工程的發(fā)展18591859年，年，

31、A. A. BarliBarli在研究黏蟲的生活史時(shí)發(fā)在研究黏蟲的生活史時(shí)發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個(gè)核細(xì)胞融合形成多現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個(gè)核細(xì)胞融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞多核細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞彼此融合而形成的是由單個(gè)細(xì)胞彼此融合而形成的。2. 2. 動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立19071907年，年，R. HarrisonR. Harrison將將蛙的胚神經(jīng)管區(qū)蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織組織存活了若干星期存活了若干星期，而且還，而且還長出了軸突長出

32、了軸突( (神神經(jīng)纖維經(jīng)纖維) )細(xì)胞。細(xì)胞。Carrel (1911)Carrel (1911)發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對(duì)于某發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對(duì)于某些細(xì)胞的生長具有很強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，把些細(xì)胞的生長具有很強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，把無菌無菌技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中。19141914年，年，ThomsonThomson創(chuàng)立了創(chuàng)立了器官培養(yǎng)法器官培養(yǎng)法，以，以后被后被StrangewaysStrangeways和和FellFell所發(fā)展。所發(fā)展。19401940年，年，EarleEarle建立了建立了小鼠的結(jié)締組織細(xì)小鼠的結(jié)締組織細(xì)胞系胞系L L系。系。19511951年，年，GayGay建立了

33、第一個(gè)建立了第一個(gè)人人體細(xì)胞系體細(xì)胞系. .3. 3. 細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生19581958年年, Okada, Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒可可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。Harris(1965)Harris(1965)誘導(dǎo)誘導(dǎo)不同的動(dòng)物體細(xì)胞融合不同的動(dòng)物體細(xì)胞融合獲得成功。獲得成功。Lifflefield(1964)Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用選擇性培養(yǎng)基型，利用選擇性培養(yǎng)基篩選異型融合細(xì)胞篩選異型融合細(xì)胞，并，并能不斷地能不斷地

34、增殖增殖。19751975年，免疫學(xué)家年，免疫學(xué)家KohlerKohler和和MilsteinMilstein利用利用小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌分泌單一抗體的雜種細(xì)胞單一抗體的雜種細(xì)胞。4. 4. 動(dòng)物克隆技術(shù)的建立動(dòng)物克隆技術(shù)的建立18911891，HeapeHeape等人首次報(bào)道了家等人首次報(bào)道了家兔胚胎移植兔胚胎移植成功的結(jié)果。成功的結(jié)果。2020世紀(jì)世紀(jì)3030年代以后，先后在羊、豬、牛等年代以后，先后在羊、豬、牛等動(dòng)物的胚胎移植上獲得成功。動(dòng)物的胚胎移植上獲得成功。19621962年，英國學(xué)者年，英國學(xué)者GrudonGrudo

35、n把非洲把非洲爪蟾小爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵受精卵( (經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核) )中，約中，約有有1 1的重組卵發(fā)育成為成熟蛙的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。19971997年年2 2月，英國科學(xué)家月，英國科學(xué)家WilmutWilmut等報(bào)道等報(bào)道了世界第一只了世界第一只克隆羊克隆羊的誕生。的誕生。1.1.過程過程二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2.2.幾個(gè)概念：幾個(gè)概念： 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織的組織, ,將它分散成單個(gè)將它分散成單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞, ,然后然

36、后, ,放在適宜的放在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中, ,讓這些細(xì)胞生讓這些細(xì)胞生長和增殖長和增殖, ,并維持結(jié)構(gòu)和并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。功能的一門技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為將動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原原代培養(yǎng)代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細(xì)用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì)胞懸液，胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì)胞懸液，分裝到多個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個(gè)過程分裝到多個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個(gè)過程叫叫傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞系和細(xì)胞株細(xì)胞系和細(xì)胞株初次培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)第一次傳代成功后，即稱初次培養(yǎng)的

37、細(xì)胞經(jīng)第一次傳代成功后，即稱之為之為細(xì)胞系細(xì)胞系。從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞從一個(gè)經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選方法，分離培養(yǎng)或通過篩選方法，由單細(xì)胞增殖形成由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群的細(xì)胞群，稱，稱細(xì)胞株細(xì)胞株。有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系大多數(shù)細(xì)胞系在大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)增殖有限的代數(shù)內(nèi)增殖，當(dāng)，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成無限細(xì)胞系或稱衰老死亡，二是發(fā)育成無限細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)連續(xù)細(xì)胞系胞系。 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)

38、換期，其轉(zhuǎn)換過程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為為轉(zhuǎn)換期，其轉(zhuǎn)換過程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化體外轉(zhuǎn)化。接觸抑制接觸抑制密度抑制密度抑制3.3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長的特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生長的特點(diǎn)貼附生長貼附生長貼附生長貼附生長 粘附型細(xì)胞粘附型細(xì)胞: :附著在某一固相支持物表面才能生附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞: :不必附著于固相支持物表面，而不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞

39、可在懸浮狀態(tài)下可在懸浮狀態(tài)下生長。生長。 細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞接觸抑制 細(xì)胞在貼壁生長過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)細(xì)胞在貼壁生長過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止的現(xiàn)象。胞分裂和生長停止的現(xiàn)象。密度抑制密度抑制細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞密度增大，培養(yǎng)液細(xì)胞密度增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞因營養(yǎng)細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而導(dǎo)致的細(xì)胞分裂和生的枯竭和代謝物的影響而導(dǎo)致的細(xì)胞分裂和生長停止長停止。體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征體特征體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，體外：多數(shù)情況，細(xì)胞

40、只有一個(gè)附著平面，外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同外形一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型性細(xì)胞型多型性細(xì)胞型4 4、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核中有圓形核。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長時(shí)呈。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)；很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)膜狀移動(dòng)；很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮細(xì)胞型上皮細(xì)胞型胞體胞體梭形或不規(guī)則三角形梭形或不規(guī)則三角形；胞質(zhì)向外伸出；胞質(zhì)向外伸出2 23

41、 3個(gè)長短不等的個(gè)長短不等的細(xì)胞突起細(xì)胞突起；中有；中有卵圓形核卵圓形核。排列成放射。排列成放射狀，漩渦狀，不連成片。狀，漩渦狀，不連成片。成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型外形不規(guī)則且不斷外形不規(guī)則且不斷變化變化，細(xì)胞內(nèi)容易出，細(xì)胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的現(xiàn)暗的吞噬性顆粒吞噬性顆粒。生長位置不固定，分生長位置不固定，分散，呈活躍的的游走散，呈活躍的的游走和變形運(yùn)動(dòng)。和變形運(yùn)動(dòng)。多型性細(xì)胞型多型性細(xì)胞型外形不規(guī)則，外形不規(guī)則，細(xì)胞由略呈細(xì)胞由略呈多角形的胞多角形的胞體體和細(xì)長的、類似偽足的和細(xì)長的、類似偽足的胞突胞突兩部分組成，兩部分組成，胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒血

42、清血清：如：如HelaHela細(xì)胞系在高血清成纖維細(xì)胞樣；細(xì)胞系在高血清成纖維細(xì)胞樣；低血清上皮樣細(xì)胞低血清上皮樣細(xì)胞 pHpH：如如HelaHela細(xì)胞系，太酸或太堿成纖維細(xì)胞樣；細(xì)胞系，太酸或太堿成纖維細(xì)胞樣；標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)pHpH上皮樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞細(xì)胞密度細(xì)胞密度：3T33T3，低密度成纖維細(xì)胞樣；高密度，低密度成纖維細(xì)胞樣；高密度上皮樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞生長狀態(tài)改變生長狀態(tài)改變：懸浮圓形懸浮；貼附成纖維：懸浮圓形懸浮；貼附成纖維或上皮樣或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否轉(zhuǎn)化與否 ：未轉(zhuǎn)化成纖維樣；轉(zhuǎn)化后可成上皮：未轉(zhuǎn)化成纖維樣；轉(zhuǎn)化后可成上皮樣樣 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)變化培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)變化三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程三

43、、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程1.1.培養(yǎng)細(xì)胞生命期培養(yǎng)細(xì)胞生命期 所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。包括持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。包括原代培養(yǎng)期、原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期傳代培養(yǎng)期及及衰退期衰退期。正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期2.2.體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期- -生長曲線生長曲線潛伏期潛伏期指數(shù)增長期指數(shù)增長期平衡期平衡期衰退期衰退期 所謂細(xì)胞的所謂細(xì)胞的“一代一代”是指從細(xì)胞接種到分離是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間。再培養(yǎng)的一段時(shí)間。四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)四、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1. 1. 無菌、無毒

44、的環(huán)境無菌、無毒的環(huán)境添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。2. 2. 溫度和溫度和pHpH溫度溫度pH與體內(nèi)相近與體內(nèi)相近 35-377.27.43. 3. 氣體環(huán)境氣體環(huán)境O O2 2COCO2 2細(xì)胞代謝所必需細(xì)胞代謝所必需維持維持pHpHu COCO2 2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)箱（95% 95% 空氣空氣5% CO5% CO2 2 ）5 .5 .平衡鹽溶液平衡鹽溶液BSSBSS人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，用來洗滌人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，用來洗滌細(xì)胞。細(xì)胞。Hanks液、液、Earle液和液和PBS液等液等4. 4. 營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì) 糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)

45、鹽、微量糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素、激素以及動(dòng)物或人血清等。元素、激素以及動(dòng)物或人血清等。RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基成分細(xì)胞培養(yǎng)基成分 （配制時(shí)添加碳酸氫鈉（配制時(shí)添加碳酸氫鈉2000mg/L）五、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)五、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式分為：培養(yǎng)方式分為： 分批式分批式 流加式流加式 半連續(xù)式半連續(xù)式 連續(xù)式連續(xù)式1.1.動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式 分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)分批式培養(yǎng)：指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液分批式培養(yǎng)：指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，經(jīng)一段時(shí)間后，斷生長，產(chǎn)

46、物不斷形成，經(jīng)一段時(shí)間后，終止培養(yǎng)。終止培養(yǎng)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時(shí)間變化很大分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時(shí)間變化很大細(xì)胞的生長階段可分為延滯期、對(duì)數(shù)生長細(xì)胞的生長階段可分為延滯期、對(duì)數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。流加式培養(yǎng)流加式培養(yǎng) 特點(diǎn)：特點(diǎn)：u可避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高；可避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高；u能防止?fàn)I養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡；能防止?fàn)I養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡；u整個(gè)過程反應(yīng)體積是變化的。整個(gè)過程反應(yīng)體積是變化的。 流加式培養(yǎng)是指先將終體積流加式培養(yǎng)是指先將終體積1/31/2的的培養(yǎng)液培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過

47、程中，裝入反應(yīng)器，接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又隨著細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞持續(xù)生長代謝，到反不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞持續(xù)生長代謝，到反應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系。應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系。半連續(xù)式培養(yǎng)半連續(xù)式培養(yǎng) 指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并補(bǔ)充加入等量的新鮮培的培養(yǎng)液部分取出，并補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。養(yǎng)基，使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一

48、的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用。供進(jìn)一步利用。特點(diǎn)：操作簡便、生產(chǎn)效率高，可長期特點(diǎn)：操作簡便、生產(chǎn)效率高，可長期生產(chǎn)，細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較生產(chǎn)，細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高水平。高水平。連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng)連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補(bǔ)充，保持反應(yīng)條件處于一種恒不斷得到養(yǎng)分補(bǔ)充，保持反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。定狀態(tài)。特點(diǎn)：特點(diǎn)： （1 1）反應(yīng)器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細(xì)胞在優(yōu)化狀）反應(yīng)器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細(xì)胞在優(yōu)化狀態(tài)下生長；態(tài)下生長；（2 2）適于大

49、規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)； (3) (3)操作復(fù)雜、增加污染機(jī)會(huì)、細(xì)胞變異、設(shè)操作復(fù)雜、增加污染機(jī)會(huì)、細(xì)胞變異、設(shè)備儀器要求高備儀器要求高 2 2、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)技術(shù)大載體培養(yǎng)技術(shù)大載體培養(yǎng)技術(shù)多孔載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng)微囊化培養(yǎng)技術(shù)微囊化培養(yǎng)技術(shù)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù)是指在外力的作用下，兩個(gè)以是指在外力的作用下，兩個(gè)以上的異源（種、屬）細(xì)胞或原生質(zhì)體上的異源（種、屬）細(xì)胞或原生質(zhì)體互相接觸，不經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜互相接觸

50、，不經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個(gè)融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個(gè)雜合細(xì)胞的現(xiàn)象。雜合細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）交） 植物體細(xì)胞融合應(yīng)用示例植物體細(xì)胞融合應(yīng)用示例雜交的兩個(gè)細(xì)胞雜交的兩個(gè)細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁理細(xì)胞壁原生質(zhì)體、原生質(zhì)體、經(jīng)離心、振經(jīng)離心、振動(dòng)、電刺激動(dòng)、電刺激用聚二乙醇用聚二乙醇（）（）誘導(dǎo)誘導(dǎo)融合后的原生質(zhì)體融合后的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞脫分化脫分化細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂愈傷組織愈傷組織雜種植株雜種植株再分化再分化（植物體細(xì)胞（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)融合完成的標(biāo)志）志）植植物物細(xì)細(xì)胞

51、胞融融合合植物植物組織組織培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集凝集現(xiàn)象，現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始，細(xì)胞開始細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)融合質(zhì)融合，然后在培養(yǎng)過程中，進(jìn)而發(fā)生，然后在培養(yǎng)過程中，進(jìn)而發(fā)生核融合核融合，形成雜種細(xì)胞。形成雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合的過細(xì)胞融合的過程程細(xì)胞融合細(xì)胞融合一.誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法1 1、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有動(dòng)物細(xì)胞融合的病毒有仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病仙臺(tái)病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒毒、皰疹病毒等，其中仙臺(tái)病毒

52、最常用。等，其中仙臺(tái)病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或紫外線或-丙內(nèi)酯滅活丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。留病毒的融合活性。 兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在胞在病毒黏結(jié)作用病毒黏結(jié)作用下彼下彼此靠近，使兩個(gè)細(xì)胞膜、此靠近，使兩個(gè)細(xì)胞膜、胞質(zhì)間互相滲透胞質(zhì)間互相滲透 、細(xì)胞、細(xì)胞核互相融合，進(jìn)入正常核互相融合，進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，形成的細(xì)胞分裂途徑，形成雜種細(xì)胞。雜種細(xì)胞。機(jī)制機(jī)制優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：融合率較高融合率較高，適宜各種動(dòng)物細(xì)胞適宜各種動(dòng)物細(xì)胞，且仙臺(tái)病毒，且仙臺(tái)病毒能在雞胚中大量繁殖，能在雞胚中大

53、量繁殖，容易培養(yǎng)容易培養(yǎng)；缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒缺點(diǎn)：仙臺(tái)病毒不穩(wěn)定不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會(huì)降，在保存過程中融合活性會(huì)降低，并且低，并且制備過程比較煩瑣制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會(huì)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾對(duì)細(xì)胞的生命活動(dòng)產(chǎn)生干擾。病毒誘導(dǎo)融合優(yōu)缺點(diǎn)病毒誘導(dǎo)融合優(yōu)缺點(diǎn)常用的病毒：（Sendal virus),又稱稱日本血凝病毒（Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 屬屬于副粘液病毒科，RNA病毒，圓圓球形， 1962年，日本仙臺(tái)東東北大學(xué)學(xué)學(xué)學(xué)者岡岡田發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)仙臺(tái)病毒可誘導(dǎo)細(xì)誘導(dǎo)細(xì)胞融合。 仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒利用化學(xué)

54、融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。粘連融合的方法。2 2、化學(xué)融合劑法、化學(xué)融合劑法機(jī)制機(jī)制：PEG是乙二醇的多聚物是乙二醇的多聚物, 存在不同分子存在不同分子量的多聚體量的多聚體,它可它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu), 使兩細(xì)使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組和重組,此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可此時(shí)相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能能,從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合.。優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn):聚乙二醇是化學(xué)試劑，聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方使用起來很

55、方便便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它有一定，但是它有一定毒性毒性，對(duì)有些細(xì)胞，對(duì)有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞如卵細(xì)胞)不適用。不適用。聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）誘導(dǎo)融合）誘導(dǎo)融合 機(jī)制機(jī)制：一般認(rèn)為是：一般認(rèn)為是NaNa+ +造成了膜電位的改變。造成了膜電位的改變。存在的缺陷存在的缺陷：就是融合頻率低，而且對(duì)于來源：就是融合頻率低，而且對(duì)于來源于葉肉的高度液泡化的原生質(zhì)體有害。于葉肉的高度液泡化的原生質(zhì)體有害。由由NaNONaNO3 3誘導(dǎo)的可重復(fù)、可控制的離體原生質(zhì)體誘導(dǎo)的可重復(fù)、可控制的離體原生質(zhì)體融合是由融合是由PowerPower等（等（19701970）報(bào)道

56、的。利用這一融合劑，）報(bào)道的。利用這一融合劑，CarlsonCarlson等（等（19721972）在植物中獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜）在植物中獲得了第一個(gè)體細(xì)胞雜種，種，NaNONaNO3 3處理誘發(fā)融合處理誘發(fā)融合高高CaCa2+2+高高pHpH誘發(fā)融合的機(jī)制尚不很清楚，一誘發(fā)融合的機(jī)制尚不很清楚，一般認(rèn)為是改變了膜位及膜的物理結(jié)構(gòu)。般認(rèn)為是改變了膜位及膜的物理結(jié)構(gòu)。煙草葉肉原生質(zhì)體煙草葉肉原生質(zhì)體在高在高CaCa2+2+（0.05M CaCl0.05M CaCl2 2）和高和高pHpH（10.510.5）條件下能很快誘發(fā)融合（）條件下能很快誘發(fā)融合（3737），），但融合頻率不很高，高但融合頻

57、率不很高，高pHpH也影響原生質(zhì)體的存活率，也影響原生質(zhì)體的存活率，且易誘發(fā)多個(gè)原生質(zhì)體融合。且易誘發(fā)多個(gè)原生質(zhì)體融合。 高高pHpH高濃度鈣離子處理高濃度鈣離子處理 19811981年，年，ScheurichScheurich和和ZimmermannZimmermann發(fā)明了電誘發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。導(dǎo)細(xì)胞融合。 采用直流電脈沖的誘導(dǎo)，可改變?cè)捎弥绷麟娒}沖的誘導(dǎo)，可改變?cè)|(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷，使異種原生質(zhì)體粘合，生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷，使異種原生質(zhì)體粘合，并使原生質(zhì)膜瞬間破裂，相鄰的原生質(zhì)體連接、并使原生質(zhì)膜瞬間破裂，相鄰的原生質(zhì)體連接、閉合、產(chǎn)生融合體。閉合、產(chǎn)生融合體。3 3、電誘導(dǎo)細(xì)胞

58、融合法、電誘導(dǎo)細(xì)胞融合法細(xì)細(xì)胞電電融合原理：懸于大小不同的兩平行懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在交流電場中（細(xì)胞，在交流電場中（1 110100MHz0MHz和和1001001000V/cm1000V/cm ），），會(huì)向小電極移動(dòng)，并會(huì)向小電極移動(dòng)，并極化成極化成偶極子偶極子，并沿電場方向排列，并沿電場方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖，和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。細(xì)胞融合。+-+-+-+-+偶極子偶極子電

59、誘導(dǎo)法原理電誘導(dǎo)法原理+-+ 電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個(gè)膜接觸狀態(tài)，形成念泳到一起，建立一個(gè)膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。珠鏈。 融合：由于膜的可逆性電激穿，使融合：由于膜的可逆性電激穿，使原生質(zhì)體發(fā)生融合。原生質(zhì)體發(fā)生融合。電融合包括兩個(gè)步驟：電融合包括兩個(gè)步驟：原生質(zhì)質(zhì)體電電融合過過程1 1）在高頻電流電場下的相互接觸。）在高頻電流電場下的相互接觸。2 2）脈沖刺激后）脈沖刺激后30s30s3)503)50秒后秒后4 4）1.51.5分鐘后分鐘后5 5）6 6分鐘后分鐘后6 6）1515分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。優(yōu)點(diǎn)：

60、優(yōu)點(diǎn)：融合率高，達(dá)融合率高，達(dá)70708080，甚至，甚至100100可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞可直接挑選雜種細(xì)胞重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)原生質(zhì)體傷害?。谎b置精巧、方便簡單；免去單；免去PEGPEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強(qiáng)等。強(qiáng)等。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：必須購置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。：必須購置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。電融合儀電融合儀激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合光鑷的原理光鑷的原理光鑷牽拉單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)光鑷牽拉單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)光鑷輔助細(xì)胞融合光鑷輔助細(xì)胞融合離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融