目的基因到工程菌的構(gòu)建

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上目的基因到工程菌的構(gòu)建1基因工程的誕生 1972年，美國斯坦福大學(xué)的學(xué)者首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，他們把SV40（一種猴病毒）的DNA分別切割，又將兩者連接在一起，成功構(gòu)建了第一個體外重組的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次在體外將重組的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，成功地進(jìn)行了無性繁殖，從而完成了DNA體外重組和擴(kuò)增的全過程。在這個的基礎(chǔ)上，基因工程誕生了。SV40病毒第一個重組體的構(gòu)建1.1 基因工程技術(shù)的三大理論基礎(chǔ)一是20世紀(jì)40年代Avery等人通過肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，而且證明了通過DNA可以把一個細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)移給

2、另一個細(xì)菌。二是20世紀(jì)50年代Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)及DNA的半保留復(fù)制機(jī)理。三是20世紀(jì)60年代關(guān)于遺傳信息中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按DNARNA蛋白質(zhì)的方向進(jìn)行傳遞的。 1.2 基因工程技術(shù)的三大技術(shù)基礎(chǔ)三大基本技術(shù)問題：一是如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需的基因片段切割下來；二是如何將切割下來的DNA片段進(jìn)行繁殖擴(kuò)增；三是如何將所獲得的基因片段重新連接。20世紀(jì)70年代，由Smith等人發(fā)現(xiàn)的核酸限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和可以作為基因工程載體的細(xì)菌質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)，解決了上述三大問題。1.2.1 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶不切割自身DN

3、A是因?yàn)樵松镏胁淮嬖诿傅淖R別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。1.2.2 DNA連接酶 作用實(shí)質(zhì)：將具有末端堿基互補(bǔ)的2個DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子，其起作用時不需要模板。1.2.3 基因工程的載體-質(zhì)粒 基因載體的作用是運(yùn)載目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞，使之能得到復(fù)制和進(jìn)行表達(dá)。也就是說，離開染色體的外源DNA不能復(fù)制，而而插入復(fù)制子DNA的外源DNA可作為復(fù)制子的一部分在受體菌中進(jìn)行復(fù)制，這種復(fù)制子 是外源基因的載體。此外，為滿足其使命，還必須具備如下一些特性：能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制，在其DNA插入外源基因后，仍然保持穩(wěn)定的復(fù)制狀態(tài)和遺傳特性。易于從宿主細(xì)胞中分離，

4、并進(jìn)行純化。載體DNA序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，并位于DNA復(fù)制的非必需區(qū)內(nèi)，可以在這些位點(diǎn)上插入外源DNA，但不影響載體自身DNA的復(fù)制。某些病毒載體在外源DNA插入后變成缺損性病毒株，只能在有輔助存在時才能進(jìn)行正常增殖。具有能夠觀察的表型特征（有報(bào)告基因），在插入外源DNA后，這些特征可以作為重組DNA選擇標(biāo)志。1.3 基因工程的基本過程 1.4 基因工程的應(yīng)用2目的基因的獲取 基因工程訂是通過人工方法分離、改造、擴(kuò)增并表達(dá)生物的特定基因，從而深入開展核酸遺傳研究或者獲取有價(jià)值的基因產(chǎn)物。通常我們把插入到載體內(nèi)那個特定的片段基因稱為“外源基因”，而將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴(kuò)

5、增或表達(dá)的特定基因或DNA片段稱為“目的基因”。 來源于真核細(xì)胞的產(chǎn)生基因工程藥物的基因是不能直接進(jìn)行分離的。真核細(xì)胞中單拷貝基因只是染色體DNA中很小的一部分，為其10-5 -10-7 ，即使多拷貝基因也只有其10-5，因此從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。另外，真核基因內(nèi)一般都有內(nèi)含子，如果以原核細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，即便分離出真核基因，由于原核細(xì)胞缺乏mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA也不能加工、拼接成為成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因，必須采用特殊方法分離目的基因。目的基因的獲取大致可以分為三類：一是利用PCR技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆

6、、表達(dá)；二是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因組文庫或者cDNA文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從文庫中挑出含有目的基因的重組克??；三是近年來發(fā)展的利用基因差異表達(dá)獲取目的基因的技術(shù)。2.1 直接分離法（鳥槍法） 直接從生物細(xì)胞基因組中獲取目的基因最常用的方法是“鳥槍法”，又稱“散彈槍法”。其是將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。優(yōu)點(diǎn)是速度快，簡單易行，成本

7、較低，并能獲得與天然基因組DNA一樣的有內(nèi)含子的真核基因DNA片段。2.2 逆轉(zhuǎn)錄法（cDNA法） 逆轉(zhuǎn)錄法合成DNA是人工模擬自然界某些生物的反轉(zhuǎn)錄過程。主要用于分子量較大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA為模板，以dNTP為底物，酶催化按53方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈（cDNA），它與RNA模板形成RNA與DNA的雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，由RNA指導(dǎo)的DNA合成過程完成。2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法） 該法是將mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄全成cDNA的第一鏈，不需再合成cDNA第二鏈，而是在特異

8、引物的協(xié)助下，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。常用于含其極微量mRNA的細(xì)胞。2.3.1 cDNA文庫 cDNA文庫是將生物特定的組織器官或特定發(fā)育時期的全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并全部克隆成重組子，在該重組子群集中包含了其全部表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本。原理是將帶poly（A）的mRNA經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA，再與原核載體連接。 cDNA文庫的構(gòu)建：2.3.1.1 cDNA第一鏈的合成利用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈 2.3.1.2 cDNA第二鏈的合成 自身引導(dǎo)合成法：單鏈cDNA的3端能夠形成發(fā)夾狀的結(jié)構(gòu)作為引物，在大腸桿菌聚合酶I Klenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用

9、下，合成cDNA的第二鏈.此法存在的缺點(diǎn)是在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA 5端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排. 置換合成法：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口,產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二鏈.此法的優(yōu)點(diǎn)是：合成cDNA的效率高；直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化；避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA。 引物-銜接頭法 Okayama-Berg法合成并克隆雙鏈cDNA 2.3.1.3雙鏈cDNA分子的克隆 同聚物加尾法: 利用小牛胸腺末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈c

10、DNA和質(zhì)粒載體的3端都加上一個互補(bǔ)的同聚片段，通過退火使兩個片段連接成重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞. 接頭-銜接頭法 mRNA-cDNA克隆法 方法：在mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，將 dA殘基加到mRNA：cDNA雜交體上，然后與帶dT尾的克隆載體連接，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞， 在宿主細(xì)胞內(nèi)，mRNA被降解并代之以DNA.缺點(diǎn)：克隆的效率低（為雙鏈cDNA克隆的1/10）2.3.1.4 cDNA文庫的篩選和鑒定核酸雜交1）同源探針；至少含有所需cDNA克隆的一部分確切序列.常用于以一個部分克隆分離cDNA文庫中的全長克隆.2）部分同源探針：探針的序列與所要篩選的cDNA克隆的序列相關(guān)但不

11、相同.常用于克隆家族基因.3）總cDNA探針：通過反轉(zhuǎn)錄酶均勻摻入放射性核苷酸或通過總的或分級分離得到的poly(A)+ mRNA進(jìn)行末端標(biāo)記而獲得cDNA探針.4) cDNA扣除探針: 從第一種mRNA制備cDNA探針, 連續(xù)多次與20倍過量的第二種mRNA雜交; 回收未雜交的cDNA探針, 再與100倍過量的第一種mRNA雜交, 使得原mRNA中的一些特異序列得到高度富集.特異性免疫學(xué)檢測:在cDNA表達(dá)文庫中，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能與特異性抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，通過酶學(xué)的方法加以檢測.cDNA克隆的同胞檢測:將cDNA文庫分成若干組含有10-100個克隆子的易于處理的cDNA文庫，對每組cD

12、NA文庫進(jìn)行檢測，當(dāng)鑒定出陽性庫后再不斷將其分成更細(xì)的庫進(jìn)行檢測，直到獲得陽性單克隆.cDNA克隆的確證:cDNA克隆含有編碼某一特定蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列的開放讀框.2.3.2 基因組文庫 基因組文庫或簡稱基因文庫，其是將某一生物基因組DNA片段化并全部克隆后所獲得的重組子群體的總稱。通過構(gòu)建基因文庫可以貯存和擴(kuò)增特定生物基因工程組的全部或部分片段，同時又能夠在需要時從基因文庫中調(diào)出其中的任何DNA片段或目的基因。 理想的基因組文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕從文庫中篩選目標(biāo)克隆的工作量?？寺∑未笥谘芯炕虻钠骄?，以便于從同一克隆中獲得完全的單一基因。含有相鄰DNA片

13、段的獨(dú)立克隆間，部分序列重疊的大小合理，一方面利于基因文庫各克隆建立疊連群，進(jìn)行染色體步查；另一方面，又不重疊過多，使步查效率低下?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下且最好不帶有任何載體序列。重組克隆應(yīng)能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增及篩選。 基因組文庫的構(gòu)建： 細(xì)胞染色體大分子 DNA 的提取和大片段的制備； 載體 DNA 的制備； 載體與外源大片段連接； 體外包裝及基因組 DNA 文庫的擴(kuò)增； 重組 DNA 的篩選和鑒定。 表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選 抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐 二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長 分子雜交法：利用分子探針對文庫進(jìn)行篩選 免疫篩選法：利用多

14、肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交篩選 PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物，擴(kuò)增特異性片段2.3.3 cDNA文庫和基因組文庫的區(qū)別 時效性: cDNA 文庫代表某一時期特定細(xì)胞或組織中mRAN，是轉(zhuǎn)錄水平，僅反映某一時期特定組織表達(dá)的功能基因，不是全部基因；而基因組文庫包含該生物所有基因。序列組成不：cDNA 文庫無間隔序列和調(diào)控區(qū)等非編碼區(qū)；基因組文庫可真實(shí)顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息，由于制備DNA片段的切點(diǎn)是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的DNA片段既可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近DNA順序。兩種文庫均有應(yīng)用，如何選擇： 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，在分離植物RNA、病

15、毒基因、研究植物功能蛋白序列、分離植物特定發(fā)育階段或特特異表達(dá)的基因時應(yīng)用cDNA文庫；在研究mRNA不存在的序列及基因組作圖時必須構(gòu)建基因組文庫。2.4 化學(xué)合成法該方法有個先決條件就是必須已知其核苷酸順序，或者已知其蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的核苷酸序列。用化學(xué)合成此基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成黏性末端的DNA雙鏈片段。然后將這些DNA片段按正確的次序進(jìn)行退火連接起來形成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。常用于較小分子蛋白質(zhì)或多肽的合成。2.5 物理化學(xué)方法 其原理是從幾個方面來利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對

16、，T和A配對的這些特性，從而分離目的基因的目的。2.5.1 密謀梯度離心法 液體在離心時，其密度隨轉(zhuǎn)軸距離而增加。堿基GC配對的雙鏈DNA片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術(shù)可使切割適當(dāng)片段的不同DNA按密度大小公布開來。進(jìn)而通過與某種放射性標(biāo)志的mRNA雜交來檢驗(yàn)，分離相應(yīng)的基因。2.5.2單鏈酶法 堿基GC配對之間有三個氫鍵，比AT配對的穩(wěn)定性高，當(dāng)用加熱或其他變性試劑處理DNA時，雙鏈上AT配對較多的部位先變成單鏈，應(yīng)用單鏈特異的S1核酸酶切除單鏈，殖民地經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA。2.5.3 分子雜交法 單鏈DNA與其互補(bǔ)的序列總有“配對成雙”的傾向，這就是分子雜交

17、的原理。其既可以分離，也可以鑒別某一基因。3 基因與載體的連接（以質(zhì)粒為例）3.1 質(zhì)粒的提取 通過加入SDS（十二烷基硫酸鈉）對宿主細(xì)胞進(jìn)行裂解，使質(zhì)粒DNA順利溢出并與染色體DNA和蛋白質(zhì)等分離。其中，微量堿變性法提取質(zhì)粒具有簡單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前分子生物學(xué)及基因工程研究工作中最常用的一種純化質(zhì)粒DNA的方法。當(dāng)然，也可以采用試劑盒進(jìn)行，目前，商品化產(chǎn)品很多，其基本原理大多是基于堿裂解法結(jié)合硅膠模等微型離心純化柱。3.2 質(zhì)粒載體的構(gòu)建 天然質(zhì)粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適合直接用作克隆載體，需要進(jìn)行人工改造，這些改造主要有以下幾方面：（1）選擇合適的復(fù)制起始位點(diǎn)。為了使構(gòu)建的質(zhì)

18、粒克隆載體能在受體細(xì)胞中進(jìn)行有效復(fù)制，且獲得足夠數(shù)量的拷貝數(shù)，需要改變復(fù)制起始位點(diǎn)，一般選擇組裝松散型質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)。（2）加入合適的選擇標(biāo)記基因。為了便于重組子篩選，需要在質(zhì)粒克隆載體上加入合適的標(biāo)記基因，主要有l(wèi)acZ和抗生素抗性基因，前者用于克隆子藍(lán)、白斑篩選；當(dāng)外源DNA片段插入到克隆位點(diǎn)后，可導(dǎo)致抗生素抗性基因失活。（3）增加或減少酶切位點(diǎn)。質(zhì)粒載體利用限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)來作為外源DNA片段插入的克隆位點(diǎn)，這種位點(diǎn)必須是單一酶切位點(diǎn)，而且數(shù)量越多越便于多種類型末端的DNA插入。可通過刪除天然質(zhì)粒中的部分重復(fù)的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)使之成為單一的酶切位點(diǎn)，可通過增加新的單一限制性內(nèi)切

19、酶位點(diǎn)在特定的部位組裝一個含有多種單一限制性內(nèi)切酶識別序列的多克隆位點(diǎn)（MCS）。（4）縮短長度。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的效率同質(zhì)粒DNA分子大小相關(guān)，小分子質(zhì)量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率較高?？赏ㄟ^切去質(zhì)粒上不必要的片段，提高轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的效率，提高其外源DNA片段的裝載量。3.3 目的基因與載體的連接用一定的限制性酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端；再用同一種限制酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，形成一個重組的DNA分子（重組質(zhì)粒）。4 重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建工程菌 4.1 受體細(xì)胞的選擇 常用的宿主細(xì)胞有如下幾種：DH5a:用于

20、鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的b半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)a互補(bǔ)。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高。JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主菌。JM109:支持帶有琥珀突變載體生長的重組缺陷的抑制型菌。MZ-1:溫度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌體啟動子質(zhì)粒載體的宿主菌。4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 常用方法有轉(zhuǎn)化法；轉(zhuǎn)導(dǎo)法；轉(zhuǎn)染法。5 篩選含有目的基因的受體細(xì)胞 原理：質(zhì)粒上的抗生素的抗性基因 方法：利用選擇培養(yǎng)基篩選 5.1 工程菌篩選方法5.1.1載體表型選擇法載體表型選擇法是根據(jù)載體分子所提供的表性特征，直接選擇重組DNA分子

21、的方法，主要包括：5.1.1.1抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒是分子克隆中最常用的一種載體分子，編碼有tetr ampr使帶有該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞能在含有四環(huán)素或氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長。具體做法：將此轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有氨芐青霉素的平板上，并將存活的菌落原位影印到另一個含有四環(huán)素的夾板上，凡是在氨芐青霉素平板上生長，而在四環(huán)素夾板上不生長的菌落上就可能是已經(jīng)獲得了這種重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克隆。5.1.1.2-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 除了抗生素抗性篩選之外， 質(zhì)粒等載體上常用的另一種篩選標(biāo)志是-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)。當(dāng)外源DNA插入到載體lacZ上，導(dǎo)致-半乳糖苷酶基因失活，可通過大腸桿菌轉(zhuǎn)

22、化子菌落再添加由X-gal-IPTG培養(yǎng)基中的著色變化直接觀察出來。5.1.2 根據(jù)插入基因的表型選擇法 其基本原理是：轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源DNA編碼的蛋白，能夠?qū)Υ竽c桿菌宿主菌株所具有突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。這種篩選法受到一定的條件限制，他不但要求克隆的DNA片段必須大到可以包含一個完整的基因序列，而且還要求目標(biāo)基因能夠在大腸桿菌宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。無疑，真核生物基因難以滿足這些要求。其原因在于有許多真核基因是不能對大腸桿菌的突變發(fā)生抑制作用或起互補(bǔ)效應(yīng)。此外，大多數(shù)的真核基因內(nèi)部都存在著間隔序列，而大腸桿菌又不存在真核基因轉(zhuǎn)錄加工過程中所需要的剪輯機(jī)理，這樣便阻礙了他們在大腸桿菌宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的表達(dá)。5.1.