分子細(xì)胞生物學(xué)——細(xì)胞周期調(diào)控精

1、會計學(xué)1分子細(xì)胞生物學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞周期調(diào)控精細(xì)胞周期調(diào)控精第四節(jié) 細(xì)胞周期調(diào)控 細(xì)胞周期調(diào)控有兩大機制：細(xì)胞周期驅(qū)動機制(時順調(diào)控機制)；細(xì)胞周期監(jiān)控機制(檢查點調(diào)控機制)。 細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵點：、 第1頁/共72頁 細(xì)胞周期調(diào)控是一個非常復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)節(jié)過程，有大量調(diào)節(jié)蛋白參與其中。 此過程的核心是一組細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)，而CDKs調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞周期檢查點。 細(xì)胞周期調(diào)控由信號傳導(dǎo)通路來實現(xiàn)，并決定細(xì)胞的分裂、分化和凋亡等過程。細(xì)胞周期調(diào)控第2頁/共72頁一、細(xì)胞周期時順調(diào)控二、細(xì)胞周期檢查點調(diào)控三、細(xì)胞周期同步化第3頁/共72頁一、細(xì)胞周期時順調(diào)控 細(xì)胞周期調(diào)

2、控的關(guān)鍵物質(zhì)是細(xì)胞周期蛋白(cyclin)，周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase, CDK)和CDK的抑制性蛋白(CDKI)。 不同分子的cyclin和 CDK及CDKI 與其他相關(guān)調(diào)控蛋白精確調(diào)控細(xì)胞周期的每一個時相。 細(xì)胞通過調(diào)節(jié)cyclin的水解和Cdks的連續(xù)激活和滅活來實現(xiàn)周期調(diào)控。 第4頁/共72頁（一）細(xì)胞周期蛋白 細(xì)胞周期蛋白 cyclin，也稱周期素、循環(huán)素，指合成和降解與細(xì)胞周期相關(guān)，并能與相應(yīng)的Cdk形成復(fù)合物的一類蛋白。它們與細(xì)胞周期依賴性激酶(Cdk)形成復(fù)合物以決定激酶特異性和酶活性。 脊椎動物已發(fā)現(xiàn)10余種： cyclin D1、

3、cyclin D2、cyclin D3，cyclin E1、cyclin E2 cyclin A1、 cyclin A2、cyclin A3、 cyclin B1、cyclin B2，cyclin C，cyclin G， cyclin H 。第5頁/共72頁 cyclins均含有由100150個氨基酸殘基組成的保守區(qū)，稱為周期蛋白框(cyclin box)，是介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合的活性區(qū)域。 此外， cyclins還可含有由降解盒(destruction box)或PEST序列(脯-谷-絲-蘇)，用于決定其降解途徑以調(diào)節(jié)周期蛋白的水平。 按周期素表達(dá)及作用的細(xì)胞周期階段的不同，可將其分為G

4、1期 (C、D、E)和M期(A、B)兩大類。 cyclins分子結(jié)構(gòu)特點第6頁/共72頁周期蛋白分子結(jié)構(gòu)第7頁/共72頁Cyclin D 家族 含有3個成員cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3在G1期開始表達(dá)，分裂后期降解。 與CDK2、CDK4、CDK6組成復(fù)合體，是啟動細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵因子。Cyclin E 家族 有cyclin E1和cyclin E2兩種。 其表達(dá)水平在G1/S調(diào)控點達(dá)峰值。 與CDK2、CDK3結(jié)合，啟動DNA復(fù)制。第8頁/共72頁Cyclin A 家族 包括cyclin A1、 cyclin A2和cyclin A3 在S期開始表達(dá)

5、，G2期達(dá)高峰，M期的中期降解。 與CDK2結(jié)合， 啟動DNA復(fù)制。Cyclin B 家族 含有2個成員cyclin B1和 cyclin B2。 在G2末期開始表達(dá)， M期的中期達(dá)高峰，M期的后期降解。 與CDK1、CDK2結(jié)合， 促進G2期向M期轉(zhuǎn)換。第9頁/共72頁Cyclin H 家族， cyclin H 的表達(dá)在整個細(xì)胞周期過程中不呈周期性變化。 與CDK7結(jié)合，組成CAK。 激活CDK、磷酸化RNA-pol 的CTD，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Cyclin C 家族 與CDK8結(jié)合，組成CAK，激活CDK。第10頁/共72頁細(xì)胞周期蛋白水平變化第11頁/共72頁 周期蛋白依賴性激酶(cycli

6、n dependent kinase)是指與周期蛋白結(jié)合才具有酶活性的激酶類?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10余種。（二）周期蛋白依賴性激酶 在細(xì)胞周期中，CDK的表達(dá)量相對恒定，但以非活性的形式存在，在細(xì)胞周期特定的時間與周期素特異地結(jié)合，一種CDK能與多種cyclin結(jié)合，以復(fù)合體的形式發(fā)揮作用。 第12頁/共72頁CDKs是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，稱為CDK19。第13頁/共72頁 CDK常以使底物磷酸化的形式起作用，其效應(yīng)是多方面的，包括DNA合成的啟動和終止，染色體的凝集、運動和松懈，核膜、核仁的崩解和重新形成，核纖層的降解和重新聚合，紡綞體的形成和消失等。 各種CDK分子在進化上高度保守，都含有一

7、段類似的CDK激酶結(jié)構(gòu)域，其中一段PSTAIRE的序列相當(dāng)保守，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。另外，都有多個磷酸化位點，位點的磷酸化與激酶的活性有關(guān)。第14頁/共72頁第15頁/共72頁 CDK催化活性的激活： CDK與周期素結(jié)合 保守蘇氨酸殘基磷酸化修飾 CDK催化活性的抑制： N-端氨基酸殘基的抑制性磷酸化 抑制蛋白與其結(jié)合(是主要的抑制性調(diào)節(jié)) CDK的催化活性受到激活因素與抑制因素兩方面的調(diào)節(jié)。CDK的調(diào)節(jié)物包括：cyclin、CKI、CDK調(diào)節(jié)分子、CAK和磷酸酶等。第16頁/共72頁（三） CDKs 激活激酶 CAK (CDK activating kinase)有2種： cyclin H

8、-CDK7 及 cyclin C-CDK8。 CDKs 的激活需要與特異性亞基cyclins 結(jié)合，并被cyclin H-CDK7-MAT1三元復(fù)合物(CAK)磷酸化。 CDK7-cylin H-MAT1也是轉(zhuǎn)錄因子H(TFH)的亞基組成部分，磷酸化RNA 聚合酶(RNAP )大亞基的C-末端結(jié)構(gòu)域 (CTD)。p27能阻止cyclin H-CDK7的催化作用。第17頁/共72頁 CDKI分為兩大家族： INK4 ( Inhibitor of CDK4) CIP/KIP (Kinase inhibition protein)（四）CDK抑制因子 CDK抑制因子(CDK inhibitor, C

9、DKI或CDI、CKI)是一類細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑、主要對細(xì)胞周期起負(fù)性調(diào)控作用，大部分都是抑癌基因的編碼產(chǎn)物，以多肽的分子量大小來命名。第18頁/共72頁 1、Ink4 (Inhibitor of Cdk 4) P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d等，能專一性的與CDK4和CDK6結(jié)合，并阻止其與周期素的結(jié)合反應(yīng)，從而特異地抑制CDK4-cyclin D1、CDK6-cyclin D1復(fù)合物的活性，使細(xì)胞停留于G1期。 p15、p16受TGF的調(diào)控，p18 、p19的表達(dá)受p53的調(diào)控 。第19頁/共72頁 2、CIP/KIP (Kinase inhi

10、bition protein) P21cip/waf1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2 等，含一相似的 60 個氨基酸抑制區(qū)，能抑制所有G1和S期CDK的激酶活性。 P57是CDK2的抑制劑。 P21cip/waf1除抑制CDK的激酶活性外，還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA (proliferating cell nuclear antigen)結(jié)合，直接抑制DNA的合成。 P53可促進P21cip/waf1的表達(dá)，因P53是WAF1/CIP1基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。第20頁/

11、共72頁 P27能與幾乎所有的cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其蛋白激酶活性，使細(xì)胞停留于G1期。其作用機制是抑制cyclin H-CDK7等CAK的活性。 p27的表達(dá)受TGF的調(diào)控，還受cAMP的調(diào)節(jié)。第21頁/共72頁1. the G1 Cdk complexes;2. G1/ S-phase Cdk complexes;3. the S-phase Cdk complexes;4. the mitotic Cdk complexes.5. APC(anaphase promoting complex) （五）細(xì)胞周期調(diào)控復(fù)合物第22頁/共72頁第23頁/共72頁 Cyclin-CD

12、K復(fù)合物及其相關(guān)蛋白第24頁/共72頁細(xì)胞周期調(diào)控復(fù)合物第25頁/共72頁（六）細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)依賴于調(diào)控復(fù)合物活性的周期性變化。第26頁/共72頁 細(xì)胞在生長因子的刺激下，G1期cyclin D表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使PRb被磷酸化而失活，釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F， E2F進入細(xì)胞核內(nèi)，使促進G1期轉(zhuǎn)入S期所需的調(diào)控基因開始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)細(xì)胞進入S期后，cyclin D被磷酸化后由SCF泛素化途徑降解。1. 細(xì)胞周期的啟動第27頁/共72頁 PRb是由Rb抑癌基因編碼合成的蛋白質(zhì)，有低磷酸化型和高磷酸型兩種型式。低磷酸化型的PRb可與轉(zhuǎn)錄因子E2F形成復(fù)合體，抑制其轉(zhuǎn)錄激活作用，阻

13、止細(xì)胞分裂；而高磷酸化型的PRb則不能與E2F形成復(fù)合體。催化 Rb由低磷酸化型轉(zhuǎn)變?yōu)楦吡姿峄偷牡鞍准っ妇褪歉餍虲DK。 第28頁/共72頁 在G1-S期，cyclinE在G1期到S期的早期與CDK2結(jié)合，啟動DNA的復(fù)制，促進細(xì)胞通過G1/S限制點而進入S期。 細(xì)胞進入S期后，cyclin E由依賴SCF的泛素化途徑降解。 在S期，cyclinA與CDK2結(jié)合，維持S期DNA合成。 cyclin A是在S期和G2期穩(wěn)定存在的cyclin 。 第29頁/共72頁2、細(xì)胞周期由G2期過渡到M期 在G2-M期，cyclin B在細(xì)胞周期G2的中晚期逐漸積累，cyclinA、cyclinB與CDK

14、1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化(如組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體等下游細(xì)胞周期事件)，使得細(xì)胞進入M期。第30頁/共72頁 不同類型的M期細(xì)胞中分別提取出了能夠促進細(xì)胞分裂的因子，統(tǒng)稱為M期促進因子或成熟促進因子 (M- phase promoting factor ， maturation promoting factor，MPF)， 即the mitotic Cdk complexes 。 MPF由細(xì)胞周期蛋白cyclinA/B和周期蛋白依賴激酶Cdk1 (p34cdc2)組成。M期促進因子(MPF)第31頁/共72頁 MPF活性在細(xì)胞分裂中呈周期性改變。當(dāng)細(xì)

15、胞處于間期時，檢測不到 MPF活性；處于分裂期時MPF具有活性。MPF以無活性的前體形式存在，其活化依賴于Cdc25磷酸酶的出現(xiàn)。 Cyclin levels fluctuate; CDK levels are constant.第32頁/共72頁第33頁/共72頁 在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時，通過某種途徑激活A(yù)PC(一類泛素連接酶E3)，將泛素連接在cyclin上，導(dǎo)致cyclin被蛋白酶體識別和降解，從而完成細(xì)胞分裂，完成一個細(xì)胞周期。 3、細(xì)胞周期M期的過渡 細(xì)胞通過M期需要cyclin A和cyclin B的降解，若cyclin A不被降解則會引起細(xì)胞周期停止在M期的中期。如果cyc

16、lin B的降解受到抑制，將會使細(xì)胞周期停滯在M期后期。 Cyclin A和Cyclin B都是經(jīng)依賴APC泛素化途徑所降解。第34頁/共72頁細(xì)胞周期中Cyclin B的合成與降解第35頁/共72頁（七）泛素介導(dǎo)cyclins降解與細(xì)胞周期 cyclins的泛素化途徑可分為兩類： 依賴SCF(Skp1-Cullin-F-box protein)的泛素化途徑 依賴APC/C (Anaphase promoting complex)的泛素化途徑。 cdc(cell division cycle)基因： 是指那些表達(dá)水平隨細(xì)胞周期性變化或者表達(dá)產(chǎn)物直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因。第36頁/共72頁 泛

17、素(Ubiquitin)是由76個氨基酸組成的一種小蛋白，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素。其主要功能是標(biāo)記需要降解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解。 蛋白質(zhì)的泛素化主要發(fā)生在賴氨酸殘基的側(cè)鏈，且通常是多泛素化。結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別進而被降解，泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被降解的標(biāo)簽。 26S蛋白酶體(proteasome)是一個由70 多個亞基組成的大型復(fù)合分子，分子量接近2,000 KD，可識別泛素化的蛋白質(zhì)，并將其降解成短肽。 1 泛素-蛋白酶體途徑第37頁/共72頁 需要被蛋白酶體降解的蛋白質(zhì)會先被連接上泛素作為標(biāo)記，這一過程是一個三酶級聯(lián)反應(yīng)。 泛素活化酶E1(ubiquitin act

18、ivating enzyme) 泛素結(jié)合酶E2 (ubiquitin conjugating enzyme) 泛素連接酶E3 (ubiquitin-protein ligase)，也稱底物識別因子 (substrate recognition factor)。蛋白分子泛素化 由于蛋白酶體識別泛素化的蛋白并將其降解是一個非特異性的進程，因此，E3在整個蛋白質(zhì)的降解過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，決定了反應(yīng)的特異性。第38頁/共72頁 首先泛素激活酶E1 水解ATP獲取能量，通過其活性中心的Cys殘基與泛素分子的C端形成高能硫酯鍵而激活泛素(形成E1-泛素復(fù)合體)； 然后E1-泛素復(fù)合體將活化的泛素遞

19、交給泛素結(jié)合酶E2； 最后由泛素連接酶E3家族中的一員(隨底物的不同而異)識別需要被泛素化的靶蛋白，募集底物和E2，并介導(dǎo)泛素從E2轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。蛋白分子泛素化反應(yīng) 當(dāng)?shù)谝粋€泛素分子被連上后，后續(xù)泛素分子連于前一泛素分子的賴氨酸殘基，逐漸形成一條多聚泛素鏈(至少4個泛素分子) 。 第39頁/共72頁 泛素化反應(yīng)包含一個E1，少數(shù)幾個E2和眾多E3。 參與細(xì)胞周期調(diào)控的泛素連接酶E3至少有兩類： SCF (skp1-cullin-F-box protein)復(fù)合物，負(fù)責(zé)將泛素連接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上。 APC/C (anaphase promoting complex /cycl

20、osome 負(fù)責(zé)將泛素連接到M期周期蛋白、雙體素和其它有絲分裂因子上。 在細(xì)胞周期中SCF始終具有活性，其作用底物蛋白質(zhì)必須先磷酸化后，才能被SCF識別并通過泛素化而降解。 APC/C活性在細(xì)胞周期各相中不斷發(fā)生變化。 第40頁/共72頁1 依賴SCF復(fù)合物的泛素化途徑 SCF(SKP/CUL/F-box)復(fù)合物主要參與G1/S期調(diào)控因子的泛素化降解，如Cyclin D、Cyclin E、p27Kip1等。 SCF復(fù)合物主要包含Skp1、Cullins、F-box 蛋白、ROC/Rbx/SAG環(huán)指蛋白等。其中 Cullins 為復(fù)合物各個組分提供作用平臺，環(huán)指蛋白識別E2，F(xiàn)-box蛋白是一大

21、類蛋白的統(tǒng)稱，其F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1結(jié)合，Skp1-F-box識別底物。 F-box是一個大約50個氨基酸的結(jié)構(gòu)域，由于周期素F具有與此相同的結(jié)構(gòu)域而命名。 Skp1：S-phase kinase-associated-protein 1 Cullin：淘汰素第41頁/共72頁第42頁/共72頁2 依賴APC/C的泛素化途徑 APC介導(dǎo)的泛素化途徑較為復(fù)雜，它與姊妹染色單體分離、紡錘絲解聚、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞脫離有絲分裂和細(xì)胞重新進入G1期都有著密切的關(guān)系。 APC是一個20S的多亞基泛素連接酶E3，定位于紡錘體微管和中心粒上，其作用底物都含有由9個氨基酸組成的保守區(qū)(cyclins的降解框

22、)。 第43頁/共72頁 與E2的結(jié)合部APC2、APC11和APC10 /Doc1，前兩個亞基被認(rèn)為是催化反應(yīng)的核心； TPR(34肽重復(fù)單位)亞基APC3、APC6、APC7、Apc13，參與最初的與銜接蛋白和Apc8的結(jié)合； 結(jié)構(gòu)性復(fù)合物Apc1、Apc4和Apc5。 、和三部分構(gòu)成了APC /C的穩(wěn)定核心； 共激活因子Cdc20、Cdh1和Ama1，APC /C復(fù)合物的活性調(diào)節(jié)和底物識別特異性主要依靠共激活因子。 APC /C可分成 4 個部分 APC/C核心和銜接蛋白、底物共同形成最終具有連續(xù)催化泛素連接反應(yīng)的APC-Cdc20 /Cdh1-底物復(fù)合物。第44頁/共72頁第45頁/共

23、72頁第46頁/共72頁二、細(xì)胞周期監(jiān)控機制第47頁/共72頁 細(xì)胞周期的運行，是在一系列稱為檢查點的嚴(yán)格檢控下進行的。 細(xì)胞周期檢查點(check point)是細(xì)胞周期中的一套保證DNA復(fù)制和染色體分配質(zhì)量的檢查機制。從功能上看，細(xì)胞周期有DNA損傷檢測點和時相次序檢測點兩大類。 細(xì)胞周期查驗點主要在4個時相點發(fā)揮作用： (1)G1/S期檢查點，在酵母中稱Start點，在哺乳動物中稱Restriction point； (2)S期檢查點； (3)G2/M期檢查點； (4)中/后期檢查點，又稱紡錘體組裝檢查點。 第48頁/共72頁 根據(jù)調(diào)控內(nèi)容，檢查點又可分： DNA損傷檢查點(DNA da

24、mage checkpoint) 負(fù)責(zé)查看DNA有無損傷；DNA復(fù)制檢查點(DNA replication checkpoint) 負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的進度；紡錘體組裝檢查點(spindleassembly checkpoint) 管理染色體的正確分配已否。第49頁/共72頁 G1/S檢查點；又稱限制點(restriction point)，控制細(xì)胞由G1進入S期，檢查的事件包括DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？ S期檢查點：DNA復(fù)制是否完成？ G2/M檢驗點：是決定細(xì)胞一分為二的控制點，相關(guān)的事件包括DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？ 中-后期檢查點： 又稱紡錘體組裝檢

25、查點，檢查染色體著絲粒有沒有正確連接到紡錘體上？任何一個著絲點沒有正確連接到紡錘體上，都會抑制APC的活性，引起細(xì)胞周期中斷。第50頁/共72頁細(xì)胞周期 4 個主要查驗點第51頁/共72頁（一） DNA損傷檢查調(diào)控 DNA損傷檢查由DNA損傷感應(yīng)機制、細(xì)胞生長停滯機制、DNA修復(fù)機制和細(xì)胞命運決定機制四個功能機制組成。第52頁/共72頁 細(xì)胞一旦發(fā)生DNA損傷或復(fù)制錯誤，DNA損傷首先啟動損傷感應(yīng)機制，將DNA損傷轉(zhuǎn)化成信號，由信號傳導(dǎo)通路傳給生長停滯機制，使細(xì)胞停止生長，進而啟動DNA修復(fù)機制，修復(fù)損傷的DNA。最后，如果DNA損傷得到完全修復(fù)，細(xì)胞周期可進入下一個時相，細(xì)胞周期仍可正常完成

26、，但倘若DNA損傷修復(fù)失敗，細(xì)胞凋亡機制將被啟動，損傷細(xì)胞進入凋亡，從而避免DNA損傷帶到子代細(xì)胞，維持了組織細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性。 第53頁/共72頁 在G1/S檢查點，DNA損傷引起p53依賴的細(xì)胞周期阻滯。 正常細(xì)胞內(nèi)p53的水平通常很低，DNA損傷刺激能引起p53的表達(dá)量和并被磷酸化而激活。P53又可引起多種基因轉(zhuǎn)錄，如p21等。 p21是一種CDKI，通過抑制CDKs導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，阻止損傷DNA的復(fù)制。第54頁/共72頁 Chk1和Chk2是G2期DNA損傷檢查點的核心分子。 Chk1(checkpoint kinase 1)引起Cdc25的Ser216磷酸化，通過抑制Cdc25的

27、活性而抑制 M-CDK的活性，阻止細(xì)胞進入 M 期。 Chk2 (checkpoint kinase 2)使P53被磷酸化而激活，激活后的 P53 作為轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致P21表達(dá)， P21抑制G1-S期CDK的活性，使細(xì)胞停止于G2期。第55頁/共72頁第56頁/共72頁（二）紡錘體組裝檢查點 在紡錘體裝配檢控(spindle assembly check point)過程中，Mad 2蛋白起著重要作用。 APC可以監(jiān)控微管是否與著絲點正確連接。Cdc20為APC有效的正調(diào)控因子，主要位于染色體動粒上，為姐妹染色單體分離所必需。 紡錘體裝配不完全，動粒不能被動粒微管捕捉，Mad 2則不能從動粒上消

28、失。Mad 2與cdc 20結(jié)合，有效地抑制Cdc 20的活性。當(dāng)紡錘體裝配完成以后，動粒全部被動粒微管捕捉，Mad 2從動粒上消失，解除了對Cdc 20的抑制作用，促使APC活化，從而完成M期向G1期過渡。 第57頁/共72頁（五）影響細(xì)胞增殖調(diào)控的因素 生長因子及其受體 癌基因與抑癌基因 信使系統(tǒng)第58頁/共72頁三、 細(xì)胞周期同期(步)化 細(xì)胞同期化(synchronization)是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步。自然同期化 有絲分裂選擇法 選擇同期化 細(xì)胞沉降分離法人工同期化 誘導(dǎo)同期化 DNA合成阻斷法 中期阻斷法第59頁/共72頁選擇同步化 有絲分裂選擇法 貼壁

29、細(xì)胞有絲分裂時細(xì)胞變圓，附著性低。 輕輕振蕩M期細(xì)胞脫落收集少量中期細(xì)胞(分裂細(xì)胞約占1%2% )。 優(yōu)點是操作簡單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害；缺點同期化細(xì)胞數(shù)量較少。 細(xì)胞離心分離法 不同時期的細(xì)胞體積、大小不同，因此可用離心的方法分離。 優(yōu)點是可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞；缺點是同步化程度較低。 第60頁/共72頁 饑餓法：減去培養(yǎng)液中某種(些)細(xì)胞必需的營養(yǎng)成分，過一定時間后再加入該成分以達(dá)到同期化目的。 誘導(dǎo)同步化 中期阻斷法：利用破壞微管的藥物將細(xì)胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙胺，后者毒性較小。缺點是可逆性較差。 第61頁/共72頁誘導(dǎo)同步化(續(xù)) DNA合成陰斷法：在

30、培養(yǎng)液中加入DNA合成抑制劑，可逆地抑制DNA的合成，將細(xì)胞群阻斷在S期或G1/S交界處。 5-氟脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度的脫氧核苷ADR、GDR和TDR，均可抑制DNA合成使細(xì)胞同步化。 優(yōu)點是同步化程度高(幾乎所有的細(xì)胞同步化)，適用于任何培養(yǎng)體系。缺點是產(chǎn)生非均衡生長。 第62頁/共72頁第63頁/共72頁 細(xì)胞周期調(diào)控是一個非常復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)節(jié)過程，有大量調(diào)節(jié)蛋白參與其中。 此過程的核心是一組細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)，而CDKs調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟是細(xì)胞周期檢查點。 細(xì)胞周期調(diào)控由信號傳導(dǎo)通路來實現(xiàn)，并決定細(xì)胞的分裂、分化和凋亡等過程。細(xì)胞周期調(diào)控第64頁/共72頁Cyclin A 家族 包括cyclin A1、 cyclin A2和cyclin A3 在S期開始表達(dá)，G2期達(dá)高峰，M期的中期降解。 與CDK2結(jié)合， 啟動DNA復(fù)制。Cyclin B 家族 含有2個成員cyclin B1和 cyclin B2。 在G2末期